CN102703407A - 一种枯草芽孢杆菌工程菌发酵制备亮氨酸氨肽酶的方法 - Google Patents

Abstract

一种枯草芽孢杆菌工程菌发酵制备亮氨酸氨肽酶的方法，属于酶制剂、食品添加剂技术领域。本发明涉及利用枯草芽孢杆菌工程菌的发酵生产，发酵液经絮凝、过滤除菌、超滤浓缩、冷冻干燥等提取操作，获得亮氨酸氨肽酶的酶粉，并对所制备的酶考察其基本酶学特性。本发明对在野生枯草芽孢杆菌zj016基础上构建的高产亮氨酸氨肽酶的枯草芽孢杆菌工程菌PMA5-SAP，进一步进行发酵过程优化，采用培养基的预处理、培养基组成的调整、溶氧水平的控制等策略，使7L发酵罐产亮氨酸氨肽酶酶活得到大幅度提高，发酵产酶又从7000U/L酶活单位提高到200000U/L左右。

Description

一种枯草芽孢杆菌工程菌发酵制备亮氨酸氨肽酶的方法

技术领域

一种枯草芽孢杆菌工程菌发酵制备亮氨酸氨肽酶的方法，具体地说是利用枯草芽孢杆菌工程菌发酵，收集发酵液，通过絮凝、过滤、超滤浓缩、冷冻干燥等提取操作，获得亮氨酸氨肽酶制品，属于酶制剂、食品添加剂技术领域。

背景技术

蛋白酶的商品生产始于20世纪初，30年代微生物蛋白酶开始应用于食品和制革工业，近年来，微生物产酶的研究蓬勃发展。20世纪50年代初，日本学者首先发现霉菌中存在几种类型的蛋白酶，特别是酸性蛋白酶，20世纪60年代初，荷兰开始生产添加碱性蛋白酶的洗涤剂。到目前为止，国际市场上商品蛋白酶达100种以上。

蛋白酶制剂在蛋白加工领域中主要被用于改良风味、改善营养价值、生产抽提物、以及改变物理性质等。广义上，蛋白酶制剂包括两种类型：一类是蛋白酶，它能分解蛋白生成多肽或寡肽；另一类是肽酶，它能从末端开始切割蛋白和肽链并释放出游离单个氨基酸。酶作为生物催化剂具有反应条件温和、催化效率高和专一性强等优点，并因其高效、节能、经济、绿色、环保等的特点，其应用范围已遍及工业生产、农业、医疗诊断、环境保护、食品加工等领域。由于食品工业生产规模的日益扩大，食品行业的快速发展，食品添加剂特别是天然鲜味剂的需求也得到了快速增长。营养性天然鲜味剂是一类含氨基酸、肽类、核苷酸和糖分等物质并具有鱼肉和蔬菜等风味的调味料，主要包括动植物提取浸膏、蛋白质水解浓缩物和酵母浸膏等。

酶制剂是发酵产业的核心产品，酶制剂行业推动了发酵工业和相关行业的发展，并产生了巨大的经济和社会效益。目前，我国酶制剂行业发展较快，基本上满足了大宗产品生产的需求。但是在产品方面，要进一步提升新酶种的结构比例，特别是国外完全垄断的小酶品种。同时，加快开发和生产复合酶制剂，包括食品、纺织、饲料、纸浆、制革、造纸等专用复合酶制剂。此外，继续提高现有酶制剂酶的活性，提高产品档次。国内在氨肽酶生产方面的研究处于快速发展研究的阶段，实现产业化，填补国内产品的空白，替代进口产品，增强我国酶制剂行业竞争力，打破该产品被国外的垄断有着重要的意义。

目前蛋白质的水解方式逐渐从化学法向酶解法转变。用传统的方式水解蛋白质制备活性多肽，已经不能满足现代人民生活要求，在科技日新月异的今天，酶解蛋白质生产多肽已成为当今热门研究，通过不同的酶切方式可以获得不同功能的活性多肽，关于这方面已有很多相关的报道。大豆蛋白水解生产大豆多肽是大豆深加工的一个重要方向，因为大豆多肽不仅具有良好的营养特性，还具有广泛的生理药理作用和比大豆蛋白更丰富的功能特性，所以大豆多肽是一种很有前景的功能性食品原料。随着生物技术的进步和生命科学的发展，生理活性肽的生理功能逐步被人们发现，并受到越来越多的重视，尤其是一些活性肽的结构和生理功能逐渐明确，推动了活性肽的研究，也促进了大豆肽的研究与开发。

大豆多肽产品带有不同程度的苦味会直接影响食品的风味，给人们食用时会有一些“不愉快”，也在一定程度上限制了它在食品工业中的推广应用。研究证实当疏水性氨基酸残基处于多肽链的外侧时多肽呈现苦味，而单个的疏水性氨基酸苦味却低的多，因此采用外切酶将疏水性氨基酸从多肽链末端切去可以有效地减少苦味。另外该氨肽酶与其他蛋白酶复合使用，可以大幅度提高蛋白质的水解度，在酱油酿造、干酪生产中，可以提高蛋白质的利用率，节约成本。在医学研究中，该氨肽酶可用作医学上的解毒剂，也可用作环境消毒剂，亮氨酸氨肽酶还可用作蛋白质序列测定的分子工具。

一株野生枯草芽孢杆菌zj016经过传统诱变育种和发酵过程优化，发酵产酶的酶活单位可达7000U/L。本发明对在野生枯草芽孢杆菌zj016基础上成功构建的高产亮氨酸氨肽酶的枯草芽孢杆菌工程菌，进一步进行发酵过程优化，采用培养基的预处理、培养基组成的调整、溶氧水平的控制等策略，使7L发酵罐产亮氨酸氨肽酶酶活得到大幅度提高，达到200000U/L左右。

发明内容

本发明是利用一株高产亮氨酸氨肽酶的枯草芽孢杆菌工程菌，通过发酵培养、絮凝、过滤除菌、超滤浓缩、冷冻干燥等操作，获得固体亮氨酸氨肽酶，整个流程的收率为72.8%，酶粉酶活为7500 U/g，所得的固体酶的基本特性：最适温度50℃，温度稳定范围30～60℃，最适pH8.5，pH稳定范围6.0～9.5，存在一定的底物特异性，已发现其对多肽N端一种疏水的亮氨酸，一种碱性的精氨酸有较强水解作用。

本发明的技术方案：一种枯草芽孢杆菌工程菌发酵制备亮氨酸氨肽酶的方法，将该枯草芽孢杆菌工程菌接入种子培养基中，待长到对数生长期后，以2%的接种量接入发酵培养基中，发酵培养30h，收集发酵液，通过絮凝、过滤除菌、超滤浓缩和冷冻干燥操作，获得亮氨酸氨肽酶酶粉，工艺为：

A 枯草芽孢杆菌工程菌的发酵

（1）出发菌株：采用枯草芽孢杆菌工程菌：以重组质粒PMA5-SAP为出发菌株；

所述枯草芽孢杆菌Zj016，详见田亚平、须瑛敏：一种枯草芽孢杆菌氨肽酶的纯化及酶学性质[J]。食品与发酵工业，2006，32(3)：7-10。

枯草芽孢杆菌工程菌：重组质粒PMA5-SAP详见中国专利CN102492645A[一种高产氨肽酶的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用]，公布日2012.06.13。

（2）种子培养基以g/L计：蛋白胨10，酵母膏5，NaCl 10，以去离子水配制，控制pH7.4；

（3）发酵培养基以g/L计：可溶性淀粉6，豆粕18，酵母膏24，胰蛋白胨8，甘油0.2% V/V，K₂HPO₄·3H₂O 6，CoCl₂ 0.5mmol/L，硫酸卡那霉素50μg/mL，以去离子水配制，控制pH8.0。

（4）发酵条件：

摇瓶条件：接种量2%，装液量50mL/250mL，搅拌转速200r/min，温度37℃，培养时间34h；

发酵罐发酵条件：全自动式7L发酵罐，Bioflo 110、美国NBS公司，罐中装液量为4.5L，发酵温度37℃，接种量为2%V/V，搅拌转速300~600rpm，通气比为1.2∶1，罐压控制在0.06~0.08Mpa，溶氧与搅拌转速偶联，维持最低溶氧在30%，培养时间控制在30h；通过对原料预处理条件优化，控制溶氧水平，不时加消泡剂控制起泡策略，使发酵产酶水平得到进一步提高；

其中原料豆粕的预处理：

豆粕的适当水解：将豆粕与一定的水混匀，调节pH至7.5，中性蛋白酶用量为：中性蛋白酶300U/g豆粕，在40℃下，不停地搅拌，酶解1h；

B 亮氨酸氨肽酶的提取：

（1）发酵液的收集、絮凝过滤除菌：向发酵结束的发酵液中加入0.15%V/V的阳离子絮凝剂（美国凯米拉公司），在适宜的条件下絮凝，之后再以3g/L的量加入助滤剂硅藻土，混匀，过滤除去絮凝物及菌体，获得澄清发酵液；

（2）将得到的澄清发酵液进行超滤浓缩，浓缩倍数在4~10倍，获得较纯的浓缩液，所选用的超滤膜截留分子量为30kDa；

（3）将浓缩液冷冻干燥，获得亮氨酸氨肽酶酶粉。

所得亮氨酸氨肽酶的基本特性：

A底物特异性

对收集获得的澄清发酵液进行底物的特异性研究，发现其无内切型蛋白酶活性（酸性、中性和碱性蛋白酶），仅具有外切氨肽酶活性，并存在一定的特异性，对N末端为亮氨酸这种疏水氨基酸及精氨酸这种碱性氨基酸的多肽有较强水解作用。

B酶学特性

最适温度50℃，温度稳定范围为30～60℃；最适pH8.5，pH稳定范围为6.0～9.5。

C金属离子影响

通过向发酵液中添加不同金属离子，发现Co²⁺对该酶有较强的激活作用，Mg²⁺、K⁺、Na⁺对该酶酶活的影响较小，其中Zn²⁺、Fe²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺有一定程度的抑制。

酶活测定方法：

采用LNA法，测定时，首先加入一定量的Tris-HCl缓冲液和底物（L-亮氨酸-对硝基苯胺 L-leu-pNA），然后再加入稀释一定倍数的粗酶液，在50℃水浴反应10min后，405nm比色测定酶活。

酶活力定义：在水浴50℃下，每分钟分解L-亮氨酸-对硝基苯胺产生1μmol的对硝基苯胺所需酶量，定义为一个酶活单位。

本发明的有益效果：本发明对在野生枯草芽孢杆菌zj016基础上构建的高产亮氨酸氨肽酶的枯草芽孢杆菌工程菌PMA5-SAP，进一步进行发酵过程优化，采用培养基的预处理、培养基组成的调整、溶氧水平的控制等策略，使7L发酵罐产亮氨酸氨肽酶酶活得到大幅度提高，发酵产酶又从7000U/L酶活单位提高到200000U/L左右。

附图说明

图1亮氨酸氨肽酶的制备流程。

具体实施方式

实施例1

将枯草芽孢杆菌工程菌：重组质粒PMA5-SAP由甘油管接入种子液中，经扩大培养后，再按接种量2%接入4.5L发酵培养基中，发酵罐为全自动式7L发酵罐，Bioflo 110、美国NBS公司，发酵培养基组成如说明书所述。发酵培养基初始pH8.0，培养温度37℃，搅拌转速300～600rpm，通气量1.2∶1，罐压维持在0.06-0.08MPa，最低DO控制在30%，DO与转速相偶联，培养30h。发酵结束后，获得发酵液4.2L，向该发酵液中添加6.3mL阳离子絮凝剂（美国凯米拉公司），在20～30℃温度下，不断搅拌，开始快速搅拌使絮凝剂与发酵液混合均匀，之后缓慢搅拌，使其形成絮凝体，再加入12.6g助滤剂硅藻土，混合均匀后，过滤获得澄清发酵液3.8L，接着选用30kDa的超滤膜浓缩，最终获得浓缩发酵液0.8L，浓缩倍数为4.75，最后再将浓缩发酵液冷冻干燥，获得固体亮氨酸氨肽酶36g，酶活单位为7500 U/g。

Claims (1)

1.一种枯草芽孢杆菌工程菌发酵制备亮氨酸氨肽酶的方法，其特征在于：将该枯草芽孢杆菌工程菌接入种子培养基中，待长到对数生长期后，以2%的接种量接入发酵培养基中，发酵培养30h，收集发酵液，通过絮凝、过滤除菌、超滤浓缩和冷冻干燥操作，获得亮氨酸氨肽酶酶粉，工艺为：

A 枯草芽孢杆菌工程菌的发酵

（1）出发菌株：采用枯草芽孢杆菌工程菌：以重组质粒PMA5-SAP为出发菌株；

重组质粒PMA5-SAP详见中国专利CN102492645A；

（2）种子培养基以g/L计：蛋白胨10，酵母膏5，NaCl 10，以去离子水配制，控制pH 7.4；

（3）发酵培养基以g/L计：可溶性淀粉6，豆粕18，酵母膏24，胰蛋白胨8，甘油0.2% V/V，K₂HPO₄·3H₂O 6，CoCl₂ 0.5mmol/L，硫酸卡那霉素 50μg/mL，以去离子水配制，控制pH8.0；

（4）发酵条件：

摇瓶条件：接种量2%，装液量50mL/250mL，搅拌转速200r/min，温度37℃，培养时间34h；

发酵罐发酵条件：7L发酵罐，罐中装液量为4.5L，发酵温度37℃，接种量为2%V/V，搅拌转速300~600rpm，通气比为1.2∶1，罐压控制在0.06~0.08Mpa，溶氧与搅拌转速偶联，维持最低溶氧在30%，培养时间控制在30h；通过对原料预处理条件优化，控制溶氧水平，不时加消泡剂控制起泡策略，使发酵产酶水平得到进一步提高；

其中原料豆粕的预处理：

豆粕的适当水解：将豆粕与一定的水混匀，调节pH至7.5，中性蛋白酶用量为：中性蛋白酶300U/g豆粕，在40℃下，不停地搅拌，酶解1h；

B 亮氨酸氨肽酶的提取：

（1）发酵液的收集、絮凝过滤除菌：向发酵结束的发酵液中加入0.15%V/V的阳离子絮凝剂，进行絮凝，之后再以3g/L的量加入助滤剂硅藻土，混匀，过滤除去絮凝物及菌体，获得澄清发酵液；

（2）将得到的澄清发酵液进行超滤浓缩，浓缩倍数在4~10倍，获得较纯的浓缩液，所选用的超滤膜截留分子量为30kDa；

（3）将浓缩液冷冻干燥，获得亮氨酸氨肽酶酶粉。

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