CN111826317B - 马氏杆菌g-1及其产内切右旋糖酐酶的方法及产品与用途 - Google Patents

马氏杆菌g-1及其产内切右旋糖酐酶的方法及产品与用途 Download PDF

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Abstract

本发明是一种马氏杆菌(Marinibactrum sp.)G‑1，其保藏号为CGMCC NO.19742。属微生物技术领域。本发明还公开了利用马氏杆菌G‑1产右旋糖酐酶的方法和右旋糖酐酶产品及用途。本发明提供的自海洋的马氏杆菌G‑1，该菌株表面光滑，湿润、边缘整齐、乳白色不透明菌落、中间突起、易挑取。马氏杆菌G‑1生长温度范围为20‑40℃，生长pH范围为6‑9。马氏杆菌G‑1所产右旋糖酐酶的适合作用温度为40℃，在30℃～50℃温度范围时有催化活力,产生的右旋糖酐酶的热稳定性好，在40℃下保温5h后酶活仍能保持70％左右；该酶在pH 6.0～8.0的范围内稳定。具有广阔的应用前景。

Description

马氏杆菌G-1及其产内切右旋糖酐酶的方法及产品与用途
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别是一种分离自中国江苏省连云港市高公岛的海洋细菌马氏杆菌(Marinibactrum sp.)G-1；本发明还涉及该菌株的产右旋糖酐酶的方法与产品及应用。
背景技术
右旋糖酐(Dextean)是由α-1,6键水解酶(α-1,6-glycosidic bond)组成的多糖，主要由微生物发酵产生。右旋糖酐酶(Dextranase,α-D-1,6-Glucan-6-D-Glucanohydrolase,EC3.2.1.11)，又叫α-葡聚糖酶，是一种专一性水解右旋糖酐中α-1,6糖酐键的水解酶。细菌、丝状真菌、酵母等微生物可分泌右旋糖酐酶。右旋糖酐水解后生成单糖或低聚糖。在工业制糖中，右旋糖酐酶可以降解糖液中的右旋糖酐，降低生产成本，提高得糖率和生产率；在医药行业中主要用于生产不同分子量的右旋糖酐和去除牙菌斑。口腔中的微生物可以产生右旋糖酐，粘附在牙表面，形成牙菌斑，进而形成龋齿，所以，右旋糖酐酶可以用于预防和代谢中龋齿。近年来，右旋糖酐酶被批准为食品添加剂，右旋糖酐酶及其催化产物在食品工业中的用途越来越广。其中，内切型右旋糖酐酶的产物是寡糖，具有较高的生物学活性，是健康食品中重要成分之一。
发明内容
本发明所要解决的问题是针对现有技术的不足，提供一种新的能产右旋糖酐酶的来自海洋细菌马氏杆菌G-1。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供上述来自海洋细菌马氏杆菌G-1产右旋糖酐酶方法以与产品及应用。
本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。
本发明的特征包括海洋细菌马氏杆菌(Marinibactrum sp.)G-1菌株本身以及利用该菌株生产右旋糖酐酶的方法，以及利用该菌株所产的右旋糖酐酶的产品及应用。
本发明公开的马氏杆菌(Marinibactrum sp.)G-1菌株于2020年4月26日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO:19742。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
本发明所涉及的菌株G-1是在中国江苏省连云港市连云区高公岛的海泥中分离到的海洋细菌(Marinibactrum sp.)。
以下对本发明进行详细的阐述。
1、本发明菌株的筛选方法
1.1本发明中涉及的培养基：
2216E培养基：鱼粉蛋白胨0.5％，酵母粉0.1％，琼脂2％，陈海水配制，pH8.0。
初筛培养基：鱼粉蛋白胨0.5％，酵母粉0.1％，蓝色葡聚糖2000 0.2％，琼脂2％，陈海水配制，pH8.0。
产酶培养基：酵母粉0.1％，鱼粉蛋白胨0.5％，右旋糖酐T2010g/L，pH 8.0。
种子培养基：鱼粉蛋白胨0.5％，酵母粉0.1％，陈海水配制，pH8.0。
微量矿物盐溶液(每升)：
CuSO4·5H2O,0.01g；ZnSO4·7H2O,0.1g；CoCl2·6H2O,0.005g；MnCl2·4H2O,0.2g；Na2MoO4·2H2O,0.1g；KBr,0.05g；KI,0.05g；H3B03,0.1g；NaF,0.05g；LiCl,0.05g；Al2(SO4)3,0.05g；NiCl2·6H2O,0.01g；VoSO4·2H2O,0.005g；H2WO4·2H2O,0.002g；Na2SeO4,0.005g；SrCl·6H2O,0.005g；BaCl2,0.005g。
1.2菌株的筛选方法：
海泥直接取0.5g放入2ml的EP管中，加1ml蒸馏水稀释至10-8。在2216E培养基上分别涂布,30℃培养2-3d,用Simonson快速透明圈筛选法进行筛选有透明圈的单菌落挑取有透明圈的单菌落菌株接入2216E培养基进行三区划线,30℃培养2d。挑取有透明圈的单菌落菌株接入2216E培养基,30℃、180r/min培养2d,10000r/min离心5min取上清液测定酶活力大小。选出透明圈大和酶活力高的菌株。
2、本发明菌株G-1的形态特征与生理生化特征。
2.1形态特征：
菌株G-1为革兰氏阴性杆菌，菌株G-1在2216E固体培养基中培养24h后，菌落呈边缘整齐光滑、白色湿润。在含有蓝色葡聚糖的固体培养基中，能产生透明圈(见图1)。
2.2生理生化特征：
2.3菌株MNH15的分子生物学鉴定
用Takara试剂盒提取菌株MNH15的基因组，选用扩增原核微生物16S rDNA序列的通用引物(27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGCTT-3’)。反应体系50μL，Taq酶，反应条件为94℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火30S，72℃延伸90s，72℃延伸10min。将PCR产物电泳纯化回收构建克隆载体，选阳性克隆子提取质粒送至上海华大基因测序，将测得序列互补反向拼接，获得1500bp的碱基片段序列。将菌株G-1的16SrDNA基因序列提交GenBank数据库，通过16S rDNA序列同源性比较，可以初步确定改菌株为马氏杆菌(Marinibactrum)。将亲缘关系较近的菌株16SrDNA运用MEGA软件进行多重比较，用中邻接法(Neibor-joing method)建系统进化树，从进化树表明菌株G-1与Marinibactrum亲缘关系最近。参见图2。
3、本发明菌株G-1的生长特性
本发明提供的菌株G-1，对其生长特性进行了细致的研究，获得了该菌株的生长条件。
3.1种子液的制备：将菌株G-1斜面种子接种到2216E培养基中，30℃，180rpm，装液量20％，培养12h。
3.2温度对菌株G-1生长的影响：
将种子液以2％接种量于2216E培养基中，pH8.0，转数180rpm，装液量20％，分别在不同温度下培养12h，选择在600nm波长下测定OD值，该菌株温度范围为20-40℃，最适生长温度为30℃，见图3。
3.3 NaCl对菌株G-1生长的影响：
按照3.1方法制备种子液，在2216E培养基(将陈海水改用微量矿物盐溶液代替)中加入NaCl，使之为0％-10％的NaCl，在30℃培养12h，测定细胞浓度，可知该菌株无需NaCl促进生长，见图4。
3.4 pH对菌株G-1生长的影响：
在2216E培养基加入终浓度为10mmoL/L的不同pH的缓冲液(MES、PIPES、HEPES、Tirs-Hcl)，使培养基pH分别为5.0-10.0之间，30℃培养12h，测定细胞浓度，生长pH范围为6.0-8.0，最适生长pH为7.0，见图5。
4、菌株G-1产右旋糖酐酶的方法
4.1碳氮源对菌株MNH15产酶的影响。
4.2发酵温度对菌株G-1产酶影响。
4.3培养基初始pH对菌株G-1产酶的影响。
5菌株G-1右旋糖酐酶的性质
5.1粗酶液的制备：
将马氏杆菌G-1(Marinibactrum sp.)菌株接种到2216E培养基中，转数180rpm，装液量20％，培养12h，得种子液以2％的接种量至产酶培养基中，180rpm，30℃培养24h后，将酶液10000rpm离心15min，取上清液，用10000的中空纤维滤膜，5000rpm进行超滤浓缩10倍，4℃保藏备用。
5.2酶作用温度对酶活性的影响：
将右旋糖酐酶置于不同温度下与底物发生反应，测定酶活力，结果见图6，酶的最适作用温度为40℃，在20℃-45℃温度范围时有较高的催化活力。
5.3酶的热稳定性：
取适量酶液置于不同温度(30℃、40℃、50℃)下保温5h，每隔1h取一组样品，迅速冷却置于4℃冰箱保存，待保温结束后统一标准条件下测定残余酶活力，以未处理酶液的酶活力设为100％，结果见图7，在40℃下保温5h后仍具有70％左右的酶活力。
5.4酶的作用pH对酶活性的影响：
将酶液与在不同pH的1.0％的右旋糖酐溶液中在40℃下进行酶活力的测定，不同pH的缓冲液为：50mM乙酸钠缓冲液(pH 4.0-6.0)、50mM磷酸钠缓冲液(pH 6.0-7.5)和50mMTris-HCl缓冲液(pH 7.5-9.0)。结果见图8，该酶液的最适作用pH为5.5。
5.5酶的pH稳定性：
将适当酶液与不同pH的缓冲液(按照5.4中的缓冲液)混合，在25℃水浴锅中保温1h取出测酶活，将未处理酶液的酶活设为100％。结果见图9，结果表明在25℃保温1h后，右旋糖酐的酶活力在pH6.0-8.0范围内稳定。
5.6金属离子对酶的作用：
金属离子与酶液混合，使其终浓度达到1mM、5mM、10mM，然后在40℃，处理1h后，测定酶活力并以不含化学试剂的酶液对照计算相对酶活力，结果见表1，结果发现Ca2+、NH4+、K+、Sr2+、Co2+、Na+、Mn2+对酶稳定性有不同程度的作用。
表1金属离子对右旋糖酐酶稳定性的影响
Figure GDA0003546632110000051
5.7菌株G-1右旋糖酐酶底物特异性：
5.8右旋糖酐酶活的测定：
①右旋糖酐酶活测定方法：将50μL酶液加入到150μL 3％的右旋糖酐T20的Tris-HCl缓冲液(0.1mol/L，pH5.5)中，在40℃水浴中反应15min，加入200μL DNS，沸水浴中煮沸5min，终止反应并显色，加入3mL去离子水震荡混匀，取200μL与96孔酶标板上与540nm下进行吸光值测定。
②酶活力单位定义(U/mL)：在一定温度和pH下，每分钟催化产1umoL还原糖的酶量为一个活力单位
6、菌株G-1右旋糖酐酶的应用
6.1菌株G-1右旋糖酐酶的水解产物：
使用具有葡萄糖和麦芽低聚糖(麦芽三糖至麦芽五糖)的样品作为标准，通过薄层色谱(TLC)分析右旋糖酐酶水解产物。通过将板浸入含有10ml正丁醇，6ml乙醇和4ml水的溶液中，然后在120℃中加热，在TLC板上观察碳水化合物。1、2：标准品(从上到下，葡萄糖，蔗糖，麦芽三糖，麦芽四糖，麦芽五糖，麦芽六糖)3：右旋糖酐酶水解右旋糖酐1h。4：右旋糖酐酶水解右旋糖酐2h。5：右旋糖酐酶水解右旋糖酐3h。6：右旋糖酐酶水解右旋糖酐4h。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了新的自海洋的马氏杆菌G-1，该菌株表面光滑，湿润、边缘整齐、乳白色不透明菌落、中间突起、易挑取。马氏杆菌G-1生长温度范围为20-40℃，生长pH范围为6-9。最适生长温度为30℃，最适生长pH为7.0。菌株的稳定性和环境适应性好。本发明马氏杆菌G-1所产右旋糖酐酶的适合作用温度为40℃，在30℃～50℃温度范围时有催化活力,产生的右旋糖酐酶的热稳定性好，在40℃下保温5h后酶活仍能保持70％左右；该酶在pH 6.0～8.0的范围内稳定。具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为菌株G-1在初筛平板上形成的透明圈；
图2为菌株G-1系统进化树；
图3为温度对菌株G-1生长的影响；
图4为NaCl浓度对菌株G-1生长的影响；
图5为pH对菌株G-1生长的影响；
图6为温度对酶作用的影响；
图7为酶的热稳定性；
图8为pH对酶作用的影响▲乙酸乙酸钠缓冲液，●磷酸钠缓冲液，■Tris-HCl缓冲液；
图9为酶pH稳定性■乙酸钠缓冲液，●磷酸钠缓冲液，▲Tris-HCl缓冲液；
图10为菌株G-1右旋糖酐酶的水解产物图。
具体实施方式
以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步的理解本发明，而不构成对其权利的限制。
实施例1，一种来自海洋的马氏杆菌(Marinibactrum sp.)G-1。该菌株具有一下特征：菌株G-1为革兰氏阴性杆菌；在含有蓝色葡聚糖的固体培养基上的菌落特征：表面光滑，湿润、边缘整齐、白色不透明菌落。最适生长温度为30℃；生长的pH适宜范围为6-8，最适生长pH为7.0；无需NaCl即可生长。
实施例2，一种如实施例1所述来自海洋马氏杆菌G-1(Marinibactrum sp.)产右旋糖酐酶的方法，其步骤如下：将马氏杆菌G-1(Marinibactrum sp.)接种到2216E培养基中，转速180rpm，装液量20％，30℃培养12h得到种子液；将种子液以2％的接种量接种于产酶培养基中，180rpm，30℃培养24h，10000rpm离心15min，取上清液再用10000的中空纤维滤膜超滤浓缩得到粗酶液。
实施例3，一种如实施例2所述的方法产右旋糖酐酶，该右旋糖酐酶具有以下特征：右旋糖酐酶的适合作用温度为40℃，15℃仍有50％的酶活力，在30℃～50℃温度范围时有催化活力,产生的右旋糖酐酶的热稳定性好，在40℃下保温5h后酶活仍能保持70％左右；该酶在pH 6.0～8.0的范围内稳定。金属离子Ca2+、NH4+、Na+对酶有一定的激活作用，其他金属离子如：Mn2+、K+、Sr2+在加入G-1菌株的酶液之后反而降低了酶活性。
实施例4，一种采用如实施例2所述的方法产右旋糖酐酶利用该酶水解右旋糖酐，得到其水解产物，具体方法如下：将该酶与右旋糖酐在40℃反应1-5h，使用具有葡萄糖和麦芽低聚糖(麦芽三糖至麦芽五糖)的样品作为标准，点样后将硅胶板板浸入含有10ml正丁醇，6ml乙醇和4ml水的溶液中，至溶剂移动到硅胶板三分之二时结束。在120℃加热10分钟后，在TLC板上观察水解产物。所述的右旋糖酐酶水解右旋糖酐后，其产物为葡萄糖，蔗糖，麦芽三糖，麦芽四糖，麦芽五糖，麦芽六糖。结果见图10。

Claims (4)

1.一种马氏杆菌(Marinibactrum sp.)G-1，其特征在于，其保藏号为CGMCC NO.19742。
2.一种如权利要求1所述的马氏杆菌(Marinibactrum sp.)G-1产右旋糖酐酶的方法，其特征在于，其步骤如下：
(1)将马氏杆菌G-1接种到2216E培养基中，转数180rpm，装液量20％，30℃培养12h得到种子液；
(2)将种子液以2％的接种量接种于产酶培养基中，180rpm，30℃培养24h，10000rpm离心15min，取上清液即右旋糖酐酶粗酶；所述的产酶培养基的组成为：酵母粉0.1％，鱼粉蛋白胨0.5％，右旋糖酐T20 10g/L，pH 8.0。
3.一种右旋糖酐酶，其特征在于，该右旋糖酐酶采用权利要求2所述的方法得到。
4.一种如权利要求2所述的方法所产右旋糖酐酶的用途，其特征在于，所述的用途为将右旋糖酐酶运用于水解右旋糖酐。
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CN101993848A (zh) * 2010-11-08 2011-03-30 淮海工学院 海洋低温右旋糖酐酶与产酶方法及其产生菌s6-2
CN103343099A (zh) * 2013-07-02 2013-10-09 淮海工学院 来自海洋的节杆菌及其产低温右旋糖苷酶的方法
WO2019185551A1 (en) * 2018-03-25 2019-10-03 Snipr Biome Aps. Treating & preventing microbial infections

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