CN104789566B

CN104789566B - 一种启动子及其应用

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Publication number: CN104789566B
Application number: CN201510203088.1A
Authority: CN
Inventors: 周哲敏; 刘中美; 崔文璟; 周丽; 葛春蕾
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2015-04-24
Filing date: 2015-04-24
Publication date: 2017-09-29
Anticipated expiration: 2035-04-24
Also published as: CN104789566A

Abstract

本发明公开了一种启动子及其应用，属于微生物基因工程领域。本发明所述方法中涉及的启动子P_{d(‑35～‑10)HpaII}基因是在启动子P_HpaII的基础上对其核心区进行串联改造而形成的。在新启动子P_{d(‑35～‑10)HpaII}控制转录下，重组纳豆激酶的纤溶活力高达200.83FU/ml。该方法高效安全，能够有效提高纳豆激酶的表达量，且为进一步研究启动子对异源基因表达的影响提供了理论基础。

Description

一种启动子及其应用

技术领域：

本发明涉及一种启动子及其应用，属于微生物基因工程领域。

背景技术：

纳豆激酶(Nattokinase，NK)是一种由纳豆菌或纳豆枯草杆菌产生的碱性丝氨酸蛋白酶，因具有特殊的溶血栓活性，既能预防也能治疗血管栓塞性疾病，与其它溶栓药物相比，具有安全性能好、无免疫原性、易被人体消化吸收、可静脉注射也可以口服、半衰期长、生产价格低廉等优点，极有可能成为新一代理想的预防和治疗栓塞的新型药物。但因纳豆激酶野生菌的产酶量低，严重限制了其发展，因此提高纳豆激酶的产酶量具有很好的研究价值。

枯草芽孢杆菌表达系统被认为是GRAS级的有机体，它没有明显的密码子偏好性，可将功能性蛋白分泌到培养基中，分离纯化工艺简单，目前被广泛用作异源蛋白表达的宿主菌。枯草芽孢杆菌应用的最为广泛的宿主菌是枯草168菌株以及枯草168系列的突变株(如WB600，WB700，WB800等)，本发明中选择使用的宿主菌是胞外蛋白酶活性较低的枯草芽孢杆菌WB800、WB600。

基因表达体系是一个复杂的过程，目前枯草表达系统还不是很成熟。近年来，科研工作者在枯草芽孢杆菌分泌表达外源蛋白方面取得很大的进展，已建立一个有效的外源蛋白枯草表达系统。而在载体系统的改造过程中，启动子调控元件起着重中之重的作用，选用强启动子可以使克隆基因高水平表达。因此，从启动子出发，设计强启动子元件，构建成熟高效的枯草表达系统，无论是在理论研究还是实际生产中都有十分重要的意义。

目前国内外研究学者大多采用对启动子的核心元件进行点突变。本发明采用的是对启动子自身的核心元件进行直接串联改造，既避免了启动子长度可能对转录造成的影响，又提高tRNA与启动子结合的能力，但并不是所有根据该方法设计的启动子的性能都会有所提高，这与启动子自身的核心元件序列密切相关。

本发明通过对启动子的改造，提高启动子活力，实现了外源蛋白的高效表达。本发明中原始启动子P_HpaII控制的纳豆激酶表达的纤溶酶活为120FU/ml，经改造过后新启动子P_{d(-35～-10)HpaII}控制下，纳豆激酶表达的纤溶酶活提高为200.83FU/ml。

发明内容：

本发明的目的是提供一种新型启动子以及利用该启动子在枯草芽孢杆菌WB600或WB800中高效表达重组纳豆激酶的方法。鉴于启动子是基因工程表达载体的重要元件，对外源基因表达水平有较大的影响，本发明以强启动子基因序列为基础，采用对启动子基因的核心元件进行串联的方式得到一个新的启动子，提高tRNA与启动子结合的能力，进而提高启动子活力。该方法构建的新的启动子有效的提高了异源蛋白在枯草芽孢杆菌中的表达量。

本发明的第一个目的是提供一种新型启动子。所述新的启动子是采用在原启动子的-10区后插入一段基因序列，该基因序列是原启动子的-35区上游10bp的碱基序列至-10区(包括-10区)序列的n次重复(n≥1)。

所述新型启动子，在本发明的一种实施方式中，是P_{d(-35～-10)HpaII}、P_{d(-35～-10)43}/P_{tri(-35～-10)43}、P_{d(-35～-10)gsiB}。分别是以P_HpaII、P₄₃、P_gsiB为初始启动子构建得到的。

所述新型启动子P_{d(-35～-10)HpaII}，在本发明的一种实施方式中，是在P_HpaII的-10区后插入了如SEQ ID NO.2所示序列。所述P_HpaII的基因序列的-35区(TTTATG)，-10区(TATACT)是σ^A-依赖型的。

所述新型启动子P_{d(-35～-10)43}，在本发明的一种实施方式中，是在P₄₃的-10区后插入了如SEQ ID NO.3所示序列。所述P₄₃的基因序列的-35区(GTGAAA)，-10区(TAAAAT)是σ^A-依赖型的。

所述新型启动子P_{tri(-35～-10)43}，在本发明的一种实施方式中，是在P₄₃的-10区后插入了如SEQ ID NO.4所示序列，该插入的序列是原启动子P₄₃的-35区上游10bp的碱基序列至-10区(包括-10区)序列的2次重复。

所述新型启动子P_{d(-35～-10)HpaII}、P_{d(-35～-10)43}、P_{tri(-35～-10)43}、P_{d(-35～-10)gsiB}，在本发明的一种实施方式中，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.7所示。

所述新型启动子P_{d(-35～-10)HpaII}、P_{d(-35～-10)43}、P_{tri(-35～-10)43}，在本发明的一种实施方式中，其序列分别包含两个核心元件、两个核心元件、三个核心元件。

本发明的第二个目的是提供含有所述新型启动子的质粒载体。

所述质粒载体，在本发明的一种实施方式中，可以是以下任意一种：pMA0911-wapA，pMA0911-yncM(短线后为信号肽)。

所述质粒载体，在本发明的一种实施方式中，为大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pMA0911-wapA。所述载体pMA0911-wapA的信号肽为wapA。

本发明的第三个目的是提供含有所述质粒载体的基因工程菌。

所述基因工程菌，在本发明的一种实施方式中，是枯草芽孢杆菌重组得到的重组枯草芽孢杆菌。

所述枯草芽孢杆菌，在本发明的一种实施方式中，可以是以下任意一种：枯草芽孢杆菌168，WB800，WB800，pWB980。

所述枯草芽孢杆菌，在本发明的一种实施方式中，为枯草芽孢杆菌蛋白酶缺陷型菌株WB800、WB600。

本发明的第四个目的是提供一种所述基因工程菌的构建方法。

所述构建方法，在本发明的一种实施方式中，是：首先将外源基因克隆到pMA0911质粒上，然后用本发明的新型启动子代替pMA0911质粒上原有的启动子，得到含有新型启动子和外源基因的重组表达质粒pMA0911P_{新型-外源基因}，然后将质粒pMA0911P_{新型-外源基因}转化到枯草芽孢杆菌，筛选即得到基因工程菌。

所述构建方法，在本发明的一种实施方式中，具体是：(1)目的基因的获取：根据Genbank所提供的纳豆激酶基因序列(Genbank登录号：S51909.1)设计引物pro-NK-F/pro-NK-R，以纳豆芽孢杆菌(B.natto)的基因组DNA为模板扩增pro-nk基因；(2)穿梭质粒的构建：将PCR产物pro-nk，经EcoR I和BamH I双酶切后，连接到用同样限制性内切酶双酶切的大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒pMA0911-wapA，连接获得穿梭质粒pMA0911P_HpaII-pro-NK；(3)根据P_HpaII启动子基因序列的核心元件-35区(TTTATG)和-10区(TATACT)设计引物P_{d(-35～-10)HpaII}-F/P_{d(-35～-10)HpaII}-R，以pMA0911P_HpaII-pro-NK质粒为模板进行全质粒PCR，得到重组表达质粒pMA0911P_{d(-35～-10)HpaII}-pro-NK；(4)将重组表达质粒转入枯草芽孢杆菌WB800中，即得基因工程菌。

本发明的第五个目的是提供一种利用所述新型启动子提高外源蛋白表达的方法。

所述外源蛋白，在本发明的一种实施方式中，可以是以下任意一种：纳豆激酶、氨肽酶。

所述纳豆激酶，在本发明的一种实施方式中，其基因序列为Genbank登录号：S51909.1所示的序列。

所述方法是：首先将外源基因克隆到表达质粒上，然后在原启动子的-10区后插入一段基因序列，该基因序列是原启动子的-35区上游10bp的碱基序列至-10区(包括-10区)序列的n次重复(n≥1)，形成一新的启动子，既而得到含有新启动子的重组质粒，将重组质粒转化到宿主菌中得到重组菌，然后利用重组菌表达外源蛋白。

所述宿主菌，在本发明的一种实施方式中，可以是枯草芽孢杆菌168，WB800，WB800或pWB980。

所述表达质粒，可以是pMA0911，但不仅仅限于pMA0911，经多次实验验证，本发明的新型启动子对于其他枯草穿梭载体同样适用。

所述表达，在本发明的一种实施方式中，是：将重组菌种子液按照OD₆₀₀终浓度为0.02-0.04的接种量接种至发酵培养基，与37℃震荡培养12-72h。

所述发酵培养基，在本发明的一种实施方式中，含有：1.1-1.3％胰蛋白胨，2.3-2.5％酵母提取物，0.3-0.5％甘油，17mM KH₂PO₄，72mM K₂HPO₄，另外添加0.02-0.04％氯化钙。

本发明的有益效果：采用核心元件串联的方式，得到了一系列可提高外源蛋白产量的新型启动子。该新型启动子P_HpaII可以在枯草芽孢杆菌中高效表达外源基因。新型启动子P_{d(-35～-10)HpaII}相对于P_HpaII启动子，能够使纳豆激酶酶活提高87.1％；P_{d(-35～-10)43}、P_{tri(-35～-10)43}相对于初始启动子，表达纳豆激酶的酶活分别提高了18.7％、38.8％。本发明的新型启动子，用于提高其他外源蛋白在枯草芽孢杆菌中的表达，比如氨肽酶，也具有较好的效果。

附图说明：

图1：启动子P_{d(-35～-10)HpaII}基因PCR验证；其中，M：DNA分子量标准；1：启动子P_{d(-35～-10)HpaII}基因PCR；

图2：重组纳豆激酶表达的SDS-PAGE电泳图；其中，M：蛋白分子量标准；1：WB800/pMA0911的发酵上清；2：WB800/pMA0911P_{d(-35～-10)HpaII}-pro-NK的发酵上清；

图3：琼脂糖－纤维蛋白平板法初步鉴定纳豆激酶纤溶活性；其中1：WB800/pMA0911的发酵上清；2：WB800/pMA0911P_{d(-35～-10)HpaII}-pro-NK的发酵上清；

图4：重组菌发酵上清液的酶活曲线；其中◇：WB800/pMA0911P_HpaII-pro-NK；□：WB800/pMA0911P_{d(-35～-10)HpaII}-pro-NK。

具体实施方式：

材料和检测方法

2×YT培养基(g·L^-1)：胰蛋白胨16，酵母提取物10，氯化钠5，用氢氧化钠调pH值至7.0。发酵培养基(g·L^-1)：胰蛋白胨12，酵母提取物24，甘油0.4％(V/V)，17mM KH₂PO₄，72mMK₂HPO₄，另外添加0.02％氯化钙。

枯草芽孢杆菌WB800转化方法：挑单菌落WB800接种至2mL的SPI培养基中，37℃摇床培养过夜；从过夜培养物中取100μL，接种至5mL SPI培养基中，37℃摇床培养4-5h后开始测OD₆₀₀。当OD₆₀₀约为1.0时，移取200μL菌液转接至2mL的SPII培养基中，于37℃、100r·min^-1摇床孵育1.5h；向管中加入20μL l00×EGTA(乙二醇双(α-氨基乙基醚)四乙酸)溶液，于37℃、100r·min^-1摇床中培养10min后分装500μL每l.5mL离心管；向管中加入经过测序验证正确的适量质粒，吹吸混匀放置于37℃、100r·min^-1的摇床中培养2h；培养结束，吸取菌液约200μL均匀涂相应的选择性平板，37℃过夜培养。

琼脂糖－纤维蛋白平板法初步鉴定纳豆激酶纤溶活性：制作琼脂糖－纤维蛋白平板法的原理是凝血酶激活纤维蛋白原生成纤维蛋白，进而形成由纤维蛋白组成的人工血栓平板。溶栓剂能够水解纤维蛋白，从而在人工血栓平板上形成水解圈，水解圈的面积与溶栓剂溶栓能力的大小成一定的线性关系，纳豆激酶的酶活参照以尿激酶标准品制作的标准曲线进行计算。运用此方法计算酶活时，酶活容易受到孵育时间、平板厚度、温度等影响，因而所测数据不能用来精确反应纳豆激酶酶活，但是可以用来初步表征是否具有溶栓活性。

紫外分光光度计法检测纳豆激酶纤溶活性：这是一种可以准确反应纳豆激酶纤溶活性的测定方法，它是由日本纳豆激酶协会建立(http://j-nattokinase.org/jnka_nk_english.html)，也是世界公认的纳豆激酶活性测定方法之一。本发明中纳豆激酶酶活的测定方法在该方法的基础上稍作改进。取1.4mL 50mmol·L^-1Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液与0.4mL 0.72％(w·v^-1)的纤维蛋白原溶液混匀后，37℃放置10min。向上述溶液中加入0.1mL凝血酶溶液(20U·mL^-1)充分混匀，37℃放置10min。再向上述反应体系中加入0.1mL稀释的酶液充分混匀，于37℃水浴中保温反应，分别在反应开始后的20min和40min时，分别混匀10s。在准确计时60min后加入2mL 0.2mol·L^-1的三氯乙酸终止反应，并在37℃水浴中再保温20min。上述反应液于15000r·min^-1下离心10min，测定离心上清液在275nm处的吸光值。一个酶活力单位(FU)定义为在37℃，pH 8.0的条件下，每分钟在275nm处吸光值变化0.01所需的酶量。

实施例1：pMA0911P_HpaII-pro-NK载体的构建

根据Genbank所提供的纳豆激酶基因序列(Genbank登录号：S51909.1)设计引物pro-NK-F/pro-NK-R，以纳豆芽孢杆菌(B.natto)的基因组DNA为模板扩增pro-nk基因，凝胶电泳条带约为1100bp，与纳豆激酶原基因大小一致；(2)将PCR产物pro-nk进行纯化，经EcoRI和BamH I双酶切后，连接到用同样限制性内切酶双酶切的大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒pMA0911-wapA上，连接获得重组表达质粒pMA0911P_HpaII-pro-NK，将该质粒转化大肠杆菌JM109，酶切验证后送测序，测序结果表明纳豆激酶原基因成功插入至载体pMA0911-wapA；(3)提取质粒转化WB800，构建大肠-枯草穿梭载体pMA0911P_HpaII-pro-NK。

表1本发明中用到的引物

实施例2：新的启动子基因序列的设计

启动子P_{d(-35～-10)HpaII}的基因序列的设计：

(1)根据P_HpaII启动子基因序列的核心元件-35区(TTTATG)和-10区(TATACT)设计引物P_{d(-35～-10)HpaII}-F/P_{d(-35～-10)HpaII}-R，以pMA0911P_HpaII-pro-NK质粒为模板进行全质粒PCR，将所得的PCR产物经DpnⅠ处理后转化大肠杆菌JM109中进行质粒扩增，涂布含有抗性的平板后37℃培养，挑取单菌落转至含有抗性的液体2×YT培养基培养；

(2)提取质粒用引物pMA-F/pMA-R进行PCR验证(图1)，图1中条带大小为364bp，与预测结果大小一致，同时进行DNA测序，DNA测序结果表明目的基因片段成功插入至原载体上P_HpaII基因序列的-10区(TATACT)后面，形成新的启动子P_{d(-35～-10)HpaII}(核苷酸序列如SEQID NO.1所示)，成功构建了新的大肠-枯草穿梭载体pMA0911P_{d(-35～-10)HpaII}-pro-NK。

基于类似的方法，成功构建了序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7所示的新型启动子P_{d(-35～-10)43}、P_{tri(-35～-10)43}、P_{d(-35～-10)gsiB}，以及含有该新型启动子的质粒pMA0911P_{d(-35～-10)43}-pro-NK、pMA0911P_{tri(-35～-10)43}-pro-NK、pMA0911P_{d(-35～-10)gsiB}-pro-NK。

实施例3：重组纳豆激酶发酵合成

重组菌的构建：将实施例2得到的序列正确的重组质粒转入枯草芽孢杆菌WB800中，在37℃，过夜静置培养后，挑取单菌落于10mL 2×YT种子培养基中，37℃进行培养；按终OD₆₀₀为0.02转接至含30mL TB培养基的250mL三角瓶中，200r/min，温度37℃，培养36小时。取发酵上清进行SDS-PAGE蛋白电泳(图2)。

如图3所示，获得28kDa左右的电泳条带，表明重组枯草芽孢杆菌成功分泌表达了纳豆激酶。纤维蛋白平板粗测重组纳豆激酶纤溶活性(图3)，原始菌株不能水解纤维蛋白，而重组菌株发酵上清液具有水解纤维蛋白的活性。紫外分光光度计法检测重组纳豆激酶纤溶活力(图4)，对比发现：用原始启动子P_HpaII在WB800中表达纳豆激酶，表达酶活水平为120FU/ml；经串联改造过后，新启动子P_{d(-35～-10)HpaII}控制的纳豆激酶表达的纤溶酶活提高了67.4％，达到200.83FU/ml。该表达水平同样显著高于Suwanmanon等(Suwanmanon K.etal.,CyTA-Journal of Food,2014,12(3):282-290)的报道。

重组质粒pMA0911P_HpaII-pro-NK转化到枯草芽孢杆菌WB600中，结果显示用初始启动子P_HpaII在WB600中表达纳豆激酶的酶活为115.1FU/ml，而新启动子P_{d(-35～-10)HpaII}的酶活为215.4FU/ml，提高了87.1％。

此外，将含有新启动子P_{d(-35～-10)43}、P_{tri(-35～-10)43}的质粒pMA0911P_{d(-35～-10)43}-pro-NK、pMA0911P_{tri(-35～-10)43}-pro-NK，分别转化到枯草芽孢杆菌WB800中，得到的重组菌的纳豆激酶的酶活，相对于含有P43启动子的重组菌，分别提高了18.7％、38.8％。但是通过改造的P_gsiB启动子，转化到枯草芽孢杆菌中，结果发现P_{d(-35～-10)gsiB}并不能提高纳豆激酶的酶活。

以上数据表明，通过对启动子核心区的串联改造，一定程度上提高了纳豆激酶的表达量，该方法为进一步研究启动子对异源基因表达的影响提供了基础。

实施例4：新型启动子P_{d(-35～-10)HpaII}用于氨肽酶的表达

首先将氨肽酶基因克隆到枯草穿梭质粒上，然后用本发明的新型启动子P_{d(-35～-10)HpaII}代替穿梭质粒上原有的启动子，得到含有新型启动子和氨肽酶基因的重组表达质粒，然后将重组表达质粒转化到枯草芽孢杆菌，筛选即得到基因工程菌。以含有P_HpaII启动子的同一穿梭质粒、同一基因、同一宿主构建的重组菌为对照，在同一条件下发酵生产氨肽酶，结果显示，P_{d(-35～-10)HpaII}比为改造前的启动子，酶活提高。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种启动子，其特征在于，所述启动子是以下任意一种：(1)在P_HpaII启动子的-10区后插入了如SEQ ID NO.2所示序列，(2)在P₄₃启动子的-10区后插入了如SEQ ID NO.3所示序列，(3)在P₄₃启动子的-10区后插入了如SEQ ID NO.4所示序列。

2.根据权利要求1所述的启动子，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列是SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示的序列。

3.含有权利要求1所述启动子的质粒载体。

4.含有权利要求3所述质粒载体的基因工程菌。

5.一种权利要求4所述基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述方法是：首先将外源基因克隆到pMA0911质粒上，然后用权利要求1的启动子代替pMA0911质粒上原有的启动子，得到含有新启动子的质粒pMA0911_{新启动子-外源基因}，然后将质粒pMA0911_{新启动子-外源基因}转化到枯草芽孢杆菌，筛选即得到基因工程菌。

6.一种提高外源蛋白表达的方法，其特征在于，所述方法是：首先将外源基因克隆到pMA0911质粒上，然后用权利要求1的启动子代替pMA0911质粒上原有的启动子，得到含有新启动子的重组表达质粒，然后将该重组表达质粒转化到枯草芽孢杆菌中进行表达。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述外源蛋白为纳豆激酶或氨肽酶。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述表达使用的培养基含有11-13g/L胰蛋白胨、23-25g/L酵母提取物、0.3-0.5％甘油、17mM KH₂PO₄、72mM K₂HPO₄，并添加了0.2-0.4g/L氯化钙。