CN102409006B - 一种生产酸性高温淀粉酶的菌株及其工艺方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种生产酸性高温淀粉酶的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），保藏号为CGMCC No.3877，以及其发酵制备的酸性高温淀粉酶；所述菌株液体发酵淀粉酶活力达到2000-2300U/mL。所述酸性高温淀粉酶最适酶解温度为95℃，耐受温度100℃，100℃保温30分钟，酶活力保存90%-95%。最适酶解pH3.0-3.5，适应pH范围2.0-7.0。用所述酸性高温淀粉酶液化或糖化淀粉，主要为麦芽糖，其次为麦芽三糖，麦芽四糖，麦芽五糖，麦芽六糖以及少量的葡萄糖，该淀粉酶既具有α-淀粉酶活性同时具有β-淀粉酶活性，即同时具有液化酶和糖化酶功能的特点，具有开发食用或药用或饲料用耐酸淀粉酶产品的潜力。
Description
技术领域
本发明涉及一种枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CGMCC NO.3877生产酸性高温淀粉酶的菌株及其工艺方法，本发明属于发酵工程与酶工程的生物技术领域。
背景技术
淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的统称，是最早实现工业化生产，迄今为止用途最广、产量最大的酶制剂品种。主要用于制备淀粉糖，目前，我国用淀粉酶制备的淀粉糖总量近700万吨。此外，淀粉酶还广泛应用于酿酒、食品、医药、纺织和环境治理等行业，已经成为工业上用量最多的酶之一。
高温α-淀粉酶通常是指在温度70℃以上，具有最适反应温度的淀粉酶，是淀粉加工中有重要用途的一种酶。目前工业生产中使用的高温淀粉酶主要来自地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)及其突变株。此外还有芽孢杆菌属的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、嗜热芽孢杆菌(B.stearothermophilus)和属于古细菌的Pyrococcus furiosus,Pyrococcuswoesei,Thermococcus profundus等。
至今，国内外关于高温α-淀粉酶文献报道很多，国内也有一些相关的专利申请和专利授权。如：
⑴发明专利：“一种耐酸高温淀粉酶菌株及其生产耐酸高温淀粉酶的方法”，专利申请号200810020635.2；申请人：无锡德冠生物科技有限公司。
⑵发明专利：“嗜热短小芽孢杆菌株Tamy12及其产高温淀粉酶”，专利申请号：200910094649.3；申请人：昆明理工大学。
⑶发明专利：“高温地衣芽孢杆菌及其产高温淀粉酶”，专利申请号：200910094650.6.申请人：昆明理工大学。
⑷发明专利：“一种耐高温淀粉酶制备方法”，专利申请号201010179195.2；申请人：长沙青出蓝科技有限公司。
⑸菌株Bacill us coagulans LS21，最适合酶解条件90℃，pH7.5。卢涛等.四川大学学报,2002,62:1131-1133。
⑹菌株Bacillus micro-bnfillus licheniformis DG-1，最适合酶解条件95℃，pH7.0。张强等.中国酿造,2008,184:21-24。
⑺菌株嗜热脂肪土芽胞杆菌（Geobacillus stearothermophilus CHB1)，最适合酶解条件60℃，任香芸等.微生物学杂志,2007,27:18-21。
⑻菌株短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus Tamy12），最适合酶解条件80℃，pH5.0。丁必权等.食品工业科技,2010,9:185-190。
目前，生产高温α-淀粉酶仍然存在以下不足：一是耐酸性不够，一般都在pH4.5-7.5左右有效，超过此范围酶活力下降快，耐受pH2.5-3.5未见报道；二是发酵水平较低，成本高；三是耐受温度很难超过95℃。
发明内容
针对当前高温淀粉酶产生菌的不足，本发明提供一种生产酸性高温淀粉酶的菌株及其工艺方法，包括菌株的筛选，培养基的选择，发酵工艺的优化，酶制剂制备。
本发明目的之一是获得一种生产酸性高温淀粉酶的菌株，通过以下技术方案实现，步骤如下：
⑴酸性高温淀粉酶的菌株富集，将来自不同地区土壤的样品100g，置于250mL三角瓶中，加自来水至200mL，淀粉10g，调pH至3.0-4.0，在55℃摇床中振荡培养5-7天，并不断补充无菌水。
⑵酸性高温淀粉酶的菌株筛选，配制平板筛选培养基（可溶性淀粉3g，蛋白胨0.5g，琼脂2.0g，自来水100mL，121℃灭菌25分钟），按十倍稀释法涂布上述富集菌悬液，37℃培养1-3天，待长出菌落，加入卢戈氏碘液5mL于平板表面，观察淀粉水解圈，挑出透明圈大的单菌落，并接种WBDA斜面保藏（10%麸皮水煮沸20分钟，2层纱布过滤，定容至预定体积，滤液中添加2%葡萄糖，2%琼脂，自然pH，121℃灭菌25分钟），获得若干淀粉酶产生菌株，如附图1。
⑶摇瓶发酵筛选，配制发酵培养基（可溶性淀粉2g，麸皮4g，自来水100mL，121℃灭菌25分钟），接种上述筛选菌株，于37℃摇床中振荡培养1.5-3.0天，测定淀粉酶活力，复筛获得高活力高酸性淀粉酶菌株lysyy2，经鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis lysyy2），菌株于2010年5月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号，CGMCC No.3877。
本发明目的之二是获得菌株Bacillus subtilis CGMCC No.3877最适酶解淀粉的酶反应条件及其酶学特性。酶活力测定方法参照GB/T55212008，酶活力定义为：在温度70℃、pH6.0条件下，1分钟内液化1mg可溶性淀粉所需要的酶量，即为1个酶活力单位（U）。通过以下技术方案实现，步骤如下：
⑴菌株Bacillus subtilis CGMCC No.3877淀粉酶最适酶解温度的确定，分别在70℃，75℃，80℃，85℃，90℃，95℃，100℃，pH6.0条件下，测定菌株发酵淀粉酶的活力，确定菌株最适酶解温度为95℃，该菌株酶活力在90℃-100℃范围内，酶解淀粉的能力无显著性差异（p﹤0.05）。该酶液100℃保温30分钟，酶活力保存90%-95%。
⑵菌株Bacillus subtilis CGMCC No.3877淀粉酶最适酶解pH的确定，分别在pH2.0-8.0范围内，95℃条件下，测定菌株发酵淀粉酶的活力，确定菌株最适酶解pH为pH3.0，该菌株酶活力在pH3.0-4.0范围内，酶解淀粉的能力无显著性差异（p﹤0.05）；在pH2.0时酶活力为pH3.0时的78%；在pH2.5时酶活力为pH3.0时的89%；在pH7.0时将为pH3.0时的75%。
⑶菌株Bacillus subtilis CGMCC No.3877淀粉酶酶学特性，所述淀粉酶为酸性酶蛋白，在活性聚丙烯酰胺电泳显示一条透明带，确定为一个组分（如附图2–A、B），在变性聚丙烯酰胺电泳分析为单一蛋白条带，分子量为27.3kDa（如附图3），水解可溶性淀粉产物经薄层层析测定，主要为麦芽糖，其次为麦芽三糖，麦芽四糖，麦芽五糖，麦芽六糖以及少量的葡萄糖，该淀粉酶既具有α-淀粉酶活性同时具有β-淀粉酶活性。
本发明的目的之三在于提供一种生产酸性高温淀粉酶的的工艺方法，包括培养基的优化，发酵工艺的优化。通过以下技术方案实现，步骤如下：
⑴液体发酵培养基配方：麸皮4.5%-5.0%，淀粉1.0%-1.5%，其余为自来水，121℃灭菌25-30分钟。
⑵发酵条件：Bacillus subtilis CGMCC No.3877种子液按5%的接种量接种，发酵罐通气量为1.0-1.2:1(vvm，无菌空气体积/发酵罐装液量体积/分钟)，发酵温度38℃，转速依据发酵罐直径而定，搅拌桨末端线速度小于20米/秒，发酵周期48-60小时，获得高温淀粉酶粗酶液。
⑶高温淀粉酶浓缩酶液的制备，将高温淀粉酶粗酶液加入0.5%硅藻土助滤剂，经板框过滤获得粗滤液，粗滤液经超滤浓缩至原体积的1/8-1/10，加入1%甘油稳定剂和1%三梨酸防腐剂，在25℃以下保存3个月酶活不低于标示酶活力。[0010]本发明的工艺方法生产酸性高温淀粉酶产品质量符合中华人民共和国轻工行业标准QB/T2306—97。活力达到20000-22000U/mL，耐受温度100℃，适应pH范围2.0-7.0，最适酶解pH3.0-3.5；该淀粉酶既具有α-淀粉酶活性同时具有β-淀粉酶活性。
附图说明
附图1：琼脂平板筛选酸性淀粉酶产生菌，深蓝色部分为淀粉遇碘的颜色，透明圈中内圆斑点为淀粉酶产生菌菌落、外圆为淀粉酶水解淀粉的水解圈（圈内淀粉被水解，遇碘显示碘的本色）。
附图2：A,枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CGMCC No.3877淀粉酶液经聚丙烯酰胺活性电泳胶（胶浓度10%），用pH3.0醋酸缓冲液漂洗2-3分钟，再用2%可溶性淀粉溶液浸泡5分钟，70℃条件下反应5分钟，再用卢戈氏碘液媒染，透明部分（淀粉被酶水解无颜色）为淀粉酶蛋白条带所在处；B，所述媒染电泳胶（附图A）再用考马斯亮蓝染色，20%甲醇和10%醋酸脱色，显示淀粉酶蛋白条带。
附图3：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CGMCC No.3877附图2-A、B中淀粉酶蛋白条带经切胶、电透析纯化，经聚丙烯酰胺变性电泳胶（胶浓度10%）测定分子量，lane M蛋白质标样分子量，lane1枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CGMCCNo.3877淀粉酶亚基分子量为27.3kDa。
具体实施方式
下面，本发明将用实施例进行进一步的说明，但是它并不限于这些实施例的任一个或类似实例。
实施例1：
⑴在一个具体的实施案例中，将来自不同地区土壤的样品100g，置于250mL三角瓶中，加自来水至200mL，淀粉10g，调pH至3.0-4.0，在55℃摇床中振荡培养5-7天，并不断补充无菌水，富集酸性高温淀粉酶的菌株。
⑵配制平板筛选培养基（可溶性淀粉3g，蛋白胨0.5g，琼脂2.0g，自来水100mL，121℃灭菌25分钟），按十倍稀释法涂布上述富集菌悬液，37℃培养1-3天，待长出菌落，加入卢戈氏碘液5mL，观察水解圈，挑出透明圈大的单菌落，并接种WBDA斜面保藏（10%麸皮水煮沸20分钟，2层纱布过滤，定容至预定体积，滤液中添加2%葡萄糖，2%琼脂，自然pH，121℃灭菌25分钟）获得若干淀粉酶产生菌株，筛选酸性高温淀粉酶的菌株，其中菌株lysyy2经鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。
⑶配制摇瓶筛选培养基（可溶性淀粉2g，麸皮4g，自来水100mL，121℃灭菌25分钟），接种上述筛选菌株，于37℃摇床中振荡培养1.5-3.0天，测定淀粉酶活力，复筛高活力高酸性淀粉酶菌株lysyy2，摇瓶发酵酶活力达到900-1100U/mL。
实施例2：
⑴在另一个具体的酶学特性分析的实施案例中，在70℃，75℃，80℃，85℃，90℃，95℃，100℃，pH6.0条件下，分别测定菌株Bacillus subtilis CGMCC No.3877淀粉酶的活力，确定菌株最适酶解温度为95℃，该菌株酶活力在90℃-100℃范围内，分析该酶水解淀粉的能力的差异，以及该酶液70℃-100℃保温30分钟，测定该酶的耐受温度。其中100℃保温30分钟，酶活力保存90%-95%。
⑵在pH2.0-8.0范围内，95℃条件下，分别测定菌株Bacillus subtilis CGMCCNo.3877淀粉酶对pH的适应性，其中菌株Bacillus subtilis CGMCC No.3877最适酶解pH为pH3.0，该菌株酶活力在pH3.0-4.0范围内，酶解淀粉的能力无显著性差异（p﹤0.05）；在pH2.0时酶活力为pH3.0时的78%；在pH2.5时酶活力为pH3.0时的89%；在pH7.0时将为pH3.0时的75%。
⑶采用活性聚丙烯酰胺电泳分析分离纯化菌株Bacillus subtilis CGMCCNo.3877淀粉酶组分（胶浓度10%），用pH3.0醋酸缓冲液漂洗电泳胶2-3分钟，再用2%可溶性淀粉溶液浸泡电泳胶5分钟，70℃条件下反应5分钟，再用卢戈氏碘液媒染，透明部分（淀粉被酶水解无颜色）为淀粉酶蛋白条带所在处；随后，对所述媒染电泳胶再用考马斯亮蓝染色，20%甲醇和10%醋酸脱色，显示淀粉酶蛋白条带只有1条，确定有一个组分。该菌株淀粉酶蛋白在变性聚丙烯酰胺电泳分析为单一蛋白条带，确定只有1种亚基，且分子量为27.3kDa。该淀粉酶水解可溶性淀粉产物经薄层层析测定，主要为麦芽糖，其次为麦芽三糖，麦芽四糖，麦芽五糖，麦芽六糖以及少量的葡萄糖，该淀粉酶既具有α-淀粉酶活性同时具有β-淀粉酶活性。且所述淀粉酶为酸性酶蛋白。
实施例3：
在再一个具体的淀粉酶制备的实施案例中，优化液体发酵培养基配方：麸皮4.5%-5.0%，淀粉1.0%-1.5%，其余为自来水，121℃灭菌25-30分钟。发酵条件：按5%的接种量接种Bacillus subtilis CGMCC No.3877种子液，设定发酵罐通气量为1.0-1.2:1(vvm，无菌空气体积/发酵罐装液量体积/分钟)，发酵温度38℃，转速依据发酵罐直径而定，线速度小于20米/秒，发酵周期48-60小时，获得高温淀粉酶粗酶液，粗酶液淀粉酶活力达2000-2300U/mL。然后将高温淀粉酶粗酶液加入0.5%硅藻土助滤剂，经板框过滤获得粗滤液，粗滤液经超滤浓缩至原体积的1/8-1/10，加入1%甘油稳定剂和1%三梨酸防腐剂，制成酸性高温淀粉酶成品，在25℃以下保存3个月酶活不低于标示酶活力。本发明的工艺方法生产酸性高温淀粉酶产品质量符合中华人民共和国轻工行业标准QB/T2306—97。活力达到20000-22000U/mL，耐受温度100℃，适应pH范围2.0-7.0，最适酶解pH3.0-3.5；该淀粉酶既具有α-淀粉酶活性同时具有β-淀粉酶活性。
技术效果
用Bacillus subtilis CGMCC No.3877发酵生产酸性高温淀粉酶，具有以下突出优势：
⑴发酵周期仅48小时，培养基配方简单（麸皮和淀粉），成本低。
⑵Bacillus subtilis CGMCC No.3877酸性高温淀粉酶耐受高温达100℃，最适温度95℃；最适酶解pH3.0-3.5，耐受酸性低达pH2.0，具有开发食用或药用或饲料用耐酸产品的潜力。
⑶Bacillus subtilis CGMCC No.3877酸性高温淀粉酶，水解可溶性淀粉产物主要为麦芽糖，其次为麦芽三糖，麦芽四糖，麦芽五糖，麦芽六糖以及少量的葡萄糖，该淀粉酶既具有α-淀粉酶活性同时具有β-淀粉酶活性，即同时具有液化酶和糖化酶功能的特点。
Claims (2)
1.一种生产酸性高温淀粉酶的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)lysyy2菌株，所述菌株已于2010年5月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号，CGMCC No.3877。
2.一种利用权利要求1所述枯草芽孢杆菌生产酸性高温淀粉酶的方法，其特征包括：⑴发酵培养基配方：麸皮4.5%-5.0%，淀粉1.0%-1.5%，其余为自来水，121℃灭菌25-30分钟；⑵发酵工艺条件：按5%的接种量接种所述菌株种子液，设定发酵罐通气量为，每分钟的无菌空气量体积L与发酵罐装液量体积L比为1.0-1.2:1，发酵温度38℃，搅拌桨末端线速度小于20米/秒，发酵周期48-60小时；⑶发酵醪液后处理方法：将发酵粗酶液，加入0.5%硅藻土助滤剂，经板框过滤获得粗滤液，粗滤液经超滤浓缩至原体积的1/8-1/10，加入1%甘油稳定剂和1%三梨酸防腐剂，制成酸性高温淀粉酶成品。
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