CN101993848A

CN101993848A - 海洋低温右旋糖酐酶与产酶方法及其产生菌s6-2

Info

Publication number: CN101993848A
Application number: CN 201010534675
Authority: CN
Inventors: 王淑军; 吕明生; 房耀维; 焦豫良; 刘姝; 曹茜; 李瑛�; 王东
Original assignee: Huaihai Institute of Techology
Current assignee: Huaihai Institute of Techology
Priority date: 2010-11-08
Filing date: 2010-11-08
Publication date: 2011-03-30
Anticipated expiration: 2030-11-08
Also published as: CN101993848B

Abstract

本发明是一种海洋弧菌S6-2(Vibriosp.S6-2)CGMCCN0.4011。该菌株生长温度范围为4-37℃，最适生长温度为25℃；生长pH范围为6-11，最适生长pH为7.0；生长的NaCl浓度为0.5%-10%，最适生长的NaCl浓度为4%。本发明还公开了一种利用弧菌产海洋低温右旋糖酐酶的方法及按该方法得到的低温右旋糖酐酶产品。该低温右旋糖酐酶在龋齿防治、制糖工业和药用右旋糖酐的生产等方面发挥着重要的作用。

Description

海洋低温右旋糖酐酶与产酶方法及其产生菌S6-2

技术领域

本发明涉及一种微生物，特别是一种分离自中国江苏省连云港海域的弧菌S6-2（Vibrio sp. S6-2）CGMCC N0. 4011（已于2010年7月16日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCC N0. 4011）；本发明还涉及该菌株产海洋低温右旋糖酐酶的方法及其产品。

背景技术

右旋糖酐（Dextean）（a homoglycan of D-glucopyranose）是95%为α-1,6糖酐键的多糖。右旋糖酐酶（Dextranase,α-D-1,6-Glucan-6-D-Glucanohydrolase, EC3.2.1.11），又叫α-葡聚糖酶，是专一切割右旋糖酐（Dextean）中α-1,6糖酐键的水解酶。右旋糖酐酶有很重要的应用价值，在龋齿防治、制糖工业和药用右旋糖酐的生产等方面发挥着越来越重要的作用。右旋糖酐酶在制糖工业中降解多糖聚合物，降低多糖的相对分子质量，从而降低糖的黏性。而在口腔疾病研究的领域中，右旋糖酐酶能有效阻滞唾液糖蛋白和粘性葡聚糖所组成的口腔牙菌斑形成，对龋齿和牙周病的防治具有重要的意义。在血液替代品制造中该酶被用于控制右旋糖酐的水解；并且可以增强抗菌药物的疗效。

目前国内外报道的产生右旋糖酐酶微生物主要为青霉（Penicillium）、斯达油脂酵母（Lipomyces starkeyi）、对角毛壳菌（Chaetomium gracile）、曲霉（Aspergillus ustus）、芽孢杆菌（Bacillus）、链球菌（Streptococcus）均能产生右旋糖酐酶。

低温酶 (cold-adapted-enzyme)，是指在低温条件下能有效催化生化反应的一类酶，低温酶具有最适温度低，低温下催化活性高，高温下容易失活等性质，在工业生产中可以节约能源及减少中温菌的污染，这些催化性质使低温酶在工业生产应用中具有很大的优势。目前右旋糖酐酶主要分离于口腔、陆地及温泉，大部分酶为中温酶，最适温度大多为50℃，导致右旋糖酐酶在应用时能量消耗大，成本高。低温酶主要来源于低温生态环境如海水、海底沉积物、冰川、高山、南北极的低温微生物产生，随着陆地资源的不断开发而面临枯竭，近年来人们逐渐将海洋微生物作为获得低温蛋白酶的新来源。目前国内外对海洋微生物产右旋糖酐酶的研究尚未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的能产低温右旋糖酐酶的来自海洋的弧菌S6-2。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供上述弧菌S6-2产低温右旋糖酐酶的方法及产品。

本发明的特征包括弧菌S6-2（Vibrio sp. S6-2）菌株本身（以下称菌株S6-2），以及利用该菌株产低温右旋糖酐酶的方法，以及利用该菌株所产的右旋糖酐酶产品。

本发明所涉及的菌株S6-2是在中国江苏省连云港海域的海水中分离到的弧菌S6-2（Vibrio sp. S6-2），该弧菌S6-2于2010年7月16日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCC N0. 4011。保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

以下对本发明进行详细的阐述。

一、本发明菌株S6-2的形态特征与生理生化特征。

1.1形态特征：

菌株S6-2为革兰氏阴性杆状细菌、无芽孢，大小约为1.31-1.58μm×0.53-0.79μm，参见图1。在含有右旋糖酐固体培养基上的菌落特征：菌落直径2mm-5mm，圆形、乳白色、湿润、透明，菌落长出后加入95%乙醇，冷冻3~4h，菌落周围出现透明圈，参见图2。

1.2生理生化特征:

菌株S6-2的生理生化特征以及与其它弧菌的比较见图3、4。菌株S6-2V-P试验阴性、MR试验阳性，无氯化钠不能生长，能液化明胶，有运动能力；能利用蔗糖、果糖，而不能利用乳糖、半乳糖、甘露糖、木糖醇、纤维二糖、阿拉伯糖、蜜二糖、山梨醇。通过Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology(second edition)分析比较，初步判定该菌株S6-2为弧菌属(Vibri)。

1.3菌株S6-2的分子生物学鉴定：

用Takara试剂盒提取 DNA 模板，并于-40℃保存。

正向引物P1：5??-GAGAGTTTGATCCTGGCT-3??，反向引物P2：5??-CGGCTACCTTGTTACGAC-3??。反应体系50??l，Taq酶2U，反应条件为95℃预变性5min，94℃变性1min，53℃退火30s，72℃延伸90s，35个循环，72℃延伸10min。PCR产物的纯化、克隆、测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。扩增菌株S6-2的16S rDNA，其长度为1500bp。将菌株S6-2的16S rRNA基因序列提交GenBank数据库，通过16S rDNA序列同源性比较，可以初步确认该菌为弧菌属（Vibrio）。将亲缘关系较近的菌株16S rDNA应用MEGA软件进行多重比较，用中邻接法（Neibor-joining method）建系统进化树，从进化树表明菌株S6-2与Vibrio alginolyticus （HM771350）亲缘关系最近。参见图5。

二、本发明菌株S6-2的生长特性

本发明提供的菌株S6-2，对其生长特性进行了细致的研究，基本摸清不同条件下该菌的生长情况。

2.1本发明中涉及的培养基：

2216E培养基：蛋白胨0.5%，酵母粉0.1%，琼脂2%，陈海水配制，pH8。

初筛培养基：蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，右旋糖酐0.2%，琼脂2%，陈海水配制，pH 8.0；

产酶培养基：酵母膏0.1%，蛋白胨0.1%，右旋糖酐1%，陈海水配制，pH 8.0。

微量矿物盐溶液(每升)：CuSO₄·5H₂O, 0.01g; ZnSO₄·7H₂O, 0.1g; CoCl₂·6H₂O, 0.005g; MnCl₂·4H₂O, 0.2g; Na₂MoO₄·2H₂O, 0.1g; KBr, 0.05g; KI, 0.05g; H₃B0_3,0.1g; NaF, 0.05g; LiCl, 0.05g; Al₂(SO4)_3,0.05g; NiCl₂·6H₂O, 0.01g; VoSO₄·2H₂O, 0.005g; H₂WO₄·2H₂O, 0.002g; Na₂SeO_4,0.005g; SrCl·6H₂O, 0.005g; BaCl₂, 0.005g。

2.2种子液的制备：将保藏在2216E培养基的弧菌S6-2接种到2216E培养基中，转速180r/min，装液量20%，培养12h。

2.3温度对菌株S6-2生长的影响：

将种子液以2%接种量于2216E培养基，转速180r/min，装液量20%，分别在不同温度下培养，每隔一段时间测定细胞浓度，选择在600nm波长下测定OD值，该菌株能够在4℃下生长，其生长温度范围为4-37℃，最适生长温度为25℃，见图6。

2.4 pH对弧菌S6-2生长的影响：

在2216E培养基中加入终浓度为10mmol/L的磷酸：醋酸：硼酸（1：1：1）作为缓冲液，使培养基的pH分别为4.0-11.0之间，在25℃培养24小时，测定细胞浓度，生长pH范围为6-11，最适生长pH为7.0，见图7。

2.5 NaCl对菌株S6-2生长的影响：

按照2.2方法制备种子液，在2216E培养基（将陈海水改用微量矿物盐溶液代替，每升培养基加入10ml）中加入NaCl，使之为0%到12%的NaCl，在25℃培养24小时，测定细胞浓度，生长的NaCl浓度为0.5%-10%，最适生长的NaCl浓度为4%，见图8。

三、菌株S6-2产低温右旋糖酐酶的方法

发明人对弧菌S6-2（vibrio S6-2）产低温右旋糖酐酶的产酶条件进行了研究。

3.1发酵时间对菌株S6-2产酶的影响：

将种子液接入到产酶培养基中，在25℃、180r/min下，振荡培养48h，每4h取出测酶活力及OD₆₀₀。在24h之前，产酶量上升速度较快，到发酵24h时（即菌体生长到稳定期）产酶量最高，随时间增加，酶活力逐渐下降，见图9。

3.2发酵温度对菌株S6-2产酶影响：

在不同温度下进行发酵培养，结果显示20-30℃时右旋糖酐酶产量达到最高，低于20℃、高于30℃的情况下产酶均迅速下降。15℃和35℃时分别只有最高产酶量13.7%和50.3%的产酶量。低于20℃时菌体生长缓慢，产酶量也相应降低；而温度高于30℃后，菌体代谢太快，衰老快，不利于产酶，见图10。

3.3培养基pH对菌株S6-2产酶的影响：

在不同pH条件下发酵培养24h后测定右旋糖酐酶活力。实验结果证明随着pH的升高，酶产量逐渐增加，当pH达到7.0时产酶量达到最大；pH继续升高，酶产量迅速下降。在低于pH5.0或高于pH10.0时酶产量均很低，见图11。

3.4 NaCl浓度对菌株S6-2产酶的影响

NaCl浓度对产酶影响不太显著。起初，产右旋糖酐酶的量随NaCl浓度的增加而逐渐增加，当培养基NaCl浓度升至4%时，产右旋糖酐酶最高，进一步升高NaCl浓度则会对菌体生长和右旋糖酐酶酶活积累产生一定的抑制作用。

3.5装液量对菌株S6-2产酶的影响：

摇瓶装液量分别为10%、15%、20%、25%、30%和40%进行发酵试验，结果表明，装液量太少溶氧过大，对菌体造成伤害不利于产酶，装液量太多溶氧太差，不利于菌体生长，同样降低产酶，结果显示装液量在25％时产酶最高，见图12。

3.6不同碳氮源对菌株S6-2产酶的影响：

分别在培养基中添加不同的碳源和氮源进行发酵培养，发酵24h后测定发酵液酶活力，结果发现，在碳源的比较中，麦芽糖最能促进产酶，葡萄糖和可溶性淀粉次之，乳糖、纤维素不利于产酶，培养基中添加不同碳源对产酶的影响较大；不同氮源的发酵结果显示，酵母膏最有利于产酶，胰蛋白胨和蛋白胨、酪蛋白、玉米粉次之，无机氮源不利于产酶，见图13。本实验证明适当调整培养基中的碳氮源，可以较高地促进右旋糖酐酶的产出。

四、低温右旋糖酐酶的性质

4.1 粗酶液的制备：

将弧菌S6-2（Vibrio sp. S6-2）菌株接种到2216E培养基中，转速180r/min，装液量20%，培养12h，得种子液；将种子液以2%的接种量接种于产酶培养基，180r/min，25℃培养24h，10000r/min离心5min，取上清液经过硫酸铵、DEAE-sepharose Flat Flow和Sephacryl S-200方法制备低温右旋糖酐酶。

4.2 酶作用温度对酶活性的影响：

将右旋糖酐酶置于不同温度下与底物发生反应，测定酶活力，结果见图14，酶的最适作用温度为20℃，5℃仍有34%的酶活力，在5℃~50℃温度范围时有较高的催化活力。

4.3酶的热稳定性：

取适量酶液分别在不同温度（20℃、30℃、40℃和60℃）下保温2.5h，每隔0.5到1h取出一组样品，迅速置于4℃冰箱内，待保温结束后统一在标准条件下测定残余酶活，以未处理酶液的酶活设为100%，结果见图15，在60℃保温2h后该酶仍具有50%以上的活性。

4.4酶的作用pH对酶活性的影响：

将酶液与在不同pH的1.0﹪的右旋糖酐溶液中在20℃下进行酶活力测定，不同pH值的缓冲液为：50mM柠檬酸钠缓冲液（pH3.0到6.0）；50mM磷酸钠缓冲液（pH 6.0到8.0）；50mM Tris-盐酸缓冲液 (pH 8.0 to 9.0)；50mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液（pH9.0到10.0）。结果见图16，pH7.0该酶的活性最高。

4.5 酶的pH稳定性：

将50ul酶液与150ul不同pH的缓冲液混合，缓冲液为伯瑞坦-罗宾森（Britton-Robinson）缓冲溶液，pH分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，在20℃水浴锅中保温1h 取出测定残余酶活，将未处理酶液的酶活设为100%。结果见图17，结果表明在20°C保温下1h后，右旋糖酐酶在pH6.0-10.0范围内稳定，残余酶活力保持在50%以上，在pH4.0有11.6%残余酶活。

4.6金属离子、化学试剂对酶的作用：

将各种金属离子与酶液混合，使其最终浓度达到1.0 mM、5.0mM，然后在20℃下测酶活，结果见图18。将各种化学试剂与酶液混合，使其达到预定浓度，测定酶活，结果见图19。结果发现低浓度的Al³⁺对右旋糖酐酶有激活作用，高浓度的Al³⁺会抑制该酶活性。Hg²⁺、Pb²⁺、Mn²⁺、Mg²⁺、Li²⁺、Co³⁺、Cu²⁺、Zn²⁺对酶有不同程度的抑制作用。其它金属离子如：Ca²⁺、Ba²⁺和Fe³⁺对该酶的影响不大。化学试剂SDS、尿素、DTT和NBS对酶有抑制作用。

4.7 右旋糖酐酶活测定。

①右旋糖酐酶活测定方法：取1%右旋糖酐溶液100μL加入100μL酶液，空白以100μL灭活的酶液代之，20℃反应15min，立即放入冰浴中终止反应，加入200μL DNS 100℃煮沸5min，终止反应并显色，加入3mL去离子水振荡混匀，取200μL于96孔酶标板上于520nm下进行吸光值测定。

②酶活力单位定义：上述反应条件下每分钟水解右旋糖酐产生1μg麦芽糖所需的酶量，定义为一个酶活力单位（U）。

本发明方法所产低温右旋糖酐酶在龋齿防治、制糖工业和药用右旋糖酐的生产等方面发挥着重要的作用。

附图说明

图1为菌株S6-2形态染色特征（10×100）。

图2为菌株S6-2在含右旋糖酐平板上的透明圈。

图3为菌株S6-2的生理生化特征图表。

图4为菌株S6-2理化特征与其它弧菌的比较图表。

图5为菌株S6-2的16S rRNA进化树分析图。

图6为温度对菌株S6-2生长的影响图。5℃（◆），10℃（■），15℃（▲），20℃（□），25℃（△），30℃（◇），35℃（×）。

图7为pH对菌株S6-2生长的影响图。

图8为NaCl对菌株S6-2生长的影响图。

图9为时间对菌株S6-2生长和产酶的影响图。

图10为温度对菌株S6-2产酶的影响图。

图11为pH对菌株S6-2产酶的影响图。

图12为装液量对菌株S6-2产酶的影响图。

图13为碳氮源对菌株S6-2产酶的影响图表。

图14为温度对酶活性的影响图。

图15为温度对酶热稳定性的影响图，20℃（◆），30℃（■），40℃（▲），60℃（×）。

图16为pH对酶活力的影响图。

图17为pH对酶稳定性的影响图。

图18为金属离子对酶活力的影响图表。

图19为化学试剂对酶活力的影响图表。

本发明弧菌S6-2（Vibriosp. S6-2）己于2010年7月16日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCC N0. 4011。保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

具体实施方式

以下参照附图，进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。

实施例1。一种弧菌S6-2（Vibriosp. S6-2）CGMCC N0.4011。该菌株具有以下特征：菌株为革兰氏阴性杆状细菌、无芽孢，大小约为1.31-1.58μm×0.53-0.79μm；在含有右旋糖酐固体培养基上的菌落特征：菌落直径2mm-5mm，圆形、乳白色、湿润、透明，菌落长出后加入95%乙醇，冷冻3~4h，菌落周围出现透明圈；菌株V-P试验阴性、MR试验阳性，无氯化钠不能生长，能液化明胶，有运动能力；能利用蔗糖、果糖，而不能利用乳糖、半乳糖、甘露糖、木糖醇、纤维二糖、阿拉伯糖、蜜二糖、山梨醇。弧菌S6-2的生长特性为：该菌株生长温度范围为4-37℃，生长pH范围为6-11；生长的NaCl浓度范围为0.5%-10%；该菌株最适生长温度为25℃；最适生长pH为7.0；最适生长的NaCl浓度为4%。

实施例2。一种如实施例1所述的弧菌S6-2 CGMCC N0.4011产低温右旋糖酐酶的方法，其步骤如下：将弧菌S6-2（vibrio sp. S6-2）菌株接种到2216E培养基中，转速180r/min，装液量20%，培养12h，得种子液；将种子液以2%的接种量接种于产酶培养基，180r/min，25℃培养24h，10000r/min离心5min，取上清液经过硫酸铵、DEAE-sepharose Flat Flow和Sephacryl S-200方法制备低温右旋糖酐酶。

实施例3。一种如实施例2所述的方法所产低温右旋糖酐酶，该低温右旋糖酐酶具有以下特征：所述的低温右旋糖酐酶的性质为：右旋糖酐酶的最适作用温度为20℃，在60℃保温2h后该酶仍具有50%以上的活性；右旋糖酐酶在pH6.0-10.0范围内稳定，Hg²⁺、Pb²⁺、Mn²⁺、Mg²⁺、Li²⁺、Co³⁺、Cu²⁺、Zn²⁺对酶有不同程度的抑制作用；Al³⁺对该酶有激活作用；SDS、尿素、DTT和NBS对该酶有抑制作用。

Claims

1.一种弧菌S6-2（Vibrio sp. S6-2）CGMCC N0.4011。

2.根据权利要求1所述弧菌S6-2（Vibrio sp. S6-2）CGMCC N0.4011，其特征在于：该菌株具有以下特征：弧菌S6-2为革兰氏阴性杆状细菌、无芽孢，大小约为1.31-1.58μm×0.53-0.79μm；在含有右旋糖酐固体培养基上的菌落特征：菌落直径2mm-5mm，圆形、乳白色、湿润、透明，菌落长出后加入95%乙醇，冷冻3~4h，菌落周围出现透明圈；菌株V-P试验阴性、MR试验阳性，无氯化钠不能生长，能液化明胶，有运动能力；能利用蔗糖、果糖，而不能利用乳糖、半乳糖、甘露糖、木糖醇、纤维二糖、阿拉伯糖、蜜二糖和山梨醇。

3.根据权利要求1所述弧菌S6-2（Vibrio sp. S6-2） CGMCC N0.4011，其特征在于，其生长特性为：该菌株生长温度范围为4-37℃，生长pH范围为6-11；生长的NaCl浓度范围为0.5-10%。

4.根据权利要求1所述弧菌S6-2（Vibrio sp. S6-2）CGMCC N0.4011，其特征在于，其生长特性为：该菌株最适生长温度为25℃；最适生长pH为7.0；最适生长的NaCl浓度为4%。

5.一种如权利要求1-4中任何一项所述的弧菌S6-2 （Vibrio sp. S6-2）CGMCC N0.4011产低温右旋糖酐酶的方法，其特征在于，其步骤如下：将弧菌S6-2（vibrio sp. S6-2）菌株接种到2216E培养基中，转速180r/min，装液量20%，培养12h，得种子液；将种子液以2%的接种量接种于产酶培养基，180r/min，25℃培养24h，10000r/min离心5min，取上清液经过硫酸铵、DEAE-sepharose Flat Flow和Sephacryl S-200方法制备低温右旋糖酐酶。

6.一种如权利要求5所述的方法所产低温右旋糖酐酶，其特征在于：所述的低温右旋糖酐酶的理化性质为：酶的适合作用温度为20℃，在60℃保温2h后该酶仍具有50%以上的活性；右旋糖酐酶在pH6.0-10.0范围内稳定，Hg²⁺、Pb²⁺、Mn²⁺、Mg²⁺、Li²⁺、Co³⁺、Cu²⁺、Zn²⁺对酶有不同程度的抑制作用；Al³⁺对该酶有激活作用；SDS、尿素、DTT和NBS对该酶有抑制作用。