CN110643549A - 一种来自海虾的枝芽孢杆菌及其生产方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种来自海虾的枝芽孢杆菌及其生产方法和应用，所述枝芽孢杆菌为革兰氏阳性杆状菌，在含有酪蛋白的固体培养基上的菌落特征：乳白色、不透明、表面光滑湿润、圆形、边缘齐整、中心稍突起、易挑取其菌落形态；所述枝芽孢杆菌的鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶反应呈阳性，接触酶、氧化酶、甲基红、尿激酶、V‑P、吲哚实验呈阴性。该枝芽孢杆菌可以在常温和高盐条件下生长，分泌蛋白酶，水解蛋白质产生风味物质，可以用于水产品发酵生产调味品，该枝芽孢杆菌在耐盐、耐碱、耐低温等特性更有利于工业化应用。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体为一种来自海虾的枝芽孢杆菌及其生产方法和应用。
背景技术
蛋白质主要是是生命的物质基础，是有机大分子，是构成细胞的基本有机物，是生命活动的主要承担者。蛋白酶是一种可以通过打断那些将氨基酸连结成多肽链的肽键，从而能够有效分解蛋白质，是生物体内的一类酵素(酶)。按其降解多肽的方式分成内肽酶和端肽酶两类。前者可把大分子量的多肽链从中间切断，形成分子量较小的朊和胨；后者又可分为羧肽酶和氨肽酶，它们分别从多肽的游离羧基末端或游离氨基末端逐一将肽链水解生成氨基酸，因而常被用于皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面。目前研究发现产蛋白酶的真菌主要是曲霉属，细菌主要芽孢杆菌属，这些产生菌主要为陆源微生物。与陆源酶相比，来自海洋微生物产生的酶在耐盐、耐碱、耐低温等特性更有利于工业化应用。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的缺陷，提供一种来自海虾的枝芽孢杆菌及其生产方法和应用，以解决上述背景技术提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种来自海虾的枝芽孢杆菌包括枝芽孢杆菌，所述枝芽孢杆菌为革兰氏阳性杆状菌，在含有酪蛋白的固体培养基上的菌落特征：乳白色、不透明、表面光滑湿润、圆形、边缘齐整、中心稍突起、易挑取其菌落形态；所述枝芽孢杆菌的鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶反应呈阳性，接触酶、氧化酶、甲基红、尿激酶、V-P、吲哚实验呈阴性。
作为本发明的一种优选技术方案，所述枝芽孢杆菌的生长温度范围为20-45℃，生长pH范围为6-10，生长的NaCl浓度为0％-14％，大小0.6-0.8μm×2.5-4.0μm。
一种来自海虾的枝芽孢杆菌的生产方法，其步骤如下：
首先：将枝芽孢杆菌接种到肉汤培养基中，180rpm，装液量50mL/250mL，30℃培养12h，得种子液；
其次：将种子液以2％的接种量接种于产酶培养基中，180rpm，30℃培养33h，12000rpm离心10min；
最后：取上清液即为蛋白酶粗酶，产酶培养基的组成为：葡萄糖0.3％，豌豆粉1％，酪蛋白2％，NaCl7％，pH8.0。
作为本发明的一种优选技术方案，所述蛋白酶粗酶的适宜作用温度为50℃，在30℃-55℃温度范围时催化活力高,产生的蛋白酶的热稳定性好，在45℃下保温5h后酶活能保持60％以上的活力；该酶在pH5.0-9.0的范围内稳定。
一种来自海虾的枝芽孢杆菌的应用，所述枝芽孢杆菌运用于水解蛋白，以3％的菌液量接种至20g的海洋麻虾原料中，25℃培养箱培养20d，将发酵的海洋麻虾8000rpm，30min离心，取上清；将上清经前处理，过0.22μm的滤膜过滤后，氨基酸分析仪进行发酵产物氨基酸组分分析。
作为本发明的一种优选技术方案，对海虾蛋白的水解作用步骤如下：向经过灭菌处理的100mL海虾匀浆液中加入5mL粗酶液，以不加粗酶液酶解的样品为空白；于恒温振荡摇床中振荡酶解1-21h；酶解结束后，将酶解产物置于沸水中15min灭酶，冷却后8000rpm离心30min，收集上清液即为酶解液，采用氨基酸自动分析仪测定酶解液中游离氨基酸，同时设置空白对照。
本发明的有益效果是：该枝芽孢杆菌可以在常温和高盐条件下生长，分泌蛋白酶，水解蛋白质产生风味物质，可以用于水产品发酵生产调味品，该枝芽孢杆菌在耐盐、耐碱、耐低温等特性更有利于工业化应用。
附图说明
图1为菌株ST扫描电镜照片形态图；
图2为菌株ST在初筛平板上形成的透明圈；
图3为菌株ST系统进化树；
图4为温度对菌株ST生长的影响；
图5为NaCl浓度对菌株ST生长的影响；
图6为pH对菌株ST生长的影响；
图7为发酵时间时间对产酶的影响；
图8为温度对产酶的影响；
图9为培养基pH对产酶的影响；
图10为装液量对产酶的影响；
图11为碳源对产酶的影响
图12为氮源对产酶的影响
图13为诱导剂对产酶的影响；
图14为温度对酶活性的影响；
图15为温度对酶热稳定性的影响；
图16为pH对酶活性的影响图；
图17为pH对酶稳定性的影响图；
图18为菌株ST发酵产物氨基酸的组成。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易被本领域人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
实施例：本发明提供一种技术方案：一种来自海虾的枝芽孢杆菌包括枝芽孢杆菌，所述枝芽孢杆菌为革兰氏阳性杆状菌，在含有酪蛋白的固体培养基上的菌落特征：乳白色、不透明、表面光滑湿润、圆形、边缘齐整、中心稍突起、易挑取其菌落形态；所述枝芽孢杆菌的鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶反应呈阳性，接触酶、氧化酶、甲基红、尿激酶、V-P、吲哚实验呈阴性；所述枝芽孢杆菌的生长温度范围为20-45℃，生长pH范围为6-10，生长的NaCl浓度为0％-14％，大小0.6-0.8μm×2.5-4.0μm。
来自海虾的枝芽孢杆菌的生产方法，其步骤如下：
首先：将枝芽孢杆菌接种到肉汤培养基中，180rpm，装液量50mL/250mL，30℃培养12h，得种子液；
其次：将种子液以2％的接种量接种于产酶培养基中，180rpm，30℃培养33h，12000rpm离心10min；
最后：取上清液即为蛋白酶粗酶，产酶培养基的组成为：葡萄糖0.3％，豌豆粉1％，酪蛋白2％，NaCl7％，pH8.0。
所述蛋白酶粗酶的适宜作用温度为50℃，在30℃-55℃温度范围时催化活力高,产生的蛋白酶的热稳定性好，在45℃下保温5h后酶活能保持60％以上的活力；该酶在pH5.0-9.0的范围内稳定。
所述枝芽孢杆菌运用于水解蛋白，以3％的菌液量接种至20g的海洋麻虾原料中，25℃培养箱培养20d，将发酵的海洋麻虾8000rpm，30min离心，取上清；将上清经前处理，过0.22μm的滤膜过滤后，氨基酸分析仪进行发酵产物氨基酸组分分析。
对海虾蛋白的水解作用步骤如下：向经过灭菌处理的100mL海虾匀浆液中加入5mL粗酶液，以不加粗酶液酶解的样品为空白；于恒温振荡摇床中振荡酶解1-21h；酶解结束后，将酶解产物置于沸水中15min灭酶，冷却后8000rpm离心30min，收集上清液即为酶解液，采用氨基酸自动分析仪测定酶解液中游离氨基酸，同时设置空白对照。
本发明中涉及的培养基：
肉汤培养基：牛肉浸粉0.3％，蛋白胨1％，NaCl 7％，蒸馏水配制，pH 8.0。
肉汤固体培养基：牛肉浸粉0.3％，蛋白胨1％，NaCl 7％，琼脂2％，蒸馏水配制，pH8.0；
产酶培养基：牛肉浸粉0.3％，蛋白胨1％，酪蛋白2％，NaCl 7％，蒸馏水配制，pH8.0；
筛选培养基：牛肉浸粉0.3％，蛋白胨1％，酪蛋白2％，NaCl 7％，琼脂2％，蒸馏水配制，pH 8.0；
菌株的筛选方法：称取1g的虾酱，加入到20mL肉汤培养基中进行富集培养，25℃，180rpm摇床培养24h。稍等沉淀，吸取上清100μL涂布于酪蛋白固体培养基平板上，平板倒置放于25℃培养箱培养，观察菌落生长及产透明圈情况。挑取产透明圈的菌落在肉汤固体平板上进行分离培养，分离得到单菌落后，观察菌落周围是否出现透明圈。挑取有透明圈的单菌落菌株接入产酶培养基，25℃、180rpm培养2d，12000rpm离心10min取上清液测定酶活力大小。选出透明圈较大和酶活力较高的菌株。
本发明菌株ST的形态特征与生理生化特征。
形态特征：菌株ST为革兰氏阳性杆状菌，大小为0.6-0.8μm×2.5-4.0μm(见图1)；菌株ST无芽孢，不能运动，在肉汤固体培养基中培养48h后，菌落呈乳白色，不透明，表面光滑湿润，圆形，边缘齐整，中心稍突起，易挑取。在含有酪蛋白的初筛培养基中，能够产生透明圈(见图2)。
生理生化特征：该菌株鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶反应呈阳性，接触酶、氧化酶、甲基红、尿激酶、V-P、吲哚实验呈阴性，不能水解淀粉和油脂，不能液化明胶、不能利用葡蔔糖、纤维二糖、麦芽糖、阿拉伯糖和蔗糖，部分生理生化结果见表1。
表1菌株ST生理生化特性
注：“+”：阳性；“-”：阴性
菌株ST的分子生物学鉴定：利用基因组提取试剂盒提取菌株ST的基因组，进行16SrDNA的扩增。PCR通用引物为：27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，反应体系为：PCR mix(20μL)，上下游引物(各1μL)，DNA模板4μL。反应程序：94℃变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，34个循环；72℃终延伸5min。将PCR产物电泳纯化回收构建克隆载体，选阳性克隆子提取质粒送至上海生工测序，将测得序列互补反向拼接，获得1529bp的碱基片段序列。所得的序列上传GenBank数据库，通过16S rDNA序列同源性比较，可以初步确定改菌株为枝芽孢杆菌属。将亲缘关系较近的菌株16S rDNA运用MEGA软件进行多重比较，用中邻接法建系统进化树，从进化树表明菌株ST与virgibacillus halodenitrificans亲缘关系最接近，参见图3。
本发明菌株ST的生长特性：本发明提供的菌株ST，对其生长特性进行了细致的研究，基本摸清不同条件下该菌株的生长情况。
种子液的制备：将菌株ST斜面种子接种到肉汤培养基中，装液量50mL/250mL，25℃、180rpm培养12h。
温度对菌株ST生长的影响：将种子液以2％接种量于肉汤培养基中，pH 8.0，转速180rpm，装液量50mL/250mL，分别在不同温度下培养12h，选择在600nm波长下测定OD值，该菌株在0℃下不生长，该菌株生长温度范围为20-45℃，最适生长温度为30℃，见图4。
NaCl对菌株ST生长的影响：按照上述方法制备种子液，在肉汤培养基中加入NaCl，使之为0％-15％的NaCl，在30℃培养12h，测定细胞浓度，生长的NaCl浓度为0％-14％，没有NaCl也能生长，最适生长NaCl浓度为7％，见图5。
3.4pH对菌株ST生长的影响：
在肉汤培养基中加入终浓度为10mM的不同pH的缓冲液(MES、PIPES、HEPES、NaOH)，使培养基pH分别为5.0-11.0之间，再加入浓度为7％的NaCl，30℃培养12h，测定细胞浓度，生长pH范围为6.0-10.0，最适生长pH为8.0，见图6。四、菌株ST产蛋白酶的方法。
发酵时间对菌株ST产酶的影响：将菌株ST发酵42h且每隔3h取样测酶活力，结果表明33h为产酶高峰，在12-33h菌株随着发酵时间延长产酶逐渐升高，在33h以后菌株随着发酵时间延长产酶逐渐降低，结果如图7所示。
发酵温度对菌株ST产酶影响：将种子培养液接种至发酵培养基，于15-50℃培养33h后分别测酶液的活力，结果见图8。菌株ST最佳产酶温度为30℃，低于20℃或高于40℃，产酶量均有大幅度下降。
培养基初始pH对菌株ST产酶的影响：将种子培养液接种至不同初始pH的发酵培养基，于30℃培养33h后分别测酶液的活力。初始pH调节范围为5-11。培养基初始pH对产酶的研究结果表明，培养33h，该菌株产酶的最适初始pH为7.0。随着pH的升高和下降，菌株的产酶均受到较大影响，低于5.5或高于10，产酶量均有大幅度下降，见图9。
装液量对菌株ST产酶的影响：将种子培养液接种至装液量为10-90mL/250mL的发酵培养基，于30℃180rpm摇床中培养33h后分别测酶液的活力。通过控制锥形瓶中培养基的体积来控制发酵液的溶氧，进而研究其对菌株产酶的影响，图10显示最适装液量为30mL/250mL，而装液量的增加对产酶影响较大。
碳氮源对菌株ST产酶的影响：0.3％的碳源(麦芽糖、蔗糖、乳糖、马铃薯淀粉、木薯淀粉、葡萄糖、糊精、麸皮)来替换发酵培养基中的牛肉浸粉，接种后在30℃摇床培养33h后分别测酶液的活力，结果发现，葡萄糖和蔗糖作为培养基碳源可促进产蛋白酶，见图11。将0.3％的葡萄糖作为碳源，将1％的氮源(鱼粉蛋白胨、硝酸钠、豆粕、花生粕、尿素、氯化铵、硫酸铵、酵母粉、豌豆粉、牛肉粉)用于替换发酵培养基中的蛋白胨，接种后在30℃摇床培养33h后分别测酶液的活力，结果发现，豌豆粉和氯化铵作为氮源时有利于产酶，见图12，选用1％豌豆粉作为产酶培养基的碳氮源。
不同诱导剂浓度对产酶的影响：将干酪素作为产酶诱导剂，将不同浓度的干酪素加入发酵培养基中，接种培养后分别测酶液的活力。随着诱导剂浓度增大产酶逐渐增加，到达最佳浓度后缓慢下降。如图13所示，2％的干酪素为最佳产蛋白酶诱导剂浓度，超过2％时酶活力下降，不添加诱导剂时酶活力很低约12％左右。
菌株ST蛋白酶的性质；粗酶液的制备：将枝芽孢杆菌ST菌株接种到肉汤培养基中，转数180rpm，装液量30mL/250mL，培养12h，将种子液接种至产酶培养基中，180rpm，30℃培养33h后，将酶液12000rpm离心10min，收集上清液备用。
酶作用温度对酶活性的影响：将蛋白酶置于不同温度下与底物发生反应，测定酶活力，结果见图14，酶的最适作用温度为50℃，在30℃-55℃温度范围时有较高的催化活力。
酶的热稳定性：取适量酶液置于不同温度(30℃、40℃、45℃、50℃)下保温5h，每隔1h取一组样品，迅速冷却置于4℃冰箱保存，待保温结束后统一标准条件下测定残余酶活力，以未处理酶液的酶活力设为100％，结果见图15，在温度30℃稳定性最好，在45℃下保温5h后仍具有60％以上的酶活力，在50℃下保温1h后仍具有50％以上的酶活力。
酶的作用pH对酶活性的影响：将酶液与在不同pH的2％的酪蛋白溶液中在50℃下进行酶活力的测定，不同pH的缓冲液为：50mM乙酸钠缓冲液(pH4.0-6.0)、50mM磷酸钠缓冲液(pH 6.0-7.5)和50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5-9.0)。结果见图16，该酶液的最适作用pH为6.0。
酶的pH稳定性：将适当酶液与不同pH的缓冲液(按照5.4中的缓冲液)混合，在25℃水浴锅中保温1h取出测酶活，将未处理酶液的酶活设为100％。结果见图17，结果表明在25℃保温1h后，蛋白的酶活力在pH5.0-8.0范围内稳定，残余酶活力保持在80％以上，在pH4.0时有60％的残余酶活。
5.6金属离子、化学试剂对酶的作用：
金属离子与酶液混合，使其终浓度达到10mM和50mM，然后在30℃，处理30min后，测定酶活力，结果见表2，结果发现Ba2+、NH4 +、Ca2+、Mg2+、K+、Co2+、Mn2+、Si2+和Na2+对蛋白酶有一定的的激活作用，而Cu2+、Fe3+、Zn2+、Li+、Cd2+能较大程度地抑制酶活性。化学试剂甲醇和二甲基亚砜对蛋白酶几乎没有影响，结果表3所示。
表2金属离子对蛋白酶活性的影响
表3化学试剂对蛋白酶活性的影响
菌株ST蛋白酶底物特异性：将不同底物(酪蛋白、脱脂牛奶、牛血清白蛋白、明胶、血红蛋白、偶氮酪蛋白)于50mM乙酸-乙酸钠缓冲液(pH6.0)中，在标准条件下测量酶活力，结果如表4，菌株ST蛋白酶对酪蛋白和脱脂牛奶的水解能力较好(分别为100％和65％)，其次是明胶、BSA、偶氮酪蛋白和血红素，分别为33％、27％、15％和8％。
表4菌株ST蛋白酶底物特异性
蛋白酶活的测定：
①将250μL酶液与250μL 2％的酪蛋白溶液(50mM，pH 6.0乙酸钠缓冲液配制)50℃水浴10min后，福林酚法测定酪氨酸含量。
②酶活力单位定义(U/mL)：在一定pH值和温度条件下，每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸定义为一个蛋白酶活力单位。
菌株ST蛋白酶的应用
菌株ST发酵海虾的氨基酸组成：本发明方法所产蛋白酶主要用于食品工业。将蛋白酶水解的产物进行氨基酸分析测定(图18)。对照标准品发现，酶水解产物后可见产物主要为Glu,Asp,Gly,Leu and Lys，大多为呈味物质的疏水性氨基酸，在食品工业中有一定的应用价值。
菌株ST蛋白酶的酶解特异性：氨基酸的释放速率可以预测一定条件下的裂解位点，从而直观地反映蛋白酶的酶学特异性。V.halodenitrificans ST酶解前9h的游离氨基酸含量与酶解时间呈良好的线性关系。释放速率如表5所示。释放速度最快的是Glu、Asp、Gly、Leu和Lys。综上所述，由V.halodenitrificans ST产生的胞外蛋白酶在酶过程中优先水解Glu-、Asp-、Gly-、Leu-和Lys-肽键。
表5由来自V.halodenitrificans ST的蛋白酶水解的海虾原料中氨基酸的释放速率
注：V、R分别表示游离氨基酸含量与酶解时间线性关系的斜率和相关性。
该菌具有以下特征：菌株ST为革兰氏阳性杆菌；在含有酪蛋白的固体培养基上的菌落特征：乳白色，不透明，表面光滑湿润，圆形，边缘齐整，中心稍突起，易挑取；该菌株鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶反应呈阳性，接触酶、氧化酶、甲基红、尿激酶、V-P、吲哚实验呈阴性，不能水解淀粉和油脂，不能液化明胶、不能利用葡蔔糖、纤维二糖、麦芽糖、阿拉伯糖和蔗糖。该菌株低于4℃不能生长，最适生长温度为30℃；生长pH范围为6-10，最适生长pH为8.0；生长的NaC1浓度为1％-10％，最适生长的NaC1浓度为7％。
将枝芽孢杆菌ST接种到肉汤培养基中，转速180rpm，装液量50mL/250mL，30℃培养12h得到种子液；将种子液接种于产酶培养基中，180rpm，30℃培养33h，12000rpm离心10min，收集上清液备用。
该蛋白酶具有以下特征：蛋白酶的最适作用温度为50℃，在45℃保温3h仍具有20％的酶活；蛋白酶在pH 5-8范围内稳定；金属离子Cu2+、Fe3+、Zn2+、Li+、Cd2+对酶活力有不同程度的抑制作用；高浓度的Ba2+、NH4 +、Ca2+、Mg2+、K+、Co2+、Mn2+、Si2+和Na2+对酶活性有一定的激活作用；化学试剂甲醇和二甲基亚砜对蛋白酶几乎不起作用。
菌株ST蛋白酶的应用，菌株ST发酵海虾的氨基酸组成：本发明方法所产蛋白酶在食品工业。将蛋白酶水解的产物进行氨基酸分析测定。对照标准品发现，酶水解产物后可见产物主要为Glu,Asp,Gly,Leu and Lys，大多为呈味物质氨基酸，在食品工业中有一定的应用价值。
菌株ST蛋白酶的酶解特异性：氨基酸的释放速率可以预测一定条件下的裂解位点，从而直观地反映蛋白酶的酶学特异性。V.halodenitrificans ST酶解前9h的游离氨基酸含量与酶解时间呈良好的线性关系。释放速度最快的是Glu、Asp、Gly、Leu和Lys。综上所述，由V.halodenitrificans ST产生的胞外蛋白酶在酶过程中优先水解Glu-、Asp-、Gly-、Leu-和Lys-肽键。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种来自海虾的枝芽孢杆菌，包括枝芽孢杆菌，其特征在于：所述枝芽孢杆菌为革兰氏阳性杆状菌，在含有酪蛋白的固体培养基上的菌落特征：乳白色、不透明、表面光滑湿润、圆形、边缘齐整、中心稍突起、易挑取其菌落形态；所述枝芽孢杆菌的鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶反应呈阳性，接触酶、氧化酶、甲基红、尿激酶、V-P、吲哚实验呈阴性。
2.根据权利要求1所述的一种来自海虾的枝芽孢杆菌，其特征在于：所述枝芽孢杆菌的生长温度范围为20-45℃，生长pH范围为6-10，生长的NaCl浓度为0％-14％，大小0.6-0.8μm×2.5-4.0μm。
3.一种如权利要求1-2中任何一项所述来自海虾的枝芽孢杆菌的生产方法，其特征在于：其步骤如下：
首先：将枝芽孢杆菌接种到肉汤培养基中，180rpm，装液量50mL/250mL，30℃培养12h，得种子液；
其次：将种子液以2％的接种量接种于产酶培养基中，180rpm，30℃培养33h，12000rpm离心10min；
最后：取上清液即为蛋白酶粗酶，产酶培养基的组成为：葡萄糖0.3％，豌豆粉1％，酪蛋白2％，NaCl7％，pH8.0。
4.根据权利要求3所述的一种来自海虾的枝芽孢杆菌的生产方法，其特征在于：所述蛋白酶粗酶的适宜作用温度为50℃，在30℃-55℃温度范围时催化活力高,产生的蛋白酶的热稳定性好，在45℃下保温5h后酶活能保持60％以上的活力；该酶在pH5.0-9.0的范围内稳定。
5.一种如权利要求1-2中任何一项所述来自海虾的枝芽孢杆菌的应用，其特征在于：所述枝芽孢杆菌运用于水解蛋白，以3％的菌液量接种至20g的海洋麻虾原料中，25℃培养箱培养20d，将发酵的海洋麻虾8000rpm，30min离心，取上清；将上清经前处理，过0.22μm的滤膜过滤后，氨基酸分析仪进行发酵产物氨基酸组分分析。
6.根据权利要求5所述的一种来自海虾的枝芽孢杆菌的的应用，其特征在于：对海虾蛋白的水解作用步骤如下：向经过灭菌处理的100mL海虾匀浆液中加入5mL粗酶液，以不加粗酶液酶解的样品为空白；于恒温振荡摇床中振荡酶解1-21h；酶解结束后，将酶解产物置于沸水中15min灭酶，冷却后8000rpm离心30min，收集上清液即为酶解液，采用氨基酸自动分析仪测定酶解液中游离氨基酸，同时设置空白对照。
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