CN114164131A

CN114164131A - 耐盐芽孢杆菌及其用途

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Publication number: CN114164131A
Application number: CN202011535900.8A
Authority: CN
Inventors: 吴日帮; 周其洋; 张佳龙
Original assignee: Foshan Haitian Flavoring and Food Co Ltd; Foshan Haitian Gaoming Flavoring and Food Co Ltd
Current assignee: Foshan Haitian Flavoring and Food Co Ltd; Foshan Haitian Gaoming Flavoring and Food Co Ltd
Priority date: 2020-12-22
Filing date: 2020-12-22
Publication date: 2022-03-11
Anticipated expiration: 2040-12-22
Also published as: CN114164131B

Abstract

本发明涉及一株耐盐芽孢杆菌及其应用。该芽孢杆菌已于2020年11月4日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:61271，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼。本发明的有益效果为：本发明所提供的芽孢杆菌能够产耐盐蛋白酶，该耐盐蛋白酶能够在含盐量较高的酱油中保持较高的酶活力，从而实现沉淀蛋白的有效去除；并且相比于去除沉淀的传统技术，酱油品质更好，风味更佳。

Description

耐盐芽孢杆菌及其用途

技术领域

本发明涉及工业微生物技术领域，特别是涉及一株耐盐芽孢杆菌及其应用。

背景技术

酱油是一种以大豆和小麦为主要原料经过微生物发酵形成的具有独特香气与风味的调味品。在酱油后加工过程中，加热工序会产生大量沉淀物，沉降于发酵容器底部，一些未能有效沉降的杂质会进入到成品酱油中，在储藏和货架销售过程中产生浑浊、二次沉淀，不仅影响产品外观，还降低了蛋白质的利用率。因此，从技术上解决酱油浊度和沉淀物问题对提升酱油品质至关重要。

目前国内外已有研究人员对酱油的沉淀物进行了研究分析。孙鹏飞等人通过对酱油沉淀物进行鉴定与分析认为，沉淀物为大豆蛋白G4亚基碱性端B3与大豆球蛋白G1酸性端A1a在疏水作用下聚集沉淀形成(孙鹏飞,高献礼,闫爽,陆健.酱油二次沉淀蛋白质的分离、鉴定及氨基酸分析，食品工业技术，2014年05期，第87-90页)；张军涛使用硅胶对酱油进行澄清处理后发现酱油中特定分子量的蛋白质被吸附除去(张军涛.硅胶对酿造酱油澄清效果的研究.中国调味品,2014,39(06)，80-82)；闫爽等人分析了市售25种酱油理化特性与沉淀物形成的关系，证明总氮含量越高的酱油沉淀形成量越多。由此可知，蛋白质是参与沉淀物形成的重要因素之一。

传统上，在酱油生产过程中普遍采用膜过滤的方式除去酱油中的大分子物质与浑浊物，这些膜过滤的方式如微滤、超滤和纳滤等，但膜过滤系统购置与运行成本较高，而且会使得酱油风味与大分子营养物质丢失，对酱油品质带来不良的影响。

蛋白酶是一类催化肽键水解的酶分子，可以将大分子蛋白质水解成为小肽和氨基酸，广泛应用于制药、食品、皮革、纺织、化工等领域，利用蛋白酶定向酶解技术能够将蛋白质沉淀物酶解成可溶性小分子肽与氨基酸，不仅能够解决酱油存在浑浊、沉淀的问题，还能够提高蛋白质的利用率。但是，蛋白酶在盐浓度较高的体系中酶活力受到明显抑制，相应地酶制剂用量就升高，因此应用成本较高，这就限制了蛋白酶在澄清酱油中的应用。目前也有研究人员通过人工定向设计改造的方式提高酶的耐盐性，但需要使用基因工程手段对产酶菌株进行改造，不符合消费者对非转基因食品的需求。因此，从自然界或者人工环境中筛选天然的具有产耐盐蛋白酶能力的菌株成为获得食品级耐盐蛋白酶制剂的重要手段。

发明内容

基于此，本发明的主要目的是提供一株耐盐芽孢杆菌，该菌能够产耐盐蛋白酶。

具体技术方案包括：

一株芽孢杆菌，所述芽孢杆菌已于2020年11月4日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:61271，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼。

在其中一个实施例中，所述芽孢杆菌的16S rDNA序列如SEQ ID NO：3所示。

一种耐盐蛋白酶的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

以如上所述的芽孢杆菌为发酵菌株进行发酵，从所得发酵产物中提取所述耐盐蛋白酶。

在其中一个实施例中，提取所述耐盐蛋白酶的步骤包括：

1)对所述发酵产物进行离心，收集上层清液；

2)向所述上层清液中加入硫酸铵，静置，收集下层浊液，

3)对所述下层浊液进行离心，收集沉淀。

在其中一个实施例中，步骤1)中，离心所采用的条件包括：转速为11000rpm～13000rpm，温度为2℃～5℃，时长为8min～12min。

在其中一个实施例中，步骤2)中，静置所采用的条件包括：温度为2℃～5℃，时长为50min～70min。

在其中一个实施例中，步骤3)中，离心所采用的条件包括：转速为9000rpm～10000rpm，温度为2℃～5℃，时长为8min～12min。

在其中一个实施例中，发酵所采用的条件包括：发酵温度为36.5℃～37.5℃，发酵转速为180rpm～200rpm，发酵时长为72h～120h；或/和发酵所采用的培养基包含0.5wt％～1.5wt％黄豆粉、0.3wt％～0.8wt％麸皮、0.5wt％～1.5wt％玉米粉以及97wt％～98.7wt％水。

通过如上所述的方法制备的耐盐蛋白酶。

在其中一个实施例中，所述耐盐蛋白酶在盐浓度为15wt％时保持酶活力50％以上。

在其中一个实施例中，所述耐盐蛋白酶在pH 4.0～10.0范围内保持78％以上酶活力。

在其中一个实施例中，所述耐盐蛋白酶在在40℃～80℃范围内保持78％以上酶活力。

如上所述的耐盐蛋白酶在酱油制备中的用途。

一种酱油的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

用如上所述的耐盐蛋白酶对所述酱油中的沉淀物进行酶解。

在其中一个实施例中，酶解所使用的温度为40℃～80℃。

在其中一个实施例中，所述酱油为酱油原油。

本发明的有益效果为：

本发明所提供的芽孢杆菌能够产耐盐蛋白酶，该耐盐蛋白酶能够在含盐量较高的酱油中保持较高的酶活力，从而实现沉淀蛋白的有效去除；并且相比于去除沉淀的传统技术，酱油品质更好，风味更佳。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一个实施例中耐盐芽孢杆菌RD19菌株在LB平板培养基上的菌落形态图；

图2为本发明一个实施例中用100倍油镜观察的耐盐芽孢杆菌RD19菌株革兰氏染色后的形态图；

图3为本发明一个实施例中耐盐芽孢杆菌RD19胞外蛋白酶在不同NaCl浓度下的相对酶活力；

图4为本发明一个实施例中耐盐芽孢杆菌RD19胞外蛋白酶在不同pH体系中的相对酶活力；

图5为本发明一个实施例中耐盐芽孢杆菌RD19胞外蛋白酶在不同温度下的相对酶活力；

图6为本发明一个实施例中耐盐芽孢杆菌RD19胞外蛋白酶蛋白酶谱图及SDS-PAGE图；

图7为本发明一个实施例中耐盐芽孢杆菌RD19胞外蛋白酶酶解酱油沉淀物0、24h、48h以及蛋白酶提取液的SDS-PAGE图；

图8为本发明一个实施例中耐盐芽孢杆菌RD19胞外蛋白酶酶解含有沉淀物的酱油浊液1h、2h、6h后的清液以及传统过滤法去除沉淀后的清液的Sephadex G-15凝胶过滤层析分离图谱。

本发明提供的芽孢杆菌，命名为耐盐芽孢杆菌(Bacillus Halotolerans)RD90，该菌株已于2020年11月4日保藏于广东微生物菌种保藏中心，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No:61271；该菌株于2020年11月4日由保藏中心收到并登记入册，经保藏中心于2020年11月4日检测为存活菌株。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明实施例提供的耐盐芽孢杆菌，是从佛山市海天(高明)调味食品有限公司的制曲车间的米曲霉固态发酵豆曲中分离所得，经16S rDNA扩增产物测序证明为耐盐芽孢杆菌(Bacillus Halotolerans)。该耐盐芽孢杆菌的分离步骤如下：从佛山市海天(高明)调味食品有限公司的制曲车间中采集米曲霉固态发酵豆曲，经过75℃～85℃水浴锅密封加热筛选具有产芽孢能力的细菌，使用含1.5wt％～2.5wt％脱脂奶粉的牛奶平板进行稀释涂布分离培养，筛选透明圈直径与菌落比值较大的菌株即为产胞外蛋白酶能力较强的菌株，挑取筛选菌株至种子培养基进行种子液培养，然后将种子液接种到发酵培养基中进行摇瓶发酵即可获得粗酶液，根据《GB1886.174-2016食品安全国家标准食品添加剂食品工业用酶制剂》中的蛋白酶活力测定方法对筛选菌株粗酶液耐盐性进行复筛，在15％NaCl体系中酶活力保持50％以上的酶液即认定为具有耐盐性的蛋白酶，其对应产酶菌株为产耐盐蛋白酶菌株。本发明实施例提供的如上所述的产耐盐蛋白酶的耐盐芽孢杆菌，为开发用于酱油澄清工艺的耐盐蛋白酶制剂奠定基础。

本发明实施例提供的耐盐芽孢杆菌，在LB平板培养基上培养24h后菌落变得干燥粗糙无光泽，呈灰白色不透明，有明显褶皱。

本发明实施例提供的耐盐芽孢杆菌能够产耐盐蛋白酶，该耐盐蛋白酶在NaCl浓度为10wt％时，酶活力保持60％以上，NaCl浓度为15wt％时，酶活力保持50％以上。并且，该耐盐蛋白酶适应温度范围广，在40℃～80℃之间具有较高酶活力，最适反应温度为50℃。同时，该耐盐蛋白酶也能适应较宽的酸碱度，能在pH 4.0～10.0范围内保持较高的酶活力，最适pH为10.0。

在其中一个示例中，所述芽孢杆菌的16S rDNA序列如SEQ ID NO：3所示。

一种耐盐蛋白酶的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

在其中一个示例中，提取所述耐盐蛋白酶的步骤包括：

1)对所述发酵产物进行离心，收集上层清液；

2)向所述上层清液中加入硫酸铵，静置，收集下层浊液，

3)对所述下层浊液进行离心，收集沉淀。

在其中一个示例中，步骤1)中，离心所采用的条件包括：转速为11000rpm～13000rpm，温度为2℃～5℃，时长为8min～12min。

在其中一个示例中，步骤2)中，静置所采用的条件包括：温度为2℃～5℃，时长为50min～70min。

在其中一个示例中，步骤3)中，离心所采用的条件包括：转速为9000rpm～10000rpm，温度为2℃～5℃，时长为8min～12min。

在其中一个示例中，发酵所采用的条件包括：发酵温度为36.5℃～37.5℃，发酵转速为180rpm～200rpm，发酵时长为72h～120h；或/和发酵所采用的培养基包含0.5wt％～1.5wt％黄豆粉、0.3wt％～0.8wt％麸皮、0.5wt％～1.5wt％玉米粉以及97wt％～98.7wt％水。

可以理解的是，在发酵前，先挑取培养斜面或者平板单菌落，或者按照2.5wt％接种量取甘油管，将耐盐芽孢杆菌接种到种子培养基进行培养从而制备种子液，然而将所得种子液接种到发酵所采用的培养基中进行发酵。

本发明实施例制备培养平板的培养基采用固体LB培养基，所述固体LB培养基的配方包含水以及占所述固体LB培养基1wt％的胰蛋白胨、0.5wt％的酵母粉、1wt％的NaCl以及2wt％的琼脂粉，所述固体LB培养基的制备包括：按配方将各组分混合，15℃～121℃灭菌20min～30min。

本发明实施例所述的种子培养基采用液体LB培养基，所述液体LB培养基的配方包含水以及占所述液体LB培养基1wt％的胰蛋白胨、0.5wt％的酵母粉以及1wt％的NaCl，所述液体LB培养基的制备包括：按配方将各组分混合，115℃～121℃灭菌20min～30min。

在其中一个示例中，所述种子液的接种量是所述发酵液的1wt％～3wt％。

可以理解的是，基耐盐蛋白酶纯度的考虑，所述制备方法后续还可以包括去除杂质、纯化耐盐蛋白酶的步骤，纯化的方式不做特别限定，包括但不限于采用透析，例如采用分子截留量为14000Da的透析袋。

通过如上所述的方法制备的耐盐蛋白酶。

在其中一个示例中，所述耐盐蛋白酶在盐浓度为15wt％时保持酶活力50％以上。

在其中一个示例中，所述耐盐蛋白酶在pH4.0～10.0范围内保持78％以上酶活力。

在其中一个示例中，所述耐盐蛋白酶在在40℃～80℃范围内保持78％以上酶活力。

上述酶活力定义为在50℃条件下每分钟从酪蛋白水解生成1μg酪氨酸为1U。

如上所述的耐盐蛋白酶在酱油制备中的用途。

一种酱油的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

用如上所述的耐盐蛋白酶对所述酱油中的沉淀物进行酶解。

在其中一个示例中，酶解所使用的温度为40℃～80℃。

在其中一个示例中，所述酱油为酱油原油。

本发明实施例中，所述百分含量如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1、菌株筛选

1、产蛋白酶菌株分离纯化：

称取米曲霉固态发酵豆曲5g于50mL无菌离心管中，加入20mL无菌水后密封，用漩涡振荡器振荡2min，随后静置在80℃水浴锅中孵育20min，然后取出用自来水迅速冷却至室温；

取1mL冷却后的悬液，用无菌水逐级稀释到10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5倍浓度，吸取100μL 10^-5倍浓度的稀释液并均匀涂布于选择性平板培养基上，置于37℃培养箱中培养18h；其中，选择性平板培养基：脱脂奶粉2wt％、琼脂糖2wt％以及水96wt％，115℃灭菌20min；

挑选透明圈与菌落直径比值大的单菌落。

2、产酶发酵：

挑取步骤1中的单菌落接种于7mL种子培养基中，37℃、180rpm条件下培养12h，得到种子液；其中，种子培养基配方：胰蛋白胨1wt％、酵母粉0.5wt％、NaCl 1wt％，加水至100wt％，121℃灭菌20min；

然后以2wt％的接种量接种至发酵培养基中，37℃、180rpm条件下培养72h，收集发酵液，通过12000rpm 4℃低温高速离心10min，收集上清得到粗酶液；其中，发酵培养基配方：黄豆粉1wt％、麸皮0.5wt％、玉米粉1wt％，加水至100wt％，121℃灭菌20min。

3、蛋白酶耐盐性复筛：

将步骤2中所获得的粗酶液均等分成4管50mL酶液，并加入NaCl使得浓度分别达到0wt％、5wt％、10wt％和15wt％，分别配制含0wt％、5wt％、10wt％和15wt％NaCl的2wt％酪蛋白溶液。

将粗酶液与酪蛋白溶液放置在50℃水浴锅中预热5min，取5支10mL离心管，分别向其中4支离心管(样品管)加入不同盐浓度的酶液1mL以及1mL相同盐浓度的酪蛋白溶液，同时向另外一支离心管(空白管)加入1mL NaCl含量为0wt％的酶液、1mL NaCl含量为0wt％的酪蛋白溶液以及2mL 0.4mol/L的三氯乙酸，摇匀，静置在50℃水浴锅中，计时10min。

反应结束后，分别向四支样品管中加入2mL 0.4mol/L的三氯乙酸，摇匀终止反应，10000rpm离心5min得到上清液，取1mL上清液于试管中，加入5mL0.4mol/L的碳酸钠溶液，再加入1mL福林试剂，于40℃水浴锅中反应10min，使用10mm比色皿测定660nm吸光度。

酶活力定义为在50℃条件下每分钟从酪蛋白水解生成1μg酪氨酸为1U。

相对酶活力＝(样品组吸光度-空白组吸光度)/(0wt％NaCl样品组吸光度-空白组吸光度)×100％

应用上述筛选所得菌株发酵所得粗酶液进行耐盐性测试，结果请参表1和图3，表1为不同浓度NaCl对耐盐芽孢杆菌RD19所产粗酶液酶活力的影响，图3为本发明实施例耐盐芽孢杆菌RD19胞外蛋白酶在不同NaCl浓度下的相对酶活力。表1和图3结果显示耐盐芽孢杆菌RD19所产蛋白酶具有一定的耐盐性。

表1、耐盐芽孢杆菌RD19粗酶液耐盐性实验结果

NaCl浓度	0wt％	5wt％	10wt％	15wt％
					酶活力(U/mL)	287.14	255.94	175.03	148.29
相对酶活力	100％	89.13％	60.96％	51.64％

4、蛋白酶pH适应性测试：

将步骤2中所获得的粗酶液均等分成8管10mL酶液，并分别加入10mL pH值为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的缓冲液，缓冲液配制方法如下：

pH 3.0：0.2mol/L磷酸氢二钠4.11mL、0.1mol/L柠檬酸15.89mL；

pH 4.0：0.2mol/L磷酸氢二钠7.71mL、0.1mol/L柠檬酸12.29mL；

pH 5.0：0.2mol/L磷酸氢二钠10.30mL、0.1mol/L柠檬酸9.70mL；

pH 6.0：0.2mol/L磷酸氢二钠12.63mL、0.1mol/L柠檬酸7.37mL；

pH 7.0：0.2mol/L磷酸氢二钠16.47mL、0.1mol/L柠檬酸3.53mL；

pH 8.0：0.2mol/L磷酸氢二钠19.45mL、0.1mol/L柠檬酸0.55mL；

pH 9.0：0.2mol/L甘氨酸5mL、0.2mol/L氢氧化钠0.88mL、蒸馏水14.12mL；

pH 10.0：0.2mol/L甘氨酸5mL、0.2mol/L氢氧化钠3.2mL、蒸馏水11.8mL。

配制4wt％的酪蛋白溶液，然后用pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的缓冲液分别稀释至2wt％。

将对应pH值的粗酶液与酪蛋白溶液放置在50℃水浴锅中预热5min，取9支10mL离心管，分别向其中8支离心管(样品管)加入不同pH体系的酶液1mL以及1mL相同pH体系的酪蛋白溶液，同时向另外一支离心管(空白管)加入1mL pH7.0的酶液、1mL pH 7.0的2wt％酪蛋白溶液以及2mL 0.4mol/L的三氯乙酸，摇匀，静置在50℃水浴锅中，计时10min。

反应结束后，分别向8支样品管中加入2mL 0.4mol/L的三氯乙酸，摇匀终止反应，10000rpm离心5min得到上清液，取1mL上清液于试管中，加入5mL 0.4mol/L的碳酸钠溶液，再加入1mL福林试剂，于40℃水浴锅中反应10min，使用10mm比色皿测定660nm吸光度。

相对酶活力＝(样品组吸光度-空白组吸光度)/(酶活力最高的样品组吸光度-空白组吸光度)×100％

图4本发明实施例耐盐芽孢杆菌RD19胞外蛋白酶在不同pH体系中的相对酶活力。根据图4，该耐盐蛋白酶也能适应较宽的酸碱度，能在pH 4.0～10.0范围内保持较高的酶活力，最适pH为10.0。

5、蛋白酶温度适应性测试：

将步骤2中所获得的粗酶液均等分成6管10mL酶液，分别放置在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃水浴锅中预热30min，将2wt％酪蛋白溶液放置在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃水浴锅中预热5min，取7支10mL离心管，分别向其中6支离心管(样品管)加入不同温度预热的酶液1mL以及1mL相同预热温度的酪蛋白溶液，分别静置在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃水浴锅中，计时10min，同时向另外一支离心管(空白管)加入1mL 50℃预热的酶液、1mL 50℃预热的2wt％酪蛋白溶液以及2mL 0.4mol/L的三氯乙酸，摇匀，静置在50℃水浴锅中，计时10min。

反应结束后，分别向6支样品管中加入2mL 0.4mol/L的三氯乙酸，摇匀终止反应，10000rpm离心5min得到上清液，取1mL上清液于试管中，加入5mL 0.4mol/L的碳酸钠溶液，再加入1mL福林试剂，于40℃水浴锅中反应10min，使用10mm比色皿测定660nm吸光度。

图5本发明实施例耐盐芽孢杆菌RD19胞外蛋白酶在不同温度下的相对酶活力。根据图5，该耐盐蛋白酶适应温度范围广，在40℃～80℃之间具有较高酶活力，最适反应温度为50℃。

6、产耐盐蛋白酶菌株的鉴定：

(1)形态学：以上筛选的产耐盐蛋白酶的耐盐芽孢杆菌RD19，在LB平板培养基上培养24h后菌落变得干燥粗糙无光泽，呈灰白色不透明，有明显褶皱，挑取菌落时有拉丝现象，参见图1。细菌革兰氏染色呈阳性，在100倍油镜下观察，菌体呈短杆状，多以单个或两个菌体头尾相连的形式存在，参见附图2。

(2)分子生物学：提取获得的耐盐芽孢杆菌RD19细菌基因组DNA，并通过PCR扩增16S rDNA基因：

上游引物序列为27F(SEQ ID No.1)：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG，下游引物序列为1492R(SEQ ID No.2)：GGTTACCTTGTTACGACTT；

PCR反应体系：2×Taq PCR Mix 25μL、DNA模板1μL、10μmol/L 27F引物2μL、10μmol/L 1492R引物2μL、去离子水20μL；

PCR程序为94℃预变性4min，(94℃15s、56℃15s、72℃78s)30个循环，72℃7min。

扩增产物经琼脂糖凝胶电泳确定后送测序，产物长度为1140bp，碱基序列(EQ IDNo.3)如下所示：

CGGGGGGGGTGCTATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGCTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTCCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGAATGTTGGGGTTAGTCCGCATCGAAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGGCCCGCAATTCAGTTGGGTCACTCTAAGGTGACTGCCG

将测序获得序列通过NCBI BLAST的16S rDNA数据库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对证实该菌与耐盐芽孢杆菌(BacillusHalotolerans)相似性最高。

实施例2、蛋白酶的提取

1、产酶发酵：

用接种环从斜面上挑取耐盐芽孢杆菌RD19菌苔或从甘油冻存管中取500μL冻存菌液，接种到7mL种子培养基中，37℃、180rpm培养12h，得到种子液；

然后以2wt％的接种量接种至发酵培养基中，37℃、180rpm培养120h，收集发酵液，通过12000rpm、4℃低温高速离心10min，收集上清得到粗酶液。

种子培养基配方：胰蛋白胨1wt％、酵母粉0.5wt％、NaCl 1wt％，加水至100wt％，121℃灭菌20min。

发酵培养基配方：黄豆粉1wt％、麸皮0.5wt％、玉米粉1wt％，加水至100wt％，121℃灭菌20min。

2、蛋白酶提取：

取步骤1中的粗酶液与洁净烧杯中，分多次少量加入硫酸铵，并使用磁力搅拌器缓慢搅拌溶解，待粗酶液中出现大量絮状物时停止添加硫酸铵；

将粗酶液静置在4℃中絮凝60min，缓慢倒出上层清液，收集下层含有大量絮凝物的浊液；

使用冷冻离心机10000rpm 4℃离心10min收集沉淀，得到粗酶液中的蛋白质成分；

然后加入原粗酶液体积1/10的去离子水对沉淀进行重溶，用分子截留量为14000Da的透析袋去除残余盐分，得到蛋白酶提取液。

所得蛋白酶提取液进行SDS-PAGE电泳测定其相对分子量约为30kD，蛋白酶活性电泳酶谱分析结果显示蛋白酶提取液中存在一个明显的活性条带和2～3条较暗的活性条带，说明蛋白酶提取液中含有多种蛋白酶。蛋白酶提取液的SDS-PAGE电泳图及酶谱图见附图6。根据图6，耐盐芽孢杆菌RD19所产蛋白酶液中含有多种蛋白酶，相对于单一蛋白酶酶切位点更加丰富，更有利于蛋白质的进一步酶解。

实施例3、蛋白酶酶解酱油沉淀物

取发酵到期的酱油原油500mL，放置在90℃水浴锅中加热30min使蛋白质充分析出形成沉淀物，然后转移至50℃水浴锅中静置60min，使沉淀物充分沉降；

缓慢倒出上层清液，往剩余下层浊液加入等体积蒸馏水，并按照2000U/100mL的添加量加入蛋白酶提取液，搅拌均匀后静置在50℃恒温箱中进行酶解，分别取0h、24h、48h样品进行SDS-PAGE分析酶解样品中的蛋白质的降解情况。

结果证明，蛋白酶提取液能够在24h内将大部分蛋白质沉淀物进行降解。蛋白质沉淀降解的SDS-PAGE电泳图见附图7。

取酶解1h、2h、6h的浊液以及使用传统过滤法分离的清液，使用蛋白层析系统进行肽组分分析对比，层析条件如下：层析柱型号为Sephadex G-15(16mm×100mm)，流动相为蒸馏水，流速设置1mL/min，进样量为0.5mL，检测波长设置220nm，对分离组分进行积分计算峰面积，通过峰面积的大小差异比较不同肽组分的含量差异。

结果参考表2与附图8，使用酶解法处理沉淀物可以使得沉淀物中的蛋白质被进一步分解，获得比传统过滤法酱油更多的小分子肽，而各种小分子肽已被证实是酱油的重要的呈味组分，对提升酱油风味发挥较大的作用。

表2、酶解法与过滤法处理清液在肽分子组成上的差异

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 佛山市海天（高明）调味食品有限公司

佛山市海天调味食品股份有限公司

<120> 耐盐芽孢杆菌及其用途

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agagtttgat cmtggctcag 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggttaccttg ttacgactt 19

<210> 3

<211> 1140

<212> DNA

<213> 耐盐芽孢杆菌(Bacillus Halotolerans)

<400> 3

cggggggggt gctatacatg caagtcgagc ggacagatgg gagcttgctc cctgatgtta 60

gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat aactccggga 120

aaccggggct aataccggat gcttgtttga accgcatggt tcaaacataa aaggtggctt 180

cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg cattagctag ttggtgaggt aatggctcac 240

caaggcaacg atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg 300

gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg caatggacga aagtctgacg 360

gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga 420

acaagtaccg ttcgaatagg gcggtacctt gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa 480

ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg 540

taaagggctc gcaggcggtt ccttaagtct gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag 600

ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg 660

gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag gcgactctct ggtctgtaac 720

tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg aacaggatta gataccctgg tagtccacgc 780

cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg tttccgcccc ttagtgctgc agctaacgca 840

ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg 900

cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaaa ccttaccagg 960

tcttgacatc ctctgacaat cctagagata ggacgtcccc ttcggggggc agagtgacag 1020

gtggtgcatg ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagaatgt tggggttagt ccgcatcgaa 1080

gcgcaaccct tgatcttagt tggcccgcaa ttcagttggg tcactctaag gtgactgccg 1140

Claims

1.一株芽孢杆菌，其特征在于，所述芽孢杆菌已于2020年11月4日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:61271，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼。

2.根据权利要求1所述的芽孢杆菌，其特征在于，所述芽孢杆菌的16S rDNA序列如SEQID NO：3所示。

3.一种耐盐蛋白酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

以权利要求1或者2所述的芽孢杆菌为发酵菌株进行发酵，从所得发酵产物中提取所述耐盐蛋白酶。

4.根据权利要求3所述的耐盐蛋白酶的制备方法，其特征在于，从所得发酵产物中提取所述耐盐蛋白酶的步骤包括：

1)对所述发酵产物进行离心，收集上层清液；

2)向所述上层清液中加入硫酸铵，静置，收集下层浊液，

3)对所述下层浊液进行离心，收集沉淀。

5.根据权利要求4所述的耐盐蛋白酶的制备方法，其特征在于，步骤1)中，离心所采用的条件包括：转速为11000rpm～13000rpm，温度为2℃～5℃，时长为8min～12min；或/和

步骤2)中，静置所采用的条件包括：温度为2℃～5℃，时长为50min～70min；或/和

步骤3)中，离心所采用的条件包括：转速为9000rpm～10000rpm，温度为2℃～5℃，时长为8min～12min；或/和

发酵所采用的条件包括：发酵温度为36.5℃～37.5℃，发酵转速为180rpm～200rpm，发酵时长为72h～120h；或/和发酵所采用的培养基包含0.5wt％～1.5wt％黄豆粉、0.3wt％～0.8wt％麸皮、0.5wt％～1.5wt％玉米粉以及97wt％～98.7wt％水。

6.通过权利要求3至5任一项所述的方法制备的耐盐蛋白酶。

7.根据权利要求6所述的耐盐蛋白酶，其特征在于，所述耐盐蛋白酶在盐浓度为15wt％时保持酶活力50％以上；或/和

所述耐盐蛋白酶在pH 4.0～10.0范围内保持78％以上酶活力；或/和

所述耐盐蛋白酶在40℃～80℃范围内保持78％以上酶活力。

8.权利要求6或者7所述的耐盐蛋白酶在酱油制备中的用途。

9.一种酱油的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

用权利要求6或者7所述的耐盐蛋白酶对酱油中的沉淀物进行酶解。

10.根据权利要求9所述的酱油的制备方法，其特征在于，酶解所使用的温度为40℃～80℃；或/和

所述酱油为酱油原油。