CN116162556A - 一种高产黑曲霉脯氨酸内切蛋白酶的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高产黑曲霉脯氨酸内切蛋白酶的制备方法，属于生物技术领域。本发明提供了一种重组里氏木霉，所述重组里氏木霉表达了黑曲霉CBS513.88来源的脯氨酸内切蛋白酶。本发明所利用的黑曲霉来源的脯氨酸内切蛋白酶基因包含内含子，在里氏木霉系统中依旧能实现高产表达。里氏木霉重组表达的脯氨酸内切蛋白酶发酵液活力单位可达10585.2U/L，远远超出目前已报道的脯氨酸内切蛋白酶异源表达的最高酶活(2275.4U/L)，是其4.652倍。

Description

一种高产黑曲霉脯氨酸内切蛋白酶的制备方法
技术领域
本发明涉及一种高产黑曲霉脯氨酸内切蛋白酶的制备方法，属于生物技术领域。
背景技术
脯氨酸内切蛋白酶(Prolyl endopeptidase，PEP，EC 3.4.21.26)，也称脯氨酸内肽酶，属于丝氨酸肽酶S28家族，是一种能特异性将富含脯氨酸的蛋白切割成水溶性小分子短肽的一类蛋白。Walter等人于1971年首次在人类子宫匀浆中发现脯氨酸内切蛋白酶，随后发现该酶在植物、哺乳动物、真菌、细菌中广泛存在。由于该酶特殊的性质，赋予其多样化的生物学功能，在食品加工、医药以及相关生物技术开发方面具有广阔的应用前景。
啤酒在贮存期间经常出现浑浊性沉淀，严重影响产品质量、外观和销售。浑浊产生的主要原因是富含脯氨酸的浑浊度敏感蛋白和多酚不断结合，凝聚形成的大分子物质，浑浊的程度和脯氨酸含量直接相关。脯氨酸内切蛋白酶在降解酒液浑浊度、提高产品稳定性、延长保质期方面效果明显，且不影响产品的风味和口感。与传统的高耗能稳定剂硅胶相比，脯氨酸特异性内切蛋白酶更具成本效益。蛋白质水解物具有很好的营养价值，但都具有一定的苦味，尤其是酪蛋白水解物，脯氨酸内切蛋白酶的水解作用可有效去除苦味。另外，脯氨酸内切蛋白酶对小麦面筋具有一定程度的降解作用，被用于不含谷蛋白食品的生产加工，为谷蛋白不耐受人群提供了便利，同时为预防乳糜泻症的发生提供了方法。由于脯氨酸内切蛋白酶具有水解特异性，其还可作为一种分子生物学的工具酶，用于蛋白质序列鉴定、特异位点的酶切、肽段的修饰和加工等等。
脯氨酸内切蛋白酶在生物体内含量甚微，若直接从组织中分离提取，步骤繁琐低效，利用基因工程技术生产脯氨酸内切蛋白酶已成为主要趋势。不同来源的脯氨酸内切蛋白酶已尝试在大肠杆菌和毕赤酵母中进行了表达(表1)：
表1：不同宿主表达脯氨酸内切蛋白酶的相关研究
Figure BDA0004078493200000011
/>
Figure BDA0004078493200000021
其中，脑膜炎脓毒黄杆菌(Flavobacterium meningosepticum)、嗜水气假单胞菌(Aeromonas hydrophila)、点状产气单胞菌(Aeromonas punctata)、烟曲霉都属于致病菌，来源于这些菌的酶不能用于食品加工行业。黑曲霉是获得FDA认证的食品、药品安全菌，黑曲霉来源的脯氨酸内切蛋白酶备受关注，但是，目前该酶的生产仍存在产量低、成本高的问题。因此，非常有必要开发简单、高效、低成本的脯氨酸内切蛋白酶绿色生物制备技术。
里氏木霉(Trichoderma reesei)是美国FDA认证的安全生产菌株，蛋白表达分泌能力强，某些突变株的胞外蛋白分泌量可达到100g/L，且具有与高等哺乳动物相似的蛋白翻译后修饰系统，因此里氏木霉非常适合表达真核来源的食品、药品级蛋白。
发明内容
本发明提供了一种重组里氏木霉，所述重组里氏木霉表达了黑曲霉CBS513.88来源的脯氨酸内切蛋白酶。
在本发明的一种实施方式中，所述重组里氏木霉是以里氏木霉TU6为表达宿主；所述里氏木霉TU6为里氏木霉ATCC MYA-265。
在本发明的一种实施方式中，所述重组里氏木霉的表达载体为：以pEASY-blunt Tsimple质粒为出发质粒，按照dcl的启动子、dcl的信号肽、脯氨酸内切蛋白酶编码基因、cbh2终止子的顺序整合至出发质粒上；所述dcl的启动子和dcl的信号肽的序列分别如SEQID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述cbh2终止子的序列如SEQ ID NO.3所示。
在本发明的一种实施方式中，所述脯氨酸内切蛋白酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。
在本发明的一种实施方式中，编码所述脯氨酸内切蛋白酶的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示。
本发明还提供一种制备脯氨酸内切蛋白酶的方法，所述方法为，将所述的重组里氏木霉接种至种子培养基中进行培养后，过滤得到菌丝，将菌丝转移至诱导培养基中诱导培养，制备得到脯氨酸内切蛋白酶。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为，将所述重组里氏木霉接种至种子培养基中，在25～30℃，160～220rpm培养36h～48h，过滤得到菌丝。
在本发明的一种实施方式中，将筛选出来的阳性转化子孢子液按照0.4％(体积比)的接种量接种至种子培养基中，孢子浓度为107数量级，28℃，200rpm培养36h～48h后，无菌条件下利用纱布过滤菌丝，弃滤液，使用MM培养基冲洗菌丝。
在本发明的一种实施方式中，将菌丝转移至诱导培养基中进行诱导培养，培养条件为25～30℃，160～220rpm培养96h～144h。
在本发明的一种实施方式中，将菌丝转移接种至50ml诱导培养基中，28℃，200rpm诱导培养5天。
在本发明的一种实施方式中，所述种子培养基为添加了1～3％的葡萄糖的MM培养基；所述诱导培养基为添加了1～2％的微晶纤维素的MM培养基。
本发明还提供了一种重组里氏木霉在制备脯氨酸内切蛋白酶或含有制备脯氨酸内切蛋白酶的产品中的应用。
有益效果
(1)本发明所利用的黑曲霉来源的脯氨酸内切蛋白酶基因包含内含子，在里氏木霉系统中依旧能实现高产表达。里氏木霉重组表达的脯氨酸内切蛋白酶发酵液活力单位可达10585.2U/L，远远超出目前已报道的脯氨酸内切蛋白酶异源表达的最高酶活(2275.4U/L)，是其4.652倍。
(2)采用本发明的方法，原料简单易得，成本低，同时可将脯氨酸内切蛋白酶直接分泌到胞外，简化了分离纯化工艺，适合工业化生产。
附图说明
图1：pEASY-Pro的质粒图谱。
图2：阳性转化子的SDS-PAGE；其中，M为marker，Lane1～10分别为：Pro-1,Pro-2,Pro-3,Pro-4,Pro-5,Pro-6,Pro-7,Pro-8,Pro-9,Pro-10；Lane11为T.reesei TU6。
图3：阳性转化子Pro-3单孢的SDS-PAGE。
图4：不同转化子的发酵液酶活。
图5：发酵液活性炭脱色后的SDS-PAGE。
图6：里氏木霉表达的重组脯氨酸内切蛋白酶最适pH。
图7：里氏木霉表达的重组脯氨酸内切蛋白酶最适温度。
图8：里氏木霉表达的重组脯氨酸内切蛋白酶pH耐受性。
图9：里氏木霉表达的重组脯氨酸内切蛋白酶温度耐受性。
具体实施方式
下述实施例中所涉及的大肠杆菌Escherichia coli strain Trans1-T1(购自北京全式金生物技术有限公司)用作重组质粒的构建。里氏木霉TU-6菌株为尿嘧啶缺陷型菌株，购自：美国种质保藏中心(ATCC)，所述里氏木霉TU6为里氏木霉ATCC MYA-265，作为重组脯氨酸内切蛋白酶的表达宿主。
下述实施例是以质粒pEASY-blunt T simple(购自北京全式金生物技术有限公司)为骨架构建脯氨酸内切蛋白酶表达质粒pEASY-Pro。
下述实施例中所涉及的培养基如下：
PDA培养基：葡萄糖20g，马铃薯200g，琼脂粉20g，去离子水定容至1L，自然pH，115℃高压蒸汽灭菌20分钟。
里氏木霉的基础培养基(简称：MM)：(NH4)2SO4 0.5％(5g/L)，KH2PO4 1.5％，KH2PO41.5％，MgSO4 0.06％，CaCl2 0.06％，FeSO4·7H2O 0.0005％，MnSO4·H2O 0.00016％，ZnSO4·7H2O 0.00014％，CoCl2 0.0002％；调pH 5.3，115℃高压蒸汽灭菌20分钟。
里氏木霉菌株预培养的培养基(简称：MM+2％葡萄糖)：(NH4)2SO4 0.5％(5g/L)，KH2PO4 1.5％，MgSO4 0.06％，CaCl2 0.06％，FeSO4·7H2O 0.0005％，MnSO4·H2O0.00016％，ZnSO4·7H2O 0.00014％，CoCl2 0.0002％；葡萄糖20％，调pH 5.3，115℃高压蒸汽灭菌20分钟；氢氧化钠调pH 5.1～5.3，115℃高压蒸汽灭菌20分钟。
里氏木霉菌株的诱导培养基(简称：MM+1％微晶纤维素)：(NH4)2SO4 0.5％(5g/L)，KH2PO4 1.5％，MgSO4 0.06％，CaCl2 0.06％，FeSO4·7H2O 0.0005％，MnSO4·H2O0.00016％，ZnSO4·7H2O 0.00014％，CoCl2 0.0002％；Avicel(微晶纤维素；品牌：SIGMA，CAS号：9004-34-6)1％，氢氧化钠调pH 5.1.～5.3，115℃高压蒸汽灭菌20分钟。
LB培养基：蛋白胨1％(10g/L)，氯化钠1％，酵母提取物0.5％；自然pH，121℃高压蒸汽灭菌。
下述实施例中所涉及的试剂如下：
重组脯氨酸内切蛋白酶的测活试剂：
0.1M柠檬酸溶液：准确称取21.01g柠檬酸溶解在去离子水中，并定容至1000mL。
0.2M磷酸氢二钠：准确称取35.01g磷酸氢二钠溶解在去离子水中,并定容至1000mL。
pH 4.0缓冲溶液：将0.1M柠檬酸12.29ml与0.2M磷酸氢二钠7.71ml混匀，即为pH4.0的缓冲溶液。
4mM Z-Gly-Pro-pNA(N-卞氧羰基-甘氨酸-脯氨酸-硝基苯胺，分子量426.43，CAS号：65022-15-3，瑞士Bachem)，准确称取0.0171g Z-Gly-Pro-pNA加入4ml二恶烷(1,4-二氧六环，CAS号:123-91-1，阿拉丁出售)溶解，加入6ml pH 4.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液溶解后即为pH 5.0的底物溶液。
0.2M碳酸钠溶液：准确称取2.12g无水碳酸钠溶解在去离子水中，并定容至100mL，用于终止反应。
下述实施例中所涉及的里氏木霉的电转化如下：
(1)使用快速质粒小提试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)大量提取质粒pEASY-Pro，随后用真空离心浓缩仪将质粒pEASY-Pro浓缩至ug/ul级别，-20℃保存备用；
(2)取新鲜培养的培养皿(d＝35mm)上的里氏木霉TU6孢子(每个转化用2～3个培养皿)，使用1.1M山梨醇(Amresco)洗涤孢子制成孢子悬液，200目细胞筛(d＝50mm)过滤除去残余的菌丝；
(3)将孢子液移至无菌离心管中，3000g，4℃离心5min，弃去上清；
(4)用1.1M预冷的山梨醇洗涤孢子，3000g，4℃离心5min，弃去上清；
(5)重复步骤(4)两次；
(6)用100ul 1.1M预冷的山梨醇重悬孢子，冰上放置30min；
(7)打开电转仪，设置电转参数为：1.8kV，800Ω，25uF；
(8)将质粒pEASY-Pro加入到上述孢子液中(质粒样品的体积不得超过20ul)，轻轻混匀，随后将孢子液转移至预冷的电转杯中，进行电击；
(9)电击结束后立即加入900ul预冷的1.1M山梨醇溶液，轻轻混匀，冰上放置；
(10)用1.1M山梨醇溶液将10×YEPD稀释10倍，取5ml稀释后的YEPD(1×)加入到电转后的孢子液中，30℃孵育过夜；
(11)取适量孢子液涂布于MM+2％葡萄糖+1.1M山梨醇+0.1％TritonX-100平板上，28℃培养。
下述实施例中所涉及的检测方法如下：
脯氨酸内切蛋白酶的活性测定
(1)脯氨酸内切蛋白酶的活性定义：pH 5.0，37℃条件下每分钟从Z-Gly-Pro-pNA释放1μM pNA所用的酶量为一个酶活力单位，以U表示。
(3)脯氨酸内切蛋白酶的测活原理：脯氨酰内切蛋白酶能特异性水解多肽链中脯氨酸残基羧基端肽键的丝氨酸蛋白酶。以Z-Gly-Pro-pNA为底物时，它水解脯氨酸羧基端肽键，生成Z-Gly-Pro和硝基苯胺，而硝基苯胺在410nm下的吸光值与其浓度在一定成范围内成正比，通过测定硝基苯胺的生成量来检测脯氨酸内切蛋白酶的酶活力。
(3)活力测定步骤如下：
按顺序加入以下试剂，严格控制反应时间，反应条件如表2所示。
表2：反应条件
Figure BDA0004078493200000061
酶活力计算(单位：U/ml)：
Figure BDA0004078493200000062
其中，U-酶活力；N-稀释倍数；△A-试样与样品空白的吸光度差值；t-10min，反应时间；V-1.35ml，反应体系的体积；106-将mol换算为μmol；γ-8800cm/mol，硝基苯胺的消光系数；v-0.1ml，酶液添加量；β-1cm，比色杯的光程。
蛋白浓度测定方法
使用改良型Bradford蛋白浓度测定试剂盒(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)测蛋白浓度，以试剂盒内的牛血清蛋白(BSA)做标准曲线。
实施例1：黑曲霉脯氨酸内切蛋白酶表达载体的构建
黑曲霉基因组中脯氨酸内切蛋白酶基因(包括内含子)全长2044bp，含519个氨基酸。本发明的表达载体含有里氏木霉异源表达元件Dcl启动子、信号肽以及cbh2基因(cellulolytic enzyme cellobiohydrolase II，Trire2:72567)的终止子来构建表达元件，以pyr4(营养选择性标记基因乳清酸核苷_5’-单磷酸脱羧酶的基因)为筛选基因，即为dcl表达载体，命名为DCL质粒，所述dcl表达载体以pEASY-blunt T simple质粒为出发质粒，按照dcl的启动子、dcl的信号肽、外源蛋白编码基因、cbh2终止子的顺序整合至出发质粒上；所述dcl的启动子和dcl的信号肽的序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述cbh2终止子的序列如SEQ ID NO.3所示。所述dcl表达载体的构建方法记载于公开号为CN114875059 A的中国发明专利申请文本中。
(1)黑曲霉脯氨酸内切蛋白酶基因的扩增
以黑曲霉基因组(NCBI登录号为：AM270168.1)为模板，以包含21bp overlap(表3中用下划线标出的序列)的Pro-F、Pro-R为引物PCR扩增不含信号肽的黑曲霉脯氨酸内切蛋白酶基因片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)，所用酶为高保真Fast Pfu(购自北京全式金生物技术有限公司)，扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min 30s，30个循环；最后72℃扩展延伸10min。
表3：黑曲霉脯氨酸内切蛋白酶基因扩增用到的引物
Figure BDA0004078493200000071
(2)DCL质粒载体骨架的扩增
利用已制备的DCL质粒为模板，以pEASY-F、pEASY-R为引物(表4)PCR扩增载体片段，所用酶为高保真FastPfu(购自北京全式金生物技术有限公司)，扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸5min，30个循环；最后72℃扩展延伸10min。
表4：载体骨架片段扩增用到的引物
Figure BDA0004078493200000072
(3)黑曲霉脯氨酸内切蛋白酶表达载体的构建
利用上述黑曲霉脯氨酸内切蛋白酶基因片段两端与载体片段之间21bp的overlap，使用无缝拼接试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司)，将脯氨酸内切蛋白酶基因片段与载体骨架进行连接，完成黑曲霉脯氨酸内切蛋白酶表达载体，命名为pEASY-Pro的构建(如图1)。
实施例2：重组里氏木霉的制备
(1)将实施例1制备得到的pEASY-Pro电转化里氏木霉TU6中，制备得到转化子；
(2)待转化子长出后，通过PCR方法鉴定表达盒是否成功整合到基因组上。
挑取阳性转化子，转接至PDA平板上，培养7-9天，待孢子成熟后，使用1.1M山梨醇溶液洗涤孢子，并使用200目细胞筛(d＝50mm)过滤除去残余的菌丝，从而获得阳性转化子的孢子悬浮液；
将阳性转化子的孢子悬浮液按照0.4％(体积比)接种至50ml预培养的培养基(MM+2％葡萄糖)中，孢子浓度为107数量级，28℃，200rpm培养36h～48h后，无菌条件下利用纱布过滤菌丝，弃滤液；
使用MM培养基冲洗菌丝后，将菌丝转移接种至50ml诱导培养基(MM+1％微晶纤维素)中，28℃，200rpm诱导培养5天后，使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析蛋白表达情况，结果如图2所示，获得的10个阳性转化子，分别命名为Pro-1,Pro-2,Pro-3,Pro-4,Pro-5,Pro-6,Pro-7,Pro-8,Pro-9,Pro-10，由图2可知，阳性转化子Pro-3的蛋白表达量明显较高；其中，阳性转化子Pro-1～Pro-10的上下游同源臂序列分别如SEQIDNO.6，SEQ ID NO.7所示。
(3)对于成功表达目标蛋白的阳性转化子Pro-3，使用1.1M山梨醇将收集的孢子悬浮液梯度稀释10倍、102倍、103倍、104倍、105倍、106倍，并分别取100μl稀释104倍、105倍、106倍的孢子悬浮液涂布于PDA+0.1％TritonX-100平板(d＝9cm)上，28℃培养3～4天后，挑取边缘呈圆形的单一菌落，即为阳性转化子的单孢菌落，共获得2株比较纯的Pro-3单孢，分别命名为Pro-3-1，Pro-3-2；2株比较纯的Pro-3单孢的筛选标准为：孢子涂布平板后，生长出的菌落必须为单一的菌落，不同菌落的菌丝之间没有交联，其次，对筛选出的单菌落进行粗提基因组，以该基因组为模板，设计引物进行PCR鉴定dcl启动子、信号肽以及Pro基因、cbh2终止子等序列的完整，最后对这些单菌落进行发酵测活。实验验证，针对该方法得到的单孢菌株，发酵结果稳定，多次传代并不会出现菌株退化的情况。
(4)将筛选出来的阳性转化子孢子液Pro-3-1，Pro-3-2按照0.4％(体积比)接种至50ml预培养的培养基(MM+2％葡萄糖)中，孢子浓度为107数量级，28℃，200rpm培养36h～48h后，无菌条件下利用纱布过滤菌丝，弃滤液，使用MM培养基冲洗菌丝后，将菌丝转移接种至50ml诱导培养基(MM+1％微晶纤维素)中，28℃，200rpm诱导培养5天；离心收集发酵液，同时，以出发菌株里氏木霉TU6为对照，制备得到发酵液。
通过SDS-PAGE分析发酵144h时脯氨酸内切蛋白酶的表达情况，结果如图3所示。
将制备得到的发酵液根据酶活性测定方法，进行脯氨酸内切蛋白酶的活性测定，对照菌株TU6以及各阳性转化子的发酵液活性如图4所示。
结果显示，出发菌株TU6发酵液中脯氨酸内切蛋白酶的酶活极低，为：1.074U/mL，而Pro-3-1，Pro-3-2转化子发酵液酶活分别为：10.5852U/mL、9.9715U/mL；
对Pro-3-1以及Pro-3-2转化子在进行发酵时，均进行了三个生物学重复，该酶活数据范围为：9971.5U/L～10585.2U/L。
(5)利用活性炭DB3013(pH：中性)对转化子Pro-3-1的发酵液进行脱色纯化。
脱色过程为：使用50ml离心管装25ml发酵液，其中添加1.5％活性炭DB3013(0.375g)，无需调pH，40℃，200rpm振荡1h后，6000rpm，4℃离心30min。使用0.1M柠檬酸溶液调节上清液pH为3.0～4.0，冰浴1h后，8000rpm，4℃离心30min。接着，使用注射器吸取离心的上清液过滤膜(0.22μm无菌滤器，Millex)，收集滤液，即为纯酶，4℃保存备用。
纯化后的脯氨酸内切蛋白酶杂蛋白较少(如图5所示)。
结果显示，使用改良型Bradford蛋白浓度测定试剂盒测得纯化后的重组脯氨酸内切蛋白酶(转化子Pro-3-1)的浓度为68.817ug/ml。
阳性转化子Pro-3-1发酵纯化的重组脯氨酸内切蛋白酶的酶比活为153.816U/mg。
实施例3：黑曲霉脯氨酸内切蛋白酶酶学性质研究
将实施例2制备得到的，采用阳性转化子Pro-3-1表达得到的纯化蛋白(黑曲霉脯氨酸内切蛋白酶)进行酶学性质研究
(1)最适pH测定：
使用0.1M柠檬酸和0.2M磷酸氢二钠配制pH分别为3,4,5,6,7,8的缓冲液。按活性测定方法将测活过程中pH 4.0缓冲液分别更换为pH分别为3,4,5,6,7,8的缓冲液进行测活，每个pH条件设三个技术重复，结果取平均值，酶活最高点对应的pH即为该酶的最适反应pH，在不同pH条件下测定酶活，绘制相对酶活曲线，结果如图6所示。
结果显示，从图6可以看出该酶的最适反应pH为4.0，而且该酶在pH 3.0～5.0条件下活性都较好。
(2)最适温度测定：
将酶液分别在20℃,30℃,40℃,50℃,60℃,70℃,80℃条件下测定酶活，每个温度条件设三个技术重复，结果取平均值，酶活最高点对应的温度即为该酶的最适反应温度，分别在20℃,30℃,40℃,50℃,60℃,70℃,80℃条件下测定酶活，结果如图7所示。
结果显示，该酶的最适温度为60℃。
(3)pH稳定性测定：
使用0.1M KCl/HCl配制pH分别为1,2的溶液，使用0.1M柠檬酸/0.2M磷酸氢二钠配制pH分别为3,4,5,6,7,8的缓冲液，使用0.05M硼酸/NaOH配制pH分别为9,10,11的溶液。将酶液(已浓缩10倍)分别使用pH为1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11的溶液稀释10倍，冰浴1h后按测定酶活，每种处理设三个技术重复，结果取平均值，酶活下降点对应的pH即为该酶的可耐受pH，结果如图8所示。
结果显示，该酶在酸性条件下稳定性较好，由于该酶的等电点为4.89，当pH为5.0时，该酶的活性有所下降。当pH＞8.0时，活性开始丧失。
(4)热稳定性测定：
将酶液分别在4℃,20℃,30℃,40℃,50℃,60℃,70℃,80℃条件下保温1h后测定酶活，每个温度条件设三个技术重复，结果取平均值，酶活下降点对应的温度即为该酶的可耐受温度，结果如图9所示。
结果显示，该酶在不高于40℃条件下比较稳定，在50℃条件下保存1h后酶活丧失大约一半，温度60℃时彻底失活。
黑曲霉来源的脯氨酸内切蛋白酶基因在里氏木霉中实现了分泌表达，发酵液酶活力单位可达10585.2U/L，远远超出目前已报道的脯氨酸内切蛋白酶异源表达的最高酶活(2275.4U/L)；原料廉价易得，成本低，非常适合工业化生产。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种重组里氏木霉，其特征在于，所述重组里氏木霉表达了黑曲霉CBS513.88来源的脯氨酸内切蛋白酶。
2.根据权利要求1所述的重组里氏木霉，其特征在于，所述重组里氏木霉是以里氏木霉TU6为表达宿主。
3.根据权利要求2所述的重组里氏木霉，其特征在于，所述重组里氏木霉的表达载体为：以pEASY-blunt T simple质粒为出发质粒，按照dcl的启动子、dcl的信号肽、脯氨酸内切蛋白酶编码基因、cbh2终止子的顺序整合至出发质粒上；所述dcl的启动子和dcl的信号肽的序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述cbh2终止子的序列如SEQ ID NO.3所示。
4.根据权利要求3所述的重组里氏木霉，其特征在于，所述脯氨酸内切蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
5.根据权利要求4所述的重组里氏木霉，其特征在于，编码所述脯氨酸内切蛋白酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
6.一种制备脯氨酸内切蛋白酶的方法，其特征在于，所述方法为，将权利要求1～5任一所述的重组里氏木霉接种至种子培养基中进行培养后，过滤得到菌丝，将菌丝转移至诱导培养基中诱导培养，制备得到脯氨酸内切蛋白酶。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法为，将所述重组里氏木霉接种至种子培养基中，在25～30℃，160～220rpm培养36h～48h，过滤得到菌丝。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法为，将菌丝转移至诱导培养基中进行诱导培养，培养条件为25～30℃，160～220rpm培养96h～144h。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述种子培养基为添加了1～3％的葡萄糖的MM培养基；所述诱导培养基为添加了1～2％的微晶纤维素的MM培养基。
10.权利要求1～5任一所述的重组里氏木霉在制备脯氨酸内切蛋白酶或在制备含有脯氨酸内切蛋白酶的产品中的应用。
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