CN106173187A - 一种含有蛋白酶活力的植物蛋白水解物的制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种含有蛋白酶活力的植物蛋白水解物的制备方法与应用。将植物蛋白与5‑10倍重量水混合均匀，经蛋白酶酶解后，干燥，得到含有蛋白酶活力的植物蛋白水解物。得到的含有蛋白酶活力的植物蛋白水解物作为氮源应用于固态制曲，可显著提高酱油大曲的氨肽酶活力。

Description

一种含有蛋白酶活力的植物蛋白水解物的制备方法与应用
技术领域
本发明属于食品生物技术领域，涉及利用植物蛋白生产蛋白水解液的方法及应用，更具体涉及一种具有提高酱油大曲氨肽酶活力的植物蛋白水解物的制备方法及应用。
背景技术
酱油制曲过程中米曲霉除了分泌内切蛋白酶外，也分泌外切蛋白酶，如氨肽酶和羧肽酶。其中氨肽酶具有耐盐性高，热稳定性好等特点，是酱油发酵的重要酶制剂。目前国内关于氨肽酶的研究主要集中在利用地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等微生物发酵生产氨肽酶，鲜见利用蛋白酶解物提高酱油制曲过程中大曲的氨肽酶活力报道。
日本化学研究株式会社公开了一种有效生产氨肽酶的方法（200880114122.6）。该方法包括以下步骤：或用一种氨肽酶基因和一种中性蛋白酶基因转化入宿主细菌，或用氨肽酶基因转化一部分宿主细菌，而用中性蛋白酶基因转化另一部分宿主细菌；在培养基中培养用氨肽酶基因和中性蛋白酶基因转化了的宿主细菌或用氨肽酶基因转化的宿主细菌和用中性蛋白酶基因转化的宿主细菌的混合物，以表达氨肽酶和中性蛋白酶基因，回收由培养混合物中产生的氨肽酶。
河南理工大学公开了一种产氨肽酶菌株Bacillus axarquiensis SWJSX8及其应用（201610072276.X）。所述产氨肽酶菌株Bacillus axarquiensis SWJSX8于2015年6月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.10974。本发明筛选得到深海来源的产氨肽酶的菌株Bacillus axarquiensis SWJSX8，其培养条件简单，遗传性质稳定，所产氨肽酶有较强的底物特异性。该菌株可能成为新型氨肽酶的生产菌种或提供新的氨肽酶编码基因。具有良好的研究及应用前景。
华南理工大学公开了一种地衣芽孢杆菌在产氨肽酶中的应用（专利申请201610072278.9）。所述地衣芽孢杆菌为Bacillus licheniformis SWJS33，于2013年3月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.7388。该菌株可应用于发酵生产氨肽酶，所得氨肽酶的最适温度为60℃，最适pH为8.0～8.5，对N端为亮氨酸的肽键具有水解特异性。
华南理工大学公开了一株蜡状芽孢杆菌及其在产氨肽酶中的应用（专利申请号201510100394.2）。该深海来源的产氨肽酶的蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus SWJS 54），于2014年9月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo. 9697。该菌株所产氨肽酶的最适反应温度为60℃，温度不高于55℃保温30min活性基本不变；最适反应pH=9.5，在pH=5-10的范围内有较好的稳定性。该酶对N端为亮氨酸及甲硫氨酸的肽键有较强的水解能力，属于亮氨酸氨肽酶。可与内切酶协同作用以提高蛋白酶解利用率、蛋白酶解液脱苦、制备生物活性肽等。
江南大学公开了一种用枯草芽孢杆菌发酵制备脱苦氨肽酶的方法及应用，属于酶制剂、食品添加剂技术领域。这一发明涉及利用枯草芽孢杆菌ZJ016发酵生产，发酵液通过乙醇分级沉淀，获得氨肽酶制品；本发明还涉及这种氨肽酶的应用，这种氨肽酶与碱性蛋白酶协同水解大豆分离蛋白，水解4H水解度(DH)可达25.03%，且水解液无苦味，能很好地解决了用其它酶生产大豆肽易产生苦味的难题。
味之素株式会社公开了一种有效分解在其序列中包含谷氨酸或天冬氨酸的低分子量肽的氨肽酶以及用所述氨肽酶水解肽或蛋白质的方法（专利申请号97109542.6）。氨肽酶GX来自萌发的大豆子叶，并且从含有谷氨酸或天冬氨酸的肽或蛋白质的N末端释放谷氨酸或天冬氨酸，以及使用该氨肽酶水解肽或蛋白质的方法。
上述专利中，未见利用植物蛋白水解物提高酱油大曲氨肽酶活力的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的上述不足，提供一种含有蛋白酶活力的植物蛋白水解物的制备方法与应用。制得含有蛋白酶活力的植物蛋白水解物具有提高红曲菌发酵液色价、提高酱油大曲氨肽酶活力的作用，应用于酱油制曲。
一种含有蛋白酶活力的植物蛋白水解物的制备方法：
以植物蛋白为原料，与质量为植物蛋白5-10倍的水混合均匀后，添加蛋白酶进行酶解，使植物蛋白的水解度达到10-20%，干燥，得到含有蛋白酶活力的植物蛋白水解物。
进一步地，所述植物蛋白为谷朊粉、大豆粉和大豆粕中的一种以上。
进一步地，所述蛋白酶包括内切蛋白酶和外切蛋白酶中的一种以上。
更进一步地，所述内切蛋白酶选来自猪胰脏、牛胰脏、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、芽孢杆菌属(Bacillus spp.)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、酱油曲霉(Aspergillus sojae)、曲霉属(Aspergillus spp.)、雪白根霉(Rhizopusniveus)、番木瓜、菠萝、凤梨科或无花果属物种的内切蛋白酶。
更进一步地，所述外切蛋白酶选来自米曲霉、酱油曲霉或曲霉属的外切蛋白酶。
进一步地，得到的含有蛋白酶活力的植物蛋白水解物中，蛋白酶活力大于200 U/g。
进一步地，得到的含有蛋白酶活力的植物蛋白水解物中，蛋白酶活力的测定方法为福林-酚试剂法。
进一步地，所述酶解的温度为45-60℃，pH值为5.0-8.0。
由上述任一项所述制备方法制得的含有蛋白酶活力的植物蛋白水解物在酱油制曲中的应用，将含有蛋白酶活力的植物蛋白水解物作为氮源进行酱油制曲。
本发明与现有技术相比，具有如下优点：
（1）将含有蛋白酶活力的植物蛋白水解物作为氮源进行酱油制曲时，酱油大曲的氨肽酶活力可提高10%以上。
（2）将含有蛋白酶活力的植物蛋白水解物作为氮源进行酱油制曲时，所得酱油大曲应用于酱油液态发酵，原油的氨态氮含量可以提高2%以上，总氮含量无明显影响。
具体实施方式
通过下述实施例将更详细地说明本发明。
蛋白酶活力的测定：GB/T 28715-2012。
水解度的测定：未经离心处理的酶解液中氨基酸态氮的含量/未经离心处理的酶解液中总氮的含量*100%。
实施例1
100g谷朊粉、100g大豆粉和100g大豆粕分别与10倍重量水混合，pH值在8.0，分别添加0.5g的Alcalase和1g风味蛋白酶，45℃水解4和8小时后，喷雾干燥，得含蛋白酶活力植物蛋白水解物。
植物蛋白的水解度与水解时间的关系如表1所示，植物蛋白水解物的酶活力与水解时间的关系如表2所示。
表1 植物蛋白的水解度与水解时间
原料 谷朊粉水解度 大豆粉水解度 大豆粕水解度
水解时间4h 13.6 10.3 12.7
水解时间8h 19.9 15.2 16.5
表2 植物蛋白水解物的酶活力与水解时间
原料 谷朊粉酶解物的酶活力 大豆粉酶解物的酶活力 大豆粕酶解物的酶活力
水解时间4h 312.65 244.53 294.36
水解时间8h 280.41 208.39 241.31
由表1和表2可见，谷朊粉、大豆粉和大豆粕经过蛋白酶水解4和8h后，水解度在10-20%之间，喷雾干燥后，得到的酶解物的蛋白酶活力均在200U/g以上。
实施例2
（1）1kg份豆粕经125℃蒸煮5min，与300g份面粉混合，冷却后接种豆粕重量0.03%（w/w）的米曲霉曲精，分别添加0.03wt%的谷朊粉酶解物或大豆粉酶解物（实施例1，分别水解4h和8h），培养的温度为28℃，湿度为95%，培养时间为40h，得酱油大曲；空白样为不添加酶解物。
分别测定酱油大曲的氨肽酶活力和蛋白酶活力，结果如表3所示。
（2）将酱油大曲与2.5倍重量20%（g/g）的盐水混合，采用高盐稀态酱油酿造方法（GB18186-2000）发酵90天后，压榨、过滤，得到酱油原液，并分别测定酱油原液的氨态氮量和总氮量，结果如表4所示。
表3 酱油大曲的氨肽酶活力和蛋白酶活力
大曲蛋白酶活力(U/g) 大曲氨肽酶活力(U/g)
空白 2000 110
谷朊粉酶解物（水解4h） 1539 125
谷朊粉酶解物（水解8h） 1645 131
大豆粉酶解物（水解4h） 1711 128
大豆粉酶解物（水解8h） 1668 139
由表3可见，添加谷朊粉酶解物或大豆粉酶解物后，酱油大曲的蛋白酶活力降低了15%~20%，但氨肽酶活力提高了10%以上。
表4 酱油原液的氨态氮量和总氮量
酱油原液的氨态氮含量（g/100g） 酱油原液的总氮含量（g/100g）
空白 0.95 1.58
谷朊粉酶解物（水解4h） 0.97 1.58
谷朊粉酶解物（水解8h） 0.98 1.59
大豆粉酶解物（水解4h） 0.98 1.60
大豆粉酶解物（水解8h） 0.98 1.58
由表4可见，添加谷朊粉酶解物或大豆粉酶解物后，酱油原液的氨肽酶活力提高2%以上；此外，尽管酱油大曲的蛋白酶活力下降了15%~20%，但发酵酱油原液的总氮含量几乎没有变化，这表明酱油制曲过程中产生了过量的蛋白酶。
实施例3
100g谷朊粉与5倍重量水混合，调整溶液的pH值分别为5.0和6.5，添加谷朊粉重量0.6%的木瓜蛋白酶（50万U/g）和1.0%复合蛋白酶（Protamex），分别在45℃，50℃，55℃和60℃水解8小时后，喷雾干燥，得含有蛋白酶活力的植物蛋白水解物。
实施例4
100g谷朊粉与5倍重量水混合，调整溶液的pH值分别为5.0和6.5，添加谷朊粉重量0.6%的木瓜蛋白酶（50万U/g）和1.0%复合蛋白酶（Protamex），分别在45℃，50℃，55℃和60℃水解8小时后，95℃保持10min灭酶，喷雾干燥，得植物蛋白水解物。
将实施例3和实施例4所得植物蛋白水解物测定蛋白酶活力，结果见表5。
表5 实施例3和实施例4所的植物蛋白水解物的蛋白酶活力（U/g）
原料 水解温度45℃ 水解温度50℃ 水解温度55℃ 水解温度60℃
实施例3 465 588 395 387
实施例4 0 0 0 0
由表5可见，未经过灭酶处理的植物蛋白水解物（实施例3），其蛋白酶活力均在300 U/g以上，而经过灭酶处理的植物蛋白水解物（实施例4）未检测到蛋白酶活力。
将实施例3和实施例4所得到的植物蛋白水解物按大曲重量0.04%添加到大曲中，制曲48h后发现实施例3所得到的酱油大曲的氨肽酶活力提高了10%以上；而实施例4所得到的酱油大曲的氨肽酶活力未见明显变化。
采用高盐稀态酱油酿造方法（GB18186-2000）发酵90天后，发现实施例3所得到的酱油原液的氨态氮含量提高了2%-3%；实施例4所得到的酱油原液的氨态氮含量未见明显变化。

Claims (9)

1.一种含有蛋白酶活力的植物蛋白水解物的制备方法，其特征在于：以植物蛋白为原料，与质量为植物蛋白5-10倍的水混合均匀后，添加蛋白酶进行酶解，使植物蛋白的水解度达到10-20%，干燥，得到含有蛋白酶活力的植物蛋白水解物。
2.根据权利要求1所述的一种含有蛋白酶活力的植物蛋白水解物的制备方法，其特征在于，所述植物蛋白为谷朊粉、大豆粉和大豆粕中的一种以上。
3.根据权利要求1所述的一种含有蛋白酶活力的植物蛋白水解物的制备方法，其特征在于，所述蛋白酶包括内切蛋白酶和外切蛋白酶中的一种以上。
4.根据权利要求3所述的一种含有蛋白酶活力的植物蛋白水解物的制备方法，其特征在于，所述内切蛋白酶选来自猪胰脏、牛胰脏、枯草芽孢杆菌、芽孢杆菌属、米曲霉、酱油曲霉、曲霉属、雪白根霉、番木瓜、菠萝、凤梨科或无花果属物种的内切蛋白酶。
5.根据权利要求3所述的一种含有蛋白酶活力的植物蛋白水解物的制备方法，其特征在于，所述外切蛋白酶选来自米曲霉、酱油曲霉或曲霉属的外切蛋白酶。
6. 根据权利要求1所述的一种含有蛋白酶活力的植物蛋白水解物的制备方法，其特征在于，得到的含有蛋白酶活力的植物蛋白水解物中，蛋白酶活力大于200 U/g。
7.根据权利要求1所述的一种含有蛋白酶活力的植物蛋白水解物的制备方法，其特征在于，得到的含有蛋白酶活力的植物蛋白水解物中，蛋白酶活力的测定方法为福林-酚试剂法。
8.根据权利要求1所述的一种含有蛋白酶活力的植物蛋白水解物的制备方法，其特征在于，所述酶解的温度为45-60℃，pH值为5.0-8.0。
9.由权利要求1-8任一项所述制备方法制得的含有蛋白酶活力的植物蛋白水解物在酱油制曲中的应用，其特征在于，将含有蛋白酶活力的植物蛋白水解物作为氮源进行酱油制曲。
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