CN112063569B - 假节杆菌nt14及其产右旋糖酐酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明是一种来自海洋的假节杆菌(Pseudarthrobacter sp.)NT14,其菌种保藏号为CGMCC No.19741。该菌株能产右旋糖酐酶，丰富了产右旋糖酐酶的海洋细菌品种。该菌株在0℃能生长，最适生长温度为30℃；生长的pH适宜范围为5‑8；在NaCl浓度为0％‑5％时可以生长。本发明还公开了利用前述假节杆菌产NT14的方法，本发明产酶方法简单，可操作性强，所产右旋糖酐酶的适合作用温度为55℃，在25℃～60℃温度范围时有催化活力，产生的右旋糖酐酶的热稳定性好，在50℃下保温5h后酶活仍能保持90％以上，55℃的半衰期是1h；该酶在pH 5.5～8.0的范围内稳定。所产右旋糖酐酶将可以运用于水解右旋糖酐，其水解产物均为低聚糖。

Description

假节杆菌NT14及其产右旋糖酐酶的方法
技术领域
本发明涉及一种微生物，特别是一种分离自中国江苏省连云港市海州湾的海洋细菌(Pseudarthrobactersp.)NT14，本发明还涉及该菌株的产右旋糖酐酶的方法。
背景技术
右旋糖酐酶(Dextranase,α-D-1,6-Glucan-6-D-Glucanohydrolase,EC3.2.1.11)是一种专一性水解α-1，6糖苷键的糖酐水解酶。因而常被应用于制糖工业、血浆代用品的生产、牙菌斑的预防及治疗等方面。右旋糖酐酶分为外切型(exodextranase)和内切型(endodextranase)两种，外切型右旋糖酐酶从右旋糖酐的还原性或非还原性末端依次以葡萄糖基为单位进行降解。内切型右旋糖酐酶可以随机切割右旋糖酐内部的α-1,6糖酐键，与前者相比降解效率更高。右旋糖酐酶来源于微生物，目前在霉菌、酵母、细菌和放线菌中均有产右旋糖酐酶的资料报道。主要包括青霉属、拟青霉属、曲霉属、镰孢属、穗霉属、轮枝孢属、长孺孢属、毛壳属及斯氏油脂酵母，细菌包括乳杆菌属、链球菌属、纤维弧菌属、噬细胞菌属、短杆菌属、假单胞菌属、棒杆菌属、节杆菌属、黄杆菌属等。右旋糖酐酶水解生成的右旋糖酐可用于化妆品、药物配方、接种疫苗、冷冻保护剂、食品保藏稳定剂等。由于右旋糖酐酶可特异水解右旋糖酐，因此可将该酶应用于食品、口腔龋齿治疗、制糖工业和洗涤工业等。
发明内容
本发明所要解决的问题是针对现有技术的不足，提供一种新的能产右旋糖酐酶的来自海洋的细菌假节杆菌(Pseudarthrobacter sp.)NT14。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供采用上述菌株NT14产右旋糖酐酶方法。
本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明公开了一种来自海洋的假节杆菌(Pseudarthrobacter sp.)NT14，其特点是：其菌种保藏号为CGMCCNo.19741。
本发明所涉及的菌株假节杆菌NT14是在连云港市海州湾近海域的海泥中分离得到的。本发明所述的假节杆菌(Pseudarthrobacter sp.)NT14,菌株的筛选方法如下：挑取少量海泥样品接种于50mL 2216E培养基中，30℃、180r/min培养2d；取适量的培养液稀释液涂布初筛培养基，30℃培养2-7d；挑取有透明圈的单菌落接入产酶培养基，30℃、180r/min培养2d，12000r/min离心5min取上清液DNS法测定酶活力大小，根据透明圈和酶活力筛选得到假节杆菌(Pseudarthrobacter sp.)NT14；
2216E培养基：蛋白胨0.5％，酵母粉0.1％，琼脂2％，陈海水配制，pH8.0；初筛培养基：蛋白胨0.5％，酵母粉0.1％，蓝色葡聚糖2000 0.2％，右旋糖酐T20 1％，琼脂2％，陈海水配制，pH8.0；
产酶培养基：大豆蛋白胨0.5％，麸皮0.5％，右旋糖酐T20 1％，自来水配制，pH7.0。
本发明还公开了一种如以上技术方案所述的假节杆菌NT14产右旋糖酐酶的方法，该方法步骤如下：将假节杆菌NT14接种到添加1％右旋糖酐T20的2216E培养基中，转数180rpm，装液量20％，30℃培养12h得到种子液；将种子液以3％的接种量接种于产酶培养基中，180rpm，20℃培养48h，12000rpm离心5min，取上清液即右旋糖酐酶粗酶液；所述的产酶培养基的组成为：麸皮0.5％，大豆蛋白胨0.5％，右旋糖酐T20 1％，pH 7.0，自来水配制。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明提供了一种新的能产右旋糖酐酶的来自海洋的细菌假节杆菌NT14，丰富了产右旋糖酐酶的海洋细菌品种。该菌株在0℃能生长，最适生长温度为30℃；生长的pH适宜范围为5-8，最适生长pH为5.0；在NaCl浓度为0％-5％时可以生长。
2、本发明产酶方法简单，可操作性强，所产右旋糖酐酶的适合作用温度为55℃，在25℃～60℃温度范围时有催化活力，产生的右旋糖酐酶的热稳定性好，在50℃下保温5h后酶活仍能保持90％以上，55℃的半衰期是1h；该酶在pH 5.5～8.0的范围内稳定。所产右旋糖酐酶将可以运用于水解右旋糖酐，其水解产物均为低聚糖。
附图说明
图1为菌株NT14扫描电镜照片形态图；
图2为菌株NT14在初筛平板上形成的透明圈；
图3为菌株NT14系统进化树；
图4为温度对菌株NT14生长的影响；
图5为pH对菌株NT14生长的影响；
图6为NaCl浓度对菌株NT14生长的影响；
图7为碳源对菌株NT14生长的影响；
图8为氮源对菌株NT14生长的影响；
图9为温度对菌株NT14产酶的影响；
图10为培养基pH对菌株NT14产酶的影响；
图11为NaCl浓度对菌株NT14对产酶的影响；
图12为碳源对菌株NT14对产酶的影响；
图13为氮源对菌株NT14产酶的影响；
图14为温度对酶作用的影响及酶的热稳定性；
图15为pH对酶作用的影响及pH稳定性；
本发明的假节杆菌NT14(Pseudarthrobacter sp.)已于2020年4月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC,保藏编号为CGMCC NO.19741。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，联系电话：010-64807355。
具体实施方式
以下参照附图，进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步的理解本发明，而不构成对其权利的限制。
实施例1，一种来自海洋的假节杆菌NT14(Pseudarthrobacter sp)CGMCCNO.19741。该菌株具有一下特征：菌株NT14为革兰氏阴性短杆菌；在含有蓝色葡聚糖的固体培养基上的菌落特征：表面光滑，湿润、边缘整齐、白色不透明菌落；该菌株在0℃能生长，最适生长温度为30℃；生长的pH适宜范围为5-8，最适生长pH为5.0；在NaCl浓度为0％-5％时可以生长。在常见碳源(葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉、糊精、麸皮、玉米淀粉、马铃薯淀粉、米糠)中均可以生长，碳源麸皮、马铃薯淀粉更适合该菌株的生长；在氮源：豆粕、干酪素、花生粕、酵母粉、尿素、硫酸铵、鱼粉蛋白、氯化铵、硝酸钠、大豆蛋白中，均可以生长；在大豆蛋白、鱼粉蛋白和酵母粉中生长更为旺盛。
以下进行具体的阐述：
1.本发明菌株的筛选方法
1.1本发明中涉及的培养基：
2216E培养基：蛋白胨0.5％，酵母粉0.1％，琼脂2％，陈海水配制，pH8.0。
初筛培养基：蛋白胨0.5％，酵母粉0.1％，蓝色葡聚糖2000 0.2％，右旋糖酐T201％，琼脂2％，陈海水配制，pH8.0。
产酶培养基：大豆蛋白胨0.5％，麸皮0.5％，右旋糖酐T20 1％，自来水配制，pH7.0。
1.2菌株的筛选方法：
挑取少量海泥样品接种于50ml 2216E培养基中，30℃、180r/min培养2d。取适量的培养液稀释液涂布初筛培养基，30℃培养2-7d，观察菌落周围是否出现透明圈。挑取有透明圈的单菌落接入产酶培养基，30℃、180r/min培养2d，12000r/min离心5min取上清液DNS法测定酶活力大小。根据透明圈和酶活力选取产右旋糖酐酶的菌株。
2.本发明菌株NT14的形态特征及分子生物学鉴定：
2.1形态特征：
菌株NT14为革兰氏阴性短杆菌(见图1)，该菌株无芽孢，无鞭毛，在2216E固体培养基中培养48h后，菌落呈边缘整齐光滑、浅白湿润。在含有蓝色葡聚糖的固体培养基中，能产生透明圈(见图2)。
2.2生理生化特征：
该菌株甲基红反应呈阳性，精氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶实验呈阴性，能利用葡萄糖、麦芽二糖、蔗糖、蕈糖。部分生理生化结果见表1。
表1菌株生理生化特征表
Figure GDA0003546457470000041
Figure GDA0003546457470000051
注：+：阳性；－：阴性
2.3菌株NT14的分子生物学鉴定
用天根试剂盒提取菌株NT14的基因组，选用扩增原核微生物16S rDNA序列的通用引物(27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGCTT-3’)。反应体系50μL，Taq酶，反应条件为95℃预变性5min，94℃变性1min，53℃退火30s，72℃延伸90s，72℃延伸10min。将PCR产物电泳纯化回收构建克隆载体，选阳性克隆子提取质粒送至上海生工测序，将测得序列互补反向拼接，获得1500bp的碱基片段序列。将菌株NT14的16S rDNA基因序列提交GenBank数据库，
通过16S rDNA序列同源性比较，可以初步确定改菌株为节杆菌(Pseudarthrobacter)。将亲缘关系较近的菌株16S rDNA运用MEGA软件进行多重比较，用中邻接法(Neibor-joing method)建系统进化树，从进化树表明菌株NT14与Pseudarthrobacter chlorophenolicus亲缘关系最近(参见图3)。
3.本发明菌NT14的生长特性
本发明提供的菌株NT14，对其生长特性进行了研究，获得了该菌株的生长条件。
3.1种子液的制备：将菌株NT14斜面种子接种到2216E培养基中，30℃，180rpm，装液量20％，培养12h。
3.2温度对菌株NT14生长的影响：
将种子液以3％接种量于2216E培养基中，pH8.0，转数180rpm，装液量20％，分别在不同温度下培养12h，选择在600nm波长下测定OD值，该菌株在0℃下能生长，该菌株温度范围为0-40℃，最适生长温度为30℃，见图4。
3.3 pH对菌株NT14生长的影响：
在2216E培养基(将陈海水改用自来水代替)加入终浓度为10mM的不同pH的缓冲液(MES、PIPES、HEPES、NaOH)，使培养基pH分别为4.0-10.0之间，30℃培养12h，测定菌浓度，生长pH范围为5.0-10.0，最适生长pH为7.0，见图5。
3.4 NaCl对菌株NT14生长的影响：
按照3.1方法制备种子液，在2216E培养基(将陈海水改用自来水)中加入NaCl，使之为0％-8％的NaCl，在30℃培养12h，在600nm波长下测定OD值，生长的NaCl浓度为0％-4％，见图6。
3.5碳氮源对菌株NT14生长的影响
碳源：0.5％的碳源(葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉、糊精、麸皮、玉米淀粉、马铃薯淀粉、米糠)和0.5％的氮源(豆粕、干酪素、花生粕、酵母粉、尿素、硫酸铵、鱼粉蛋白、氯化铵、硝酸钠、大豆蛋白)用于替换2216E培养基中的酵母粉和蛋白胨，接种在30℃、180rpm摇床培养48h后在600nm波长下测定OD值。结果发现，麸皮和马铃薯淀粉作为培养基碳源更有利于菌株NT14的生长；大豆蛋白胨、酵母粉和鱼粉蛋白胨作为氮源时对菌株NT14生长的促进作用比较明显，见图7-8。
实施例2，一种如实施例1所述来自海洋假节杆菌NT14产右旋糖酐酶的方法，其步骤如下：将假节杆菌NT14接种到2216E培养基中，转速180rpm，装液量20％，30℃培养12h得到种子液；将种子液以3％的接种量接种于产酶培养基中，在180rpm，15℃培养48h，10000rpm离心15min，取上清液得到粗酶液,4℃保存。
以下进行具体的阐述：
4.菌株NT14产右旋糖酐酶的方法
4.1温度对菌株NT14产酶的影响：
将接种培养12h的种子培养基以3％接种量接种至发酵培养基，于10-40℃培养48h后分别测酶液的活力，结果见图9。菌株NT14最佳产酶温度为15℃，当温度低于15℃或高于30℃时，菌株的产酶量下降幅度较大。
4.2培养基初始pH对菌株NT14产酶的影响：
以3％接种量接种至不同初始pH的发酵培养基，于30℃培养48h后分别测酶液的活力。初始pH调节范围为5-10。培养基初始pH对产酶的研究结果表明，培养48h，该菌株产酶的最适初始pH为7.0。随着pH的升高和下降，菌株的产酶均受到较大影响，当pH低于5.0时，由于菌株NT14几乎不生长，其发酵液测不到明显酶活力，见图10。
4.3 NaCl浓度对菌株NT14产酶的影响
以3％接种量接种至不同浓度NaCl的发酵培养基，于30℃培养48h后分别测酶液的活力。NaCl浓度调节范围为0-8％。不同NaCl浓度对产酶的研究结果表明，培养48h，当不添加NaCl时菌株产酶量最高。产酶量随着NaCl浓度的升高而下降，当NaCl浓度高于4.0时，其发酵液中测不到明显的酶活力，见图11。
4.4碳氮源对菌株NT14产酶的影响
碳源：0.5％的碳源(葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉、糊精、麸皮、玉米淀粉、马铃薯淀粉、米糠)和0.5％的氮源(豆粕、干酪素、花生粕、酵母粉、尿素、硫酸铵、鱼粉蛋白、氯化铵、硝酸钠、大豆蛋白)用于替换发酵培养基中的酵母粉和蛋白胨，接种后在20℃摇床培养48h后分别测酶液的活力。结果发现，麸皮和马铃薯淀粉作为培养基碳源可促进产右旋糖酐酶；而大豆蛋白胨作为氮源时对产酶的促进作用比较明显，其次，酵母粉和硝酸钠也有利于产酶，见图12-13，选用0.5％麸皮和0.5％大豆蛋白胨作为产酶培养基的碳氮源。
5菌株NT14右旋糖酐酶的性质
5.1粗酶液的制备：
将菌株NT14接种到2216E培养基中，转数180rpm，装液量20％，培养12h为种子液，以3％的接种量至产酶培养基中，180rpm，20℃培养48h后，将酶液10000rpm离心15min，取上清液，4℃保藏备用。
5.2酶作用温度对酶活性的影响：
将右旋糖酐酶置于不同温度下与3％右旋糖酐T20底物发生反应，测定酶活力，结果见图14(a)，酶的最适作用温度为55℃，在40℃-70℃温度范围时有较高的催化活力，在0℃仍具有酶活力。
5.3酶的热稳定性：
取适量酶液置于不同温度(45℃、50℃、55℃)下保温5h，每隔1h取一组样品，迅速冷却置于4℃冰箱保存，待保温结束后统一标准条件下测定残余酶活力，以未处理酶液的酶活力设为100％，结果见图14(b)，在50℃下保温5h后仍具有80％以上的酶活力，在55℃水浴锅中保温1h达到其半衰期。
5.4酶作用pH对酶活力的影响：
将酶液在不同pH的3.0％右旋糖酐底物中，在55℃下进行酶活力的测定，不同pH的缓冲液为：50mM乙酸乙酸钠缓冲液(pH 4.0-5.5)、50mM磷酸钠缓冲液(pH 5.5-7.5)和50mMTris-HCl缓冲液(pH 7.5-9.0)。结果见图15，该酶液的最适作用pH为5.5。
5.5酶的pH稳定性：
将适当酶液与不同pH的缓冲液(按照5.4中的缓冲液)混合，在25℃水浴锅中保温1h取出测酶活，将未处理酶液的酶活设为100％。结果见图15，结果表明，右旋糖酐酶的酶活力在pH5.0-8.0范围内较稳定，残余酶活力保持在70％以上。
5.6金属离子对酶活力的作用：
金属离子与酶液混合，使其终浓度达到1mM、5mM、10mM，测定酶活力并以不含金属离子的酶液对照计算相对酶活力，结果见表2，结果发现Si2+、Mn2+、Co2+、Na+、Cd2+、Cu2+、Ni+、Zn2+、Li+、Fe3+、对酶稳定性有不同程度的作用；Cu2+和Zn2+对酶的活力具有抑制作用，当浓度达到5mM时，酶活力完全丧失；Si2+、Ca2+对酶活力有一定的促进作用；其他金属离子如：Cd2+、K+对酶稳定性影响较小，结果表2所示。
表2金属离子对右旋糖酐酶酶活力的影响
Figure GDA0003546457470000081
Figure GDA0003546457470000091
5.7有机溶剂对酶活力的影响
将有机溶剂与右旋糖酐底物混合，使有机溶剂的终浓度为10％，右旋糖糖酐底物终浓度为3％，测定酶活力并以不含有机相的酶液对照计算相对酶活力，结果见表3，有机相乙醇、乙二醇、甲醇、环己烷、乙醚、正丙醇、异丙醇、正己烷、石油醚对酶活力具有一定的抑制作用；有机相β疏基乙醇能够使酶失活；乙酸乙酯对酶活力具有一定的促进作用；其他有机相对酶活力影响较小。
表3有机溶剂对右旋糖酐酶活力的影响
Figure GDA0003546457470000092
5.8菌株NT14右旋糖酐酶底物特异性：
将多种不同底物(右旋糖酐T20、右旋糖酐T40、右旋糖酐T70、右旋糖酐T500、右旋糖酐T2000、可溶性淀粉、普鲁兰多糖、几丁质、蔗糖)溶于50mM乙酸乙酸钠缓冲液(pH5.5)中，在标准条件下测量酶活力，结果如表4，菌株NT14右旋糖酐酶能特异性催化含有α-1,6糖酐键的不同分子量的右旋糖酐；对有α-1，4和α-1，6糖酐键组成的可溶性淀粉没有催化活力。
表4菌株NT14右旋糖酐酶底物特异性
Figure GDA0003546457470000101
5.9菌株NT14右旋糖酐酶水解产物分析
以3％右旋糖酐20000为水解底物，在右旋糖酐酶最适作用温度55℃条件下，分别反应20min、40min、1h、3h，用沸水煮沸5min使右旋糖酐酶失活，然后将酶解产物过0.45μm滤膜，4℃保存待用，对照组加入灭活的右旋糖酐酶，其他条件同上。采用Sugar-pak1糖柱对右旋糖酐酶水解产物进行分析；高效液相色谱法(HPLC)实验结果显示，麦芽四糖、葡萄五糖、葡萄六糖和麦芽七糖是右旋糖酐酶的主要水解产物。用高效液相色谱法测定水解产物的峰面积表明，随着反应时间的增加，水解产物增加；反应时间为20min、40min和1h时，水解产物主要是麦芽四糖、麦芽五塘和麦芽六糖，当反应时间增加到3h时，水解产物中出现麦芽七糖。
5.10右旋糖酐酶活力的测定：
右旋糖酐酶活测定方法：将50μL酶液加入到150μL 3％的右旋糖酐T20的乙酸乙酸钠缓冲液(0.1mol/L，pH5.5)中，在55℃水浴中反应15min，加入200μLDNS，沸水浴中煮沸5min，终止反应并显色，加入3mL去离子水震荡混匀，取200μL于96孔酶标板上在540nm下进行吸光值检测。
酶活力单位定义(U/mL)：在一定温度和pH下，每分钟催化产1μmoL还原糖的酶量为一个活力单位。
菌株NT14所产右旋糖酐酶的应用，本发明方法所产右旋糖酐酶可用于制糖工业及低聚糖的制备。将右旋糖酐酶不同时间的水解产物进行高相液相色谱分析，其水解产物均为低聚糖。

Claims (2)

1.一种来自海洋的假节杆菌(Pseudarthrobacter sp.)NT14，其特征在于：其菌种保藏号为CGMCC No.19741。
2.一种如权利要求1所述的假节杆菌NT14产右旋糖酐酶的方法，其特征在于：该方法步骤如下：将假节杆菌NT14接种到添加1％右旋糖酐T20的2216E培养基中，转数180rpm，装液量20％，30℃培养12h得到种子液；将种子液以3％的接种量接种于产酶培养基中，180rpm，20℃培养48h，12000rpm离心5min，取上清液即右旋糖酐酶粗酶液；所述的产酶培养基的组成为：麸皮0.5％，大豆蛋白胨0.5％，右旋糖酐T20 1％，pH 7.0，自来水配制。
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