CN109295086A - 高产纳豆激酶基因工程菌株的构建方法 - Google Patents

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周文科
田莉
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Abstract

本发明公开了一种高产纳豆激酶基因工程菌株的构建方法。以纳豆芽孢杆菌基因组为PCR扩增模板，利用PCR技术获得纳豆激酶基因片段；用BamH I和Sma I双酶切纳豆激酶的基因片段和质粒pHT43；纳豆激酶DNA片段与经过双酶切的质粒载体进行酶连接，得到重组载体pHT‑NK；将重组载体pHT‑NK转化枯草芽孢杆菌，筛选阳性重组子，即获得纳豆激酶转基因工程菌株。采用枯草芽孢杆菌缺陷型菌株为宿主细胞，构建纳豆激酶基因工程菌株，采用这样的菌株发酵不仅纳豆激酶产量高，而且发酵产物杂蛋白少，简化后期分离纯化工艺流程，节约生产成本。

Description

高产纳豆激酶基因工程菌株的构建方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种高产纳豆激酶基因工程菌株的构建方法。
背景技术
纳豆激酶(Nattokinase,NK)又名枯草杆菌蛋白酶NAT(subtilisinNAT),最早于1987年被日本学者Sumi等人从纳豆中分离得到。纳豆被传统地用作心脏和血管疾病的用药,同时,纳豆也被用作缓解疲劳和抗脚气病的药物。NK是在纳豆发酵过程中由食品级微生物纳豆枯草芽孢杆菌产生的蛋白酶,属于枯草杆菌蛋白酶类的丝氨酸蛋白酶。NK在体内和体外都具有很强的纤溶活性,它的纤溶活力是纤溶酶的4倍。NK不仅能直接降解纤维蛋白,还能提高血浆中组织纤溶酶原激活剂(t-PA)的量,从而导致纤溶酶原转变成具有活性的纤溶酶,提高体内纤溶酶的量与作用。此外,NK还可以通过切割失活t-PA的抑制剂PAI-1而提高纤溶活性。对NK溶解血栓的研究表明NK是一个可口服降解血栓的潜在自然用药。相比传统溶血栓药物,NK具有安全性好,可口服,成本低,强纤溶活力和药效长等特点,具有被开发成为功能性食品添加剂和预防或治疗心脑血管疾病药物的潜能。
野生型纳豆芽孢杆菌产纳豆激酶，不仅发酵时间长，酶活低，而且发酵产物蛋白种类繁多，后期分离纯化过程繁琐。因此,利用蛋白质工程技术对NK分子进行改造,提高其酶活力和稳定性为拓展NK在医药和商业领域的应用起着非常重要的作用。目前研究纳豆激酶多在原核生物中表达，由于在大肠杆菌表达系统中表达出没有活性的包涵体，且需对表达的包涵体蛋白进行复性。而枯草芽孢表达系统分泌的重组蛋白具有天然构象和生物活性，避免形成包涵体，没有明显的偏爱密码子，且拥有一套高效的分泌信号肽及分子伴侣系统，表达周期短，且蛋白质产率高。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种重要的原核表达宿主,具有很高的应用价值,其培养简单快速,具有较强的分泌蛋白质的能力、非致病性及良好的发酵基础和生产技术,被美国食品药物管理局(FDA)和中国农业部等部门批准为食品级安全菌株，是目前表达外源蛋白质的理想表达宿主,是微生物研究领域中的一种重要模式菌株。
发明内容
本发明目的在于提供一种高产纳豆激酶基因工程菌株的构建方法，并对该菌株的发酵条件进行优化。采用枯草芽孢杆菌缺陷型菌株为宿主细胞，构建纳豆激酶基因工程菌株，采用这样的菌株发酵不仅纳豆激酶产量高，而且发酵产物杂蛋白少，简化后期分离纯化工艺流程，节约生产成本。
为达到上述目的，采用技术方案如下：
高产纳豆激酶基因工程菌株的构建方法，包括以下步骤：
1)以纳豆芽孢杆菌基因组为PCR扩增模板，利用PCR技术获得纳豆激酶基因片段；
2)用BamH I和Sma I双酶切纳豆激酶的基因片段和质粒pHT43；
3)纳豆激酶DNA片段与经过双酶切的质粒载体进行酶连接，得到重组载体pHT-NK；
4)将重组载体pHT-NK转化枯草芽孢杆菌，筛选阳性重组子，即获得纳豆激酶转基因工程菌株。
按上述方案，所述枯草芽孢杆菌为缺陷型菌株WB800N，载体为穿梭质粒pHT43。
相对于现有技术，本发明有益效果如下：
本发明采用基因工程手段构建高产纳豆激酶基因工程菌株能够用于工业生产，且具有显著的效果。
该基因工程改造所得到的菌株能够获得高活性的纳豆激酶，其最高粗酶活达到2861IU/mL。
与当前野生菌发酵工艺相比，其发酵产物杂质少，简化了后期的分离纯化工艺，节约了生产成本。
纳豆激酶具有安全性好,可口服,成本低,强纤溶活力和药效长等特点，具有被开发成为功能性食品添加剂和预防或治疗心脑血管疾病药物的潜能，应用前景广泛。
附图说明
图1：纳豆激酶的基因片段PCR扩增图；
图2：使用纤维蛋白原平板检测重组菌株表达产物酶活性图；
图3：不同IPTG浓度对纳豆激酶酶活力大小的影响；
图4：不同表达温度对纳豆激酶酶活力大小的影响；
图5：不同表达时间对纳豆激酶酶活力大小的影响。
具体实施方式
以下实施例进一步阐释本发明的技术方案，但不作为对本发明保护范围的限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照生产商所建议的条件。实施例中使用的质粒以及试剂均可以通过公开的市售渠道获得。
实施例1
构建纳豆激酶基因工程菌株，包括以下步骤：
1)从GenBank上获得纳豆激酶基因片段序列，采用Clone Manager软件设计引物，并由上海生工生物工程公司合成。采用PCR技术扩增纳豆激酶基因片段；
2)将PCR扩增产物和载体质粒进行BamH I和Sma I双酶切处理，使用T4DNALigase连接，构建重组质粒；
3)使用电转化仪，将重组质粒分别转化至枯草芽孢杆菌中，在含抗生素平板中37℃过夜培养，并挑选阳性转化子进行测序验证。
4)酶活检测：以2％接种量将种子菌液分别接种于25mL新鲜液体培养基中，在30℃条件下，摇床培养至OD600nm在0.6-0.8之间，加入浓度为0.1mmol/L IPTG诱导发酵24h后，利用纤维蛋白原平板法分别检测其纳豆激酶活力大小。
结果见图1、图2所示，图1为纳豆激酶的基因片段PCR扩增图；图2为使用纤维蛋白原平板检测重组菌株表达产物酶活性图。
实施例2
重组菌株表达条件优化，包括以下步骤：
1)最佳IPTG浓度的确定
以2％接种量将重组菌株的种子菌液接种于25mL新鲜液体培养基中，在30℃的条件下，摇床培养至OD600nm在0.6-0.8之间，分别加入不同浓度(0.2mM，0.4mM，0.6mM，0.8mM，1.0mM，1.2mM，1.4mM和1.6mM)IPTG诱导表达24h后，检测其纳豆激酶酶活力大小。图3显示最佳IPTG浓度为1.0mM。
2)最佳表达温度的确定
以2％接种量将重组菌株的种子菌液接种于25mL新鲜液体培养基中，摇床培养至OD600nm在0.6-0.8时，加入1.0mM IPTG，分别在18℃，25℃，30℃，37℃和40℃中诱导表达。图4显示最佳表达温度为37℃。
3)最佳表达时间的确定
以2％接种量将重组菌株的种子菌液接种于25mL新鲜液体培养基中(，在37℃温度下，摇床培养至OD600nm在0.6-0.8时，加入1.0mM IPTG，诱导表达8小时，分别检测每小时的纳豆激酶酶活力大小。图5显示最佳表达时间为4小时。
实施例3
重组菌株发酵培养基优化，包括以下步骤：
1)最佳碳源和氮源的确定
为了确定最适碳源和氮源种类及质量浓度对纳豆激酶的影响，选用碳源有：葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、木糖、甘油、乳糖、纤维素、可溶性淀粉，质量浓度均为20g/L；氮源：大豆蛋白胨，蛋白胨，胰蛋白胨，酵母粉，NH4NO3、(NH4)2SO4、NH4Cl、NaNO3，质量浓度均为20g/L。氮源和碳源质量浓度梯度为0、10、20、30、40、50、60、70g/L。结果显示最适氮源为蛋白胨20g/L，最适碳源为葡萄糖20g/L。
2)谷氨酸钠和柠檬酸钠对纳豆激酶酶活力的影响
谷氨酸钠和柠檬酸钠的浓度梯度分别选为为0、10、20、30、40、50、60、70g/L。结果表明不同质量浓度的谷氨酸钠和柠檬酸钠对NK酶活性影响不明显。
3)金属离子对纳豆激酶酶活的影响
NaCl质量浓度梯度设为0、10、20、30、40、50、60、70g/L；MgSO4、CaCl2、K2HPO4、KH2PO4质量浓度梯度设为0、0.5、1.0、1.5、2.0g/L。结果显示，当NaCl质量浓度为10g/L时，NK酶表现出最高活性；不同质量浓度K2HPO4和KH2PO4对NK酶活性影响不明显；而MgSO4和CaCl2对NK酶活性影响显著，最佳MgSO4质量浓度为1g/L，最佳CaCl2质量浓度为0.5g/L。

Claims (2)

1.高产纳豆激酶基因工程菌株的构建方法，其特征在于包括以下步骤：
1)以纳豆芽孢杆菌基因组为PCR扩增模板，利用PCR技术获得纳豆激酶基因片段；
2)用BamH I和Sma I双酶切纳豆激酶的基因片段和质粒pHT43；
3)纳豆激酶DNA片段与经过双酶切的质粒载体进行酶连接，得到重组载体pHT-NK；
4)将重组载体pHT-NK转化枯草芽孢杆菌，筛选阳性重组子，即获得纳豆激酶转基因工程菌株。
2.如权利要求1所述高产纳豆激酶基因工程菌株的构建方法，其特征在于所述枯草芽孢杆菌为缺陷型菌株WB800N，载体为穿梭质粒pHT43。
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