CN110663813B - 一种鱼粉微生物发酵及酶解方法 - Google Patents

一种鱼粉微生物发酵及酶解方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于饲料技术领域，公开了一种鱼粉微生物发酵及酶解方法。本发明的鱼粉微生物发酵及酶解方法包括以下步骤：(1)将枯草芽孢杆菌/地衣芽孢杆菌接种至培养基中，在25‑35℃活化培养36‑60h作为种子液；(2)将鱼粉称取至培养瓶中加水，并调节初始pH为5‑7，灭菌后作为鱼粉培养基放置待用；(3)将活化后的枯草芽孢杆菌/地衣芽孢杆菌种子液接入鱼粉培养基中，在25‑35℃，搅拌速率100‑300r/min条件下培养；(4)经步骤(3)培养66‑78h后加入木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、中性蛋白酶或碱性蛋白酶进行酶解。该方法先发酵，再酶解，通过工艺优化和菌种、酶的筛选，获得一种水解率高、利于消化、生物活性高的鱼粉。

Description

一种鱼粉微生物发酵及酶解方法
技术领域
本发明涉及饲料技术领域，具体是涉及一种鱼粉微生物发酵及酶解方法。
背景技术
我国饲料行业历史悠久，近年来社会需求的不断增加，食品、畜牧行业的快速发展以及人民对优质畜产品的强烈要求，不断刺激着对优质蛋白饲料的需求。蛋白质作为水产饲料中的主要营养物质，是影响饲料成本的关键因素。大多数水产动物，尤其是肉食性鱼类对饲料中的蛋白质含量要求较高(40％-50％)。鱼粉用一种或多种鱼类为原料，经去油、脱水、粉碎加工后的高蛋白质饲料原料，因富含蛋白质、ω-3不饱和脂肪酸，碳水化合物含量低，具有良好的适口性以及较高的消化吸收率等特点，一直以来都是水产饲料中应用最广泛的优质蛋白源，来自渔业和水产养殖业的大量富含蛋白质的副产品被丢弃或加工成的鱼粉。
然而，但现有鱼粉的消化利用率相对较低，而采用微生物发酵工艺可以将鱼粉中的大分子蛋白质水解产生低分子量肽和游离氨基酸，使产物的消化率及生物活性提高，因此开发一种可以改善和提高鱼粉蛋白利用率和转化率的技术对于提高饲料的消化率，促进畜禽生长具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是为了克服上述背景技术的不足，提供一种鱼粉微生物发酵及酶解方法，该方法先发酵，再酶解，通过工艺优化和菌种、酶的筛选，获得一种水解率高、利于消化、生物活性高的鱼粉。
为达到本发明的目的，本发明的鱼粉微生物发酵及酶解方法包括以下步骤：
(1)将枯草芽孢杆菌/地衣芽孢杆菌接种至培养基中，在25-35℃活化培养36-60h作为种子液；
(2)将鱼粉称取至培养瓶中加水，并调节初始pH为5-7，灭菌后作为鱼粉培养基放置待用；
(3)将活化后的枯草芽孢杆菌/地衣芽孢杆菌种子液接入鱼粉培养基中，在25-35℃，搅拌速率100-300r/min条件下培养；
(4)经步骤(3)培养66-78h后加入木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、中性蛋白酶或碱性蛋白酶进行酶解。
进一步地，所述步骤(1)中培养基为LB液体培养基。
进一步地，所述步骤(1)中活化培养时控制搅拌速率为100-300r/min。
进一步地，所述步骤(1)中培养至菌体浓度达到108CFU/mL。
优选地，所述步骤(1)中在30℃条件下活化。
进一步地，所述步骤(2)中鱼粉和水的固液质量比为1：8-1：24。
优选地，当步骤(1)接种的是枯草芽孢杆菌时，所述步骤(2)中鱼粉和水的固液质量比为1：20-1：24；当步骤(1)接种的是地衣芽孢杆菌时，所述步骤(2)中鱼粉和水的固液质量比为1：8-1：20。
优选地，所述步骤(2)中使用NaOH和HCl调节pH。
进一步优选地，所述步骤(2)中调节pH值为6。
进一步地，所述步骤(3)中接入鱼粉培养基中的种子液接种量为5-25％。
所述接种量是指移入种子液的体积和接种后培养液体积的比例。
优选地，当步骤(1)接种的是枯草芽孢杆菌时，所述步骤(3)中接入鱼粉培养基中的种子液接种量为5-20％；当步骤(1)接种的是地衣芽孢杆菌时，所述步骤(3)中接入鱼粉培养基中的种子液接种量为6-10％。
优选地，所述步骤(4)中加入木瓜蛋白酶或风味蛋白酶进行酶解。
本发明鱼粉微生物发酵及酶解方法先发酵，再酶解，可杀灭鱼粉中细菌、真菌等有害微生物，消除鱼粉产品的特异气味，将鱼粉中的大分子蛋白质水解成为低分子量肽和游离氨基酸，显著提高了氨基酸的吸收利用率，改善了鱼粉蛋白的品质，可提高饲料的消化率。
附图说明
图1是本发明实施例1枯草芽孢杆菌发酵鱼粉工艺优化中固液比优化效果图，具体是枯草芽孢杆菌发酵鱼粉固液比对水解度的影响；
图2是本发明实施例1枯草芽孢杆菌发酵鱼粉工艺优化中接种量优化效果图，具体是枯草芽孢杆菌发酵鱼粉接种量对水解度的影响；
图3是本发明实施例1枯草芽孢杆菌发酵鱼粉工艺优化中初始pH优化效果图，具体是枯草芽孢杆菌发酵鱼粉初始pH对水解度的影响；
图4是本发明实施例1枯草芽孢杆菌发酵鱼粉工艺优化中发酵温度优化效果图，具体是枯草芽孢杆菌发酵鱼粉不同温度对水解度的影响；
图5是本发明实施例2地衣芽孢杆菌发酵鱼粉工艺优化中固液比优化效果图，具体是地衣芽孢杆菌发酵鱼粉固液比对水解度的影响；
图6是本发明实施例2地衣芽孢杆菌发酵鱼粉工艺优化中接种量优化效果图，具体是地衣芽孢杆菌发酵鱼粉接种量对水解度的影响；
图7是本发明实施例2地衣芽孢杆菌发酵鱼粉工艺优化中初始pH优化效果图，具体是地衣芽孢杆菌发酵鱼粉初始pH对水解度的影响；
图8是本发明实施例2地衣芽孢杆菌发酵鱼粉工艺优化中发酵温度优化效果图，具体是地衣芽孢杆菌发酵鱼粉温度对水解度的影响；
图9是本发明实施例3枯草芽孢杆菌发酵后酶解及混合发酵效果图，具体是枯草芽孢杆菌发酵鱼粉三天后加入木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶在不同时间的水解度变化；
图10是本发明实施例4地衣芽孢杆菌发酵后酶解及混合发酵效果图，具体是地衣芽孢杆菌发酵鱼粉四天后加入木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶在不同时间的水解度变化；
其中，papain是木瓜蛋白酶；flavourzyme是风味蛋白酶；neutral proteinase是中性蛋白酶；alcalase是碱性蛋白酶。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。应当理解，以下描述仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1至5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
而且，本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明中鱼粉微生物发酵及酶解方法包括以下步骤：
(1)将枯草芽孢杆菌/地衣芽孢杆菌接种至LB液体培养基中，控制搅拌速率为100-300r/min，在25-35℃活化培养36-60h至菌体浓度达到108CFU/mL作为种子液；
(2)将鱼粉称取至培养瓶中加水，其中鱼粉和水的固液质量比为1：8-1：24，使用1MNaOH和1M HCl调节初始pH为5-7，灭菌后作为鱼粉培养基放置待用；
(3)将活化后的枯草芽孢杆菌/地衣芽孢杆菌种子液接入鱼粉培养基中，在25-35℃，搅拌速率100-300r/min条件下培养；
(4)经步骤(3)培养66-78h后加入木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、中性蛋白酶或碱性蛋白酶进行酶解。
实施例中所用鱼粉为挪威鱼粉，固液比为1：20的鱼粉培养基pH即为6。根据国标GB/T 6432-2018测定粗蛋白含量61.02％，根据国标GB 5009124-2016测定氨基酸组成如表1所示。
表1所用挪威鱼粉氨基酸组成
氨基酸名称 含量/％
Asp 5.11
Thr 2.78
Ser 4.48
Glu 8.06
Gly 4.51
Ala 4.21
Cys 1.82
Val 3.67
Met 0.21
Ile 2.90
Leu 5.05
Tyr 2.10
Phe 3.10
His 1.82
Lys 3.92
Arg 3.95
Pro 3.94
Total 61.65
实施例1：枯草芽孢杆菌发酵鱼粉工艺优化
1.固液比的优化
枯草杆菌活化后以10％接种量分别接入固液比1∶24、1∶20、1∶16、1∶12、1∶8的鱼粉培养基，调节鱼粉培养基初始pH为6，30℃，200rpm培养，每隔24h取样测定水解度，每组设两个平行。发酵液离心(8000r/min，10min)取上清液测定氨基态氮(甲醛滴定法)及可溶蛋白(双缩脲法)。水解度(DH)的计算：
DH＝不同时间水解液中游离氨基酸含量/鱼粉培养基中总氨基态氮总蛋白含量*100％
结果如附图1所示，固液比1∶24的水解度最高，固液比1∶24与1∶20组的水解度相近，发酵4天后水解度的增长趋势有所变缓，发酵第6天固液比1∶24组水解度最高，达到38.94％。
2.接种量优化
枯草杆菌活化后以5％、10％、15％、20％、25％、30％接种量接入固液比1：20的鱼粉培养基，30℃，200rpm培养每隔24h取样测定水解度。每组设两个平行。水解度(DH)计算方法参照“固液比的优化”。
如附图2所示，当接种的是枯草芽孢杆菌时，接种量增加至5％后增加接种量对水解度增加并无帮助，接入鱼粉培养基中的种子液接种量可以选为5-20％。这可能是受底物浓度的限制，及溶氧量的影响。发酵三天后水解趋于稳定，此后有些许降低。
3.初始pH优化
枯草杆菌活化后，配制固液比为1：20的鱼粉培养基，以1M NaOH和1M HCl调培养基初始pH分别为5、6、7、8、9、10，灭菌，接种5％活化枯草菌液，30℃，200rpm培养每隔24h取样测定水解度。每组设两个平行。水解度(DH)计算方法参照“固液比的优化”。
如附图3所示，发酵至第二天水解度增长趋平，且水解度随初始pH升高而降低，发酵第2天初始pH5水解度40.86％，初始pH6水解度40.14％。由于培养基原始pH即为6，故选择pH6作为最优条件。
4.发酵温度优化
枯草杆菌活化后，配制固液比为1：20的鱼粉培养基，灭菌，接种5％活化枯草菌液，分别在20、30、37、40℃，200rpm培养，每隔24h取样测定水解度。每组设两个平行。水解度(DH)计算方法参照“固液比的优化”。
如附图4所示，发酵至第二天水解度增长趋平，枯草杆菌发酵在当前的几个温度条件下以30℃水解效果最佳。
实施例2：地衣芽孢杆菌发酵鱼粉工艺优化
1.固液比的优化
地衣芽孢杆菌活化后，以5％接种量分别接入固液比1：20、1：16、1：12、1：8、1：4的鱼粉培养基，调节鱼粉培养基初始pH为6，30℃，200rpm培养，每隔24h取样测定水解度，每组设两个平行。发酵液离心(8000r/min，10min)取上清液测定氨基态氮(甲醛滴定法)及可溶蛋白(双缩脲法)。水解度(DH)的计算：
DH＝不同时间水解液中游离氨基酸含量/鱼粉培养基中总氨基态氮总蛋白含量*100％
结果如附图5所示，固液比1:12组在发酵三天后水解度达到最高，三天后固液比1:12、1:16、1:20组水解度有所下降，且发酵过程可溶蛋白减少而氨基态氮含量增加，发酵过程中地衣芽孢杆菌不断把可溶蛋白分解为氨基态氮。固液比1:12在发酵第三天水解度达到49.02％。
2.接种量优化
地衣芽孢杆菌活化后，分别以接种量2％、4％、6％、8％、10％接入固液比为1:12的鱼粉培养基，30℃，200rpm下培养。每组设两个平行，每隔24h取样测定水解度。水解度(DH)计算方法参照“固液比的优化”。
如附图6所示，随着接种量的增加水解度呈现不断增加的趋势，发酵三天后接种量2％及4％组的水解度有所下降而接种量大的其他三组水解度仍呈增长趋势，发酵五天水解度增长放缓。以接种量10％水解效果最好。
3.初始pH优化
地衣芽孢杆菌活化后，以5％接种量接入固液比为1:12的鱼粉培养基，以1M NaOH和1M HCl调培养基初始pH分别为5、6、7、8、9，灭菌，30℃，200rpm培养每隔24h取样测定水解度。每组设两个平行。水解度(DH)计算方法参照“固液比的优化”。
如附图7所示，虽然发酵至三天时初始pH5、7、8组水解度高于pH6组，但差别不大，发酵至第五天时初始pH5和pH9的水解度仍在增长，但是综合考虑，由于测得培养基初始pH为6，使用原始pH，发酵三天时水解度45.88％。
4.发酵温度优化
地衣芽孢杆菌活化后，以接种量8％接入固液比为1:12的鱼粉培养基，分别在20℃、25℃、30℃、33℃、37℃，200rpm下培养。水解度(DH)计算方法参照“固液比的优化”。
如附图8所示，随着接种量的增加水解度呈现不断增加的趋势，发酵三天后水解度增长平缓，发酵过程中总蛋白的含量基本不变而可溶蛋白含量随时间减少游离氨基酸含量逐渐增加。
实施例3：枯草芽孢杆菌发酵后酶解及混合发酵
枯草芽孢杆菌活化后，以接种量10％接入固液比为1:12的鱼粉培养基，分为5组，1-4组在30℃，200rpm下培养三天后分别加入木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶和风味蛋白酶1000U/mL在50℃，200rpm水浴摇床振荡反应，每隔一小时取样测定水解度；第5组发酵三天后灭菌，加入10％地衣芽孢杆菌发酵，每隔24h取样测定水解度。每组设两个平行。水解度(DH)计算方法参照前述“固液比的优化”。
经试验，两种菌协同发酵(5％，5％)在发酵第二天时水解度达到40.68％，而枯草芽孢杆菌发酵三天后接入10％活化的地衣芽孢杆菌液，再发酵三天后水解度28.23％，效果不如两种菌协同发酵效果好。如附图9所示，先用枯草芽孢杆菌发酵的效果不太好，发酵后酶解效率更高，其中以风味蛋白酶效果最佳。
实施例4：地衣芽孢杆菌发酵后酶解及混合发酵
地衣芽孢杆菌活化后，以接种量10％接入固液比为1:12的鱼粉培养基，分为5组，1-4组在30℃，200rpm下培养三天后分别加入木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶和风味蛋白酶1000U/mL在50℃，200rpm水浴摇床振荡反应，每隔一小时取样测定水解度；第5组发酵三天后灭菌，加入10％枯草芽孢杆菌发酵，每隔24h取样测定水解度。每组设两个平行。
地衣芽孢杆菌发酵四天后灭菌接入10％的枯草芽孢杆菌，再发酵三天水解度26.27％，低于只用地衣芽孢杆菌发酵五天的水解度，而两种菌协同发酵(5％，5％)在发酵第二天时水解度达到40.68％。如附图10所示，先用地衣芽孢杆菌发酵，再酶解效率更高，其中以风味蛋白酶效果最佳。且发酵四天后加入风味蛋白酶酶解12h水解度61.47％，远高于先用枯草芽孢杆菌发酵后酶解的效率。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的实例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种鱼粉微生物发酵及酶解方法，其特征在于，所述鱼粉微生物发酵及酶解方法包括以下步骤：
（1）将地衣芽孢杆菌接种至培养基中，在25-35℃活化培养36-60 h作为种子液；
（2）将鱼粉称取至培养瓶中加水，并调节初始pH为5-7，灭菌后作为鱼粉培养基放置待用；
（3）将活化后的地衣芽孢杆菌种子液接入鱼粉培养基中，在25-35℃，搅拌速率100-300r/min条件下培养；
（4）经步骤（3）培养4天后加入风味蛋白酶进行酶解；
所述步骤（2）中鱼粉和水的固液质量比为1：8-1：20；所述步骤（3）中接入鱼粉培养基中的种子液接种量为6-10%。
2.根据权利要求1所述的鱼粉微生物发酵及酶解方法，其特征在于，所述步骤（1）中培养基为LB液体培养基。
3.根据权利要求1所述的鱼粉微生物发酵及酶解方法，其特征在于，所述步骤（1）中活化培养时控制搅拌速率为100-300 r/min。
4.根据权利要求1所述的鱼粉微生物发酵及酶解方法，其特征在于，所述步骤（1）中培养至菌体浓度达到108 CFU/mL。
5.根据权利要求1所述的鱼粉微生物发酵及酶解方法，其特征在于，所述步骤（1）中在30℃条件下活化。
6.根据权利要求1所述的鱼粉微生物发酵及酶解方法，其特征在于，所述步骤（2）中使用NaOH和 HCl调节pH。
7.根据权利要求1所述的鱼粉微生物发酵及酶解方法，其特征在于，所述步骤（2）中调节pH值为6。
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