CN102823731A - 一种饲用复合小肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种饲用复合小肽的制备方法，包括如下步骤：1）将蛋白原料、碳源和水配制成培养液，灭菌；2）将芽孢菌和蛋白酶接到灭菌后的培养液中，酶解发酵或发酵酶解，得到小肽发酵液；3）将小肽发酵液干燥，得到饲用复合小肽。本发明方法制备得到的复合小肽分子量主要集中在238～568Da，约2～5肽。小肽得率占蛋白质含量的35%以上。复合小肽风味独特、口感好，可用作饲料添加剂，提高动物动物体的生产性能。
Description
技术领域
本发明涉及一种饲用复合小肽的制备方法。
背景技术
小肽（Peptides）是由两个以上的氨基酸组成，有二肽到多肽之分。小肽作为蛋白质的主要消化产物，在氨基酸消化、吸收以及动物营养代谢中起着重要的作用。研究表明，小肽和氨基酸的混合物在人体的吸收率和吸收速度都比单纯氨基酸佳，不仅如此，小肽还能在肠道内保护易被破坏的氨基酸。此外，单纯的氨基酸在体内根据需要新组成肽和蛋白质，而小肽和氨基酸的混合物可省去一部分重新组合的过程，因此，它的生物效价更高。
小肽可促进动物对矿物元素的吸收利用，其促进作用主要来源于酪蛋白肽的水解产物，由酶解酪多聚谷蛋白获得的肽可结合和运输二价矿物离子。小肽的氨基酸残基可与金属离子螯合，可以避免肠腔中颉颃因子及其他影响因子对矿物元素的沉淀或吸附作用，直接到达小肠刷状缘，并在吸收位点处发生水解，从而增加矿物质元素的吸收。
小肽具有生理调节作用。它可以通过诱导小肠中一些酶活性的提高，而使小肠消化功能发育提前，促进动物体对营养物质的消化吸收，从而提高动物体的免疫机能和生产性能。
发明内容
本发明的目的在于提供一种饲用复合小肽的制备方法。
本发明所采用的技术方案是：
一种饲用复合小肽的制备方法，包括如下步骤：
1）将蛋白原料、碳源和水配制成培养液，灭菌；
2）将芽孢菌接种到灭菌后的培养液中，30～37℃下振荡培养18～30h后，加入蛋白酶，35～50℃，pH6.0～7.5，继续酶解6～12h，得到小肽发酵液；或者是：往培养液中加入蛋白酶，35～50℃，pH6.0～7.5，酶解6～12h后，接种芽孢菌，30～37℃下继续振荡培养18～30h，得到小肽发酵液；
3）将小肽发酵液干燥，得到饲用复合小肽。
蛋白原料为豆粕、大米蛋白粉、小麦蛋白粉、玉米蛋白粉、棉粕、花生粕、马铃薯蛋白、菜粕、大豆浓缩蛋白中的至少一种或几种组合。
碳源为葡萄糖、蔗糖、淀粉中的至少一种。
以上原料均可在原料市场购得。
每100ml培养液中，含有蛋白原料20～30g、碳源0.1～1g。
芽孢菌为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）或/和枯草芽孢杆菌（Bcillus subtilis）或/和纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）。
芽孢菌的接种浓度为5×107～10×107cfu/ml培养液。
蛋白酶为中性蛋白酶。
蛋白酶的加入量为400～700U/g蛋白原料。
本发明的有益效果在于：
本发明方法制备得到的复合小肽分子量主要集中在238～568Da，约2～5肽，小肽得率占蛋白质含量的35%以上。复合小肽风味独特、口感好，可用作饲料添加剂，提高动物动物体的生产性能。
附图说明
图1 是蛋白含量与吸光度值标准曲线图；
图2是标准蛋白的分子量和出峰时间曲线图
图3是小肽发酵液凝胶G-15洗脱图谱。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不仅限于此。
以下实施例中所用到的菌液按以下方法制备：
从斜面试管培养基中刮取一环地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）或枯草芽孢杆菌（Bcillus subtilis）或纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）菌种加入到液体培养基中，摇瓶培养。摇瓶种子培养基与培养条件为葡萄糖1%、酵母膏0.5%、蛋白胨0.5%、牛肉膏0.5%、食盐0.05%、磷酸二氢钾0.1%，pH=7.0-7.2、121℃灭菌18分钟。于32℃恒温摇床中，200r/min振荡培养24h，得到菌种液。
以上三个菌种购自广东省微生物菌种保藏中心，地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）和枯草芽孢杆菌（Bcillus subtilis）的编号分别为GIM1.8=AS1.518，GIM1.19=AS1.210。
以下实施例中所用到的中性蛋白酶购自肇东市日成酶制剂有限公司，商品型号为：AS.1398，酶活力为50000U/g。
实施例1
小肽复合物的制备方法1，包括如下步骤：
1）培养液的制备：将100kg粗蛋白含量为46%的豆粕，100kg粗蛋白含量为60%的大米蛋白粉，100kg粗蛋白含量为65%的大豆浓缩蛋白，4kg蔗糖，4kg葡萄糖，用水定容到 1000L，用盐酸或氢氧化钠调整反应液pH值到6.8，121℃灭菌18分钟；
2）小肽发酵液制备：将在32℃恒温摇床中，200r/min振荡培养24h后的地衣芽孢杆菌菌种液接入上述灭菌后的1000L培养液中，使培养液中菌体浓度约为5×107cfu/ml，30℃培养24小时后，加入盐酸或氢氧化钠调节培养基pH值为7.0，加入3kg中性蛋白酶（500U/g蛋白原料），45℃继续酶解10h，得到小肽发酵液；
3）将小肽发酵液置于80℃烘箱烘干至水分低于10%，粉碎，过40目筛，得饲用复合小肽。
实施例2
小肽复合物的制备方法2，包括如下步骤：
1）培养液的制备：将100kg粗蛋白含量为46%的豆粕，100kg粗蛋白含量为60%的大米蛋白粉，100kg粗蛋白含量为65%的大豆浓缩蛋白，8kg蔗糖，用水定容到 1000L，用盐酸或氢氧化钠调整反应液pH值到6.8，121℃灭菌18分钟；
2）小肽发酵液制备：将在32℃恒温摇床中，200r/min振荡培养24h后的枯草芽孢杆菌菌种液接入上述灭菌后的1000L培养液中，使培养液中菌体浓度约为5×107cfu/ml，30℃培养24小时后，加入盐酸或氢氧化钠调节培养基pH值为6.8，加入2.4kg中性蛋白酶（400U/g蛋白原料），43℃继续酶解12h，得到小肽发酵液；
3）将小肽发酵液置于80℃烘箱烘干至水分低于10%，粉碎，过60目筛，得饲用复合小肽。
实施例3
小肽复合物的制备方法3，包括如下步骤：
1）培养液的制备：将100kg粗蛋白含量为46%的豆粕，100kg粗蛋白含量为60%的大米蛋白粉，100kg粗蛋白含量为65%的大豆浓缩蛋白，6kg葡萄糖，用水定容到 1000L，用盐酸或氢氧化钠调整反应液pH值到6.8，121℃灭菌18分钟；
2）小肽发酵液制备：将在32℃恒温摇床中，200r/min振荡培养24h后的纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）菌种液接入上述灭菌后的1000L培养液中，使培养液中菌体浓度约为5×107cfu/ml，32℃培养24小时后，加入盐酸或氢氧化钠调节培养基pH值为6.8，加入3.6kg中性蛋白酶（600U/g蛋白原料），43℃继续酶解12h，得到小肽发酵液；
3）将小肽发酵液置于80℃烘箱烘干至水分低于10%，粉碎，过60目筛，得饲用复合小肽。
实施例4
小肽复合物的制备方法4，包括如下步骤：
1）培养液的制备：将100kg粗蛋白含量为46%的豆粕，100kg粗蛋白含量为60%的大米蛋白粉，100kg粗蛋白含量为65%的大豆浓缩蛋白，4kg蔗糖，4g葡萄糖，用水定容到 1000L，用盐酸或氢氧化钠调整反应液pH值到6.8，121℃灭菌18分钟；
2）小肽发酵液制备：将在32℃恒温摇床中，200r/min振荡培养24h后的地衣芽孢杆菌菌种液和枯草芽孢杆菌菌种液接入上述灭菌后的1000L培养液中，使培养液中地衣芽孢杆菌菌体浓度约为5×107cfu/ml，枯草芽孢杆菌菌体浓度约为5×107cfu/ml，32℃培养24小时后，加入盐酸或氢氧化钠调节培养基pH值为6.8，然后加入4.2kg中性蛋白酶（700U/g蛋白原料），40℃继续酶解12h，得到小肽发酵液；
3）将小肽发酵液置于80℃烘箱烘干至水分低于10%，粉碎，过60目筛，得饲用复合小肽。
实施例5
小肽复合物的制备方法5，包括如下步骤：
1）培养液的制备：50kg粗蛋白含量为46%的豆粕，20kg粗蛋白含量为50%的玉米蛋白粉，30kg粗蛋白含量为35%菜粕，20kg粗蛋白含量为48%的花生粕，60kg粗蛋白含量为60%的大米蛋白粉，20kg粗蛋白含量为80%的小麦蛋白粉，100kg粗蛋白含量为65%的大豆浓缩蛋白，4kg蔗糖，4g葡萄糖，用水定容到 1000L，用盐酸或氢氧化钠调整反应液pH值到6.8，121℃灭菌18分钟；
2）小肽发酵液制备：将于32℃恒温摇床中，200r/min振荡培养24h的地衣芽孢杆菌菌种液接入上述灭菌后的1000L培养液中，使培养液中菌体浓度约为5×107cfu/ml，35℃培养24小时后，加入盐酸或氢氧化钠调节培养基pH值为7.0，加入3kg中性蛋白酶（500U/g蛋白原料），45℃继续酶解10h，得到小肽发酵液；
3）将小肽发酵液置于80℃烘箱烘干至水分低于10%，粉碎，过40目筛，得饲用复合小肽。
实施例6
小肽复合物的制备方法6，包括如下步骤：
1）培养液的制备：50kg粗蛋白含量为46%的豆粕，20kg粗蛋白含量为50%的玉米蛋白粉、15kg粗蛋白含量为35%菜粕、20kg粗蛋白含量为48%的花生粕，95kg粗蛋白含量为60%的大米蛋白粉，100kg粗蛋白含量为65%的大豆浓缩蛋白，8kg淀粉，用水定容到 1000L，用盐酸或氢氧化钠调整反应液pH值到6.8，用盐酸或氢氧化钠调整反应液pH值到6.8，121℃灭菌18分钟；
2）小肽发酵液制备：将在32℃恒温摇床中，200r/min振荡培养24h后的枯草芽孢杆菌菌种液接入上述灭菌后的1000L培养液中，使培养液中菌体浓度约为5~10×107cfu/ml，37℃培养24小时后，加入盐酸或氢氧化钠调节培养基pH值为6.8，加入2.4kg中性蛋白酶（400U/g蛋白原料），43℃继续酶解12h，得到小肽发酵液；
3）将小肽发酵液置于80℃烘箱烘干至水分低于10%，粉碎，过60目筛，得饲用复合小肽。
实施例7
小肽复合物的制备方法7，包括如下步骤：
1）培养液的制备：50kg粗蛋白含量为46%的豆粕，20kg粗蛋白含量为50%的玉米蛋白粉，15kg粗蛋白含量为35%菜粕，20kg粗蛋白含量为48%的花生粕，95kg粗蛋白含量为60%的大米蛋白粉，100kg粗蛋白含量为65%的大豆浓缩蛋白，4kg蔗糖，4kg葡萄糖，用水定容到 1000L，用盐酸或氢氧化钠调整反应液pH值到6.8，121℃灭菌18分钟；
2）小肽发酵液制备：将在32℃恒温摇床中，200r/min振荡培养24h后的纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）菌种液接入上述灭菌后的1000L培养液中，使培养液中菌体浓度约为5×107cfu/ml，32℃培养24小时后，加入盐酸或氢氧化钠调节培养基pH值为6.8，加入2.4kg中性蛋白酶（400U/g蛋白原料），43℃继续酶解12h，得到小肽发酵液；
3）将小肽发酵液置于80℃烘箱烘干至水分低于10%，粉碎，过60目筛，得饲用复合小肽。
实施例8
小肽复合物的制备方法8，包括如下步骤：
40kg粗蛋白含量为46%的豆粕，15kg粗蛋白含量为50%的玉米蛋白粉，15kg粗蛋白含量为35%菜粕，20kg粗蛋白含量为48%的花生粕，95kg粗蛋白含量为60%的大米蛋白粉，100kg粗蛋白含量为65%的大豆浓缩蛋白，15kg粗蛋白含量42%的棉粕，6kg葡萄糖，用水定容到 1000L，用盐酸或氢氧化钠调整反应液pH值到6.8，121℃灭菌18分钟；
2）小肽发酵液制备：将在32℃恒温摇床中，200r/min振荡培养24h后的地衣芽孢杆菌菌种液和枯草芽孢杆菌菌种液接入上述灭菌后的1000L培养液中，使培养液中地衣芽孢杆菌菌体浓度约为5×107cfu/ml，枯草芽孢杆菌菌体浓度约为5×107cfu/ml，32℃培养24小时后，加入盐酸或氢氧化钠调节培养基pH值为6.8，然后加入4.2kg中性蛋白酶（700U/g蛋白原料），40℃继续酶解12h，得到小肽发酵液；
3）将小肽发酵液置于80℃烘箱烘干至水分低于10%，粉碎，过60目筛，得饲用复合小肽。
实施例9
小肽复合物的制备方法9，包括如下步骤：
1）培养液的制备：将100kg粗蛋白含量为46%的豆粕，100kg粗蛋白含量为60%的大米蛋白粉、100kg粗蛋白含量为65%的大豆浓缩蛋白，8kg蔗糖，用水定容到 1000L，用盐酸或氢氧化钠调整反应液pH值到6.8，121℃灭菌18分钟；
2）小肽发酵液制备：灭菌结束，温度降到45℃后，加入4.2kg中性蛋白酶（700U/g蛋白原料），45℃酶解12h，得到小肽酶解液；将在32℃恒温摇床中，200r/min振荡培养24h后的地衣芽孢杆菌菌种液接入小肽酶解液中，使酶解中地衣芽孢杆菌菌体浓度约为5~10×107cfu/ml，35℃培养24小时后，得到小肽发酵液；
3）将小肽发酵液置于80℃烘箱烘干至水分低于10%，粉碎，过40目筛，得饲用复合小肽。
实施例10
小肽复合物的制备方法10，包括如下步骤：
1）培养液的制备：将100kg粗蛋白含量为46%的豆粕，100kg粗蛋白含量为60%的大米蛋白粉，100kg粗蛋白含量为65%的大豆浓缩蛋白，4kg蔗糖，4g葡萄糖，用水定容到 1000L，用盐酸或氢氧化钠调整反应液pH值到6.8，121℃灭菌18分钟；
2）小肽发酵液制备：灭菌结束，培养液温度降到45℃后，加入4.2kg中性蛋白酶（700U/g蛋白原料），45℃酶解12h，得到小肽酶解液；将在32℃恒温摇床中，200r/min振荡培养24h后的枯草芽孢杆菌菌种液接入小肽酶解液中，枯草芽孢杆菌菌体浓度约为5×107cfu/ml，32℃培养24小时后得到小肽发酵液；
3）将小肽发酵液置于80℃烘箱烘干至水分低于10%，粉碎，过60目筛，得饲用复合小肽。
实施例11
小肽复合物的制备方法11，包括如下步骤：
1）培养液的制备：将100kg粗蛋白含量为46%的豆粕，100kg粗蛋白含量为60%的大米蛋白粉，100kg粗蛋白含量为65%的大豆浓缩蛋白，4kg蔗糖，4g葡萄糖，用水定容到 1000L，用盐酸或氢氧化钠调整反应液pH值到6.8，121℃灭菌18分钟；
2）小肽发酵液制备：灭菌结束，培养液温度降到45℃后，加入4.2kg中性蛋白酶（700U/g蛋白原料），45℃酶解12h，得到小肽酶解液；将在32℃恒温摇床中，200r/min振荡培养24h后的纳豆芽孢杆菌菌种液接入小肽酶解液中，使酶解中纳豆芽孢杆菌菌体浓度约为5×107cfu/ml，32℃培养24小时后，得到小肽发酵液；
3）将小肽发酵液置于80℃烘箱烘干至水分低于10%，粉碎，过60目筛，得饲用复合小肽。
实施例12
小肽复合物的制备方法12，包括如下步骤：
1）培养液的制备：将100kg粗蛋白含量为46%的豆粕，100kg粗蛋白含量为60%的大米蛋白粉，100kg粗蛋白含量为65%的大豆浓缩蛋白，4kg蔗糖，4g葡萄糖，用水定容到 1000L，用盐酸或氢氧化钠调整反应液pH值到6.8，121℃灭菌18分钟；
2）小肽发酵液制备：灭菌结束，培养液温度降到45℃后，加入2.4kg中性蛋白酶（400U/g蛋白原料），45℃酶解12h，得到小肽酶解液；将在32℃恒温摇床中，200r/min振荡培养24h后的地衣芽孢杆菌菌种液和枯草芽孢杆菌菌种液接入小肽酶解液中，使酶解中地衣芽孢杆菌菌体浓度约为5×107cfu/ml，枯草芽孢杆菌菌体浓度约为5×107cfu/ml，32℃培养24小时后，得到小肽发酵液；
3）将小肽发酵液置于80℃烘箱烘干至水分低于10%，粉碎，过60目筛，得饲用复合小肽。
实施例13
小肽复合物的制备方法13，包括如下步骤：
1）培养液的制备：50kg粗蛋白含量为46%的豆粕，25kg粗蛋白含量为50%的玉米蛋白粉、15kg粗蛋白含量为35%菜粕、20kg粗蛋白含量为48%的花生粕、65kg粗蛋白含量为60%的大米蛋白粉，25kg粗蛋白含量72%的马铃薯蛋白粉，100kg粗蛋白含量为65%的大豆浓缩蛋白，4kg蔗糖,4g葡萄糖，用水定容到 1000L，用盐酸或氢氧化钠调整反应液pH值到6.8，121℃灭菌18分钟；
2）小肽发酵液制备：灭菌结束，培养液温度降到45℃后，加入4.2kg中性蛋白酶（700U/g蛋白原料），45℃酶解12h，得到小肽酶解液；将在32℃恒温摇床中，200r/min振荡培养24h的地衣芽孢杆菌菌种液接入小肽酶解液中，使酶解中地衣芽孢杆菌菌体浓度约为5×107cfu/ml，枯草芽孢杆菌菌体浓度约为5×107cfu/ml，32℃培养24小时后，得到小肽发酵液；
3）将小肽发酵液置于80℃烘箱烘干至水分低于10%，粉碎，过40目筛，得饲用复合小肽。
实施例14
小肽复合物的制备方法14，包括如下步骤：
1）培养液的制备：50kg粗蛋白含量为46%的豆粕，20kg粗蛋白含量为50%的玉米蛋白粉，15kg粗蛋白含量为35%菜粕，20kg粗蛋白含量为48%的花生粕，95kg粗蛋白含量为60%的大米蛋白粉，100kg粗蛋白含量为65%的大豆浓缩蛋白，4kg蔗糖,4g葡萄糖，用水定容到 1000L，用盐酸或氢氧化钠调整反应液pH值到6.8，121℃灭菌18分钟；
2）小肽发酵液制备：灭菌结束，培养液温度降到45℃后，加入4.2kg中性蛋白酶（700U/g蛋白原料），45℃酶解12h，得到小肽酶解液；将在32℃恒温摇床中，200r/min振荡培养24h后的枯草芽孢杆菌菌种液接入小肽酶解液中，使酶解中地衣芽孢杆菌菌体浓度约为5×107cfu/ml，枯草芽孢杆菌菌体浓度约为5×107cfu/ml，32℃培养24小时后，得到小肽发酵液；
3）将小肽发酵液置于80℃烘箱烘干至水分低于10%，粉碎，过60目筛，得饲用复合小肽。
实施例15
小肽复合物的制备方法15，包括如下步骤：
1）培养液的制备：50kg粗蛋白含量为46%的豆粕，20kg粗蛋白含量为50%的玉米蛋白粉，15kg粗蛋白含量为35%菜粕，20kg粗蛋白含量为48%的花生粕，95kg粗蛋白含量为60%的大米蛋白粉，100kg粗蛋白含量为65%的大豆浓缩蛋白，4kg蔗糖，4g葡萄糖，用水定容到 1000L，用盐酸或氢氧化钠调整反应液pH值到6.8，121℃灭菌18分钟；
2）小肽发酵液制备：灭菌结束，温度降到45℃后，加入4.2kg中性蛋白酶（700U/g蛋白原料），45℃酶解12h，得到小肽酶解液；将在32℃恒温摇床中，200r/min振荡培养24h后的纳豆芽孢杆菌菌种液接入小肽酶解液中，使酶解中地衣芽孢杆菌菌体浓度约为5×107cfu/ml，枯草芽孢杆菌菌体浓度约为5×107cfu/ml，36℃培养24小时后，得到小肽发酵液；
3）将小肽发酵液置于80℃烘箱烘干至水分低于10%，粉碎，过60目筛，得饲用复合小肽。
实施例16
小肽复合物的制备方法16，包括如下步骤：
1）培养液的制备：50kg粗蛋白含量为46%的豆粕，20kg粗蛋白含量为50%的玉米蛋白粉、15kg粗蛋白含量为35%菜粕、20kg粗蛋白含量为48%的花生粕、95kg粗蛋白含量为60%的大米蛋白粉，100kg粗蛋白含量为65%的大豆浓缩蛋白，4kg蔗糖，4g葡萄糖，用水定容到 1000L，用盐酸或氢氧化钠调整反应液pH值到6.8，121℃灭菌18分钟；
2）小肽发酵液制备：（Bacillus licheniformis）：灭菌结束，温度降到45℃后，加入2.4kg中性蛋白酶（400U/g蛋白原料），45℃酶解12h，得到小肽酶解液；将在32℃恒温摇床中，200r/min振荡培养24h的地衣芽孢杆菌菌种液和枯草芽孢杆菌菌种液接入小肽酶解液中，使酶解中地衣芽孢杆菌菌体浓度约为5×107cfu/ml，枯草芽孢杆菌菌体浓度约为5×107cfu/ml，33℃培养24小时后，得到小肽发酵液；
3）将小肽发酵液置于80℃烘箱烘干至水分低于10%，粉碎，过60目筛，得饲用复合小肽。
一、饲用复合小肽样品的水解度测定
1 原理：蛋白质的水解度（Degree of hydrolysis，DH）的基本定义代表蛋白质在水解过程中，肽键被裂解的程度或百分比，DH=（被水解的肽键数/原料中的总肽键数）×100%。假设蛋白饲料中蛋白质分子未被水解时肽链长度（即肽中的氨基酸平均数目）为PCL0，则肽键总数目PCL0-1，当被蛋白酶切断n-1个肽键而水解成n个肽时，则蛋白质的水解度DH与肽键总数PCL0-1和切开肽键数（n-1）关系表示如以下公式：DH=（n－1）/（PCL0－1）×100%因为：PCL0＝n×PCL（水解后小肽平均链长度）DH=（PCL0/ PCL－1）/（PCL0－1）×100%=（1/ PCL－1/ PCL0）/（1－1/ PCL0）×100%。由于豆粕、玉米蛋白粉、麸皮中蛋白质分子量都较大，水解程度较高，这时可以认为PCL0 ∞，那么，水解度DH转化为：DH=1/PCL×100%小肽的平均链长即肽链的平均氨基酸残基数。根据李培骏等（2006）研究总结，小肽的平均链长≈1/DH×100%
2 制作标准曲线
2.1完全水解蛋白液的制备：取菜籽蛋白100 mg，放入特制的反应瓶，加入100 ml 6 mol 盐酸，拧紧瓶盖，放入130℃ 烘箱中水解24 h，冷却, 过滤，滤液真空浓缩至0.5 ml 左右，加蒸馏水90 ml，用1 molNaOH 中和至中性( pH6)，定容至100 ml（参考郭兴凤，蛋白质水解度的测定）。
2.2 吸光度值测定：取完全水解液0.1 ml~1.0 ml 于25 ml 比色管中，蒸馏水稀释至4.0 ml，加pH=8的PBS缓冲溶液（0.2 M Na2HPO4，94.7 ml与0.2M NaH2PO4，5.3ml合并，混匀）1.0 ml，茚三酮溶液1.0 ml，混匀，沸水浴加热15 min，冷却，蒸馏水稀释至25 ml，570 nm 测光密度( 水作参比)。另取100 mg 蛋白，加水100 mL，振荡均匀后过滤，取相应体积的滤液，按上述方法测光密度值。相同体积样品的光密度之差与蛋白质量做工作曲线，取线性部分做标准曲线，获得已水解的蛋白质的质量（x，mg）对所测溶液的吸光度值（y1）的标准曲线（见表1和图1），求得回归方程 y1=0.0003x+0.0048，R2=0.9990；蛋白质水解度（DH）=已水解的蛋白质的质量/总蛋白质量×100%；小肽的平均链长≈1/DH×100%。
3复合小肽样品的水解度和平均肽链长度测定
分别取一定量(100mg)备得到的复合小肽，加水100 ml，振荡均匀后过滤，取4ml滤液，加pH=8的PBS缓冲溶液1.0 ml，茚三酮溶液1.0 ml，混匀，沸水浴加热15 min，冷却，蒸馏水稀释至25 ml，570 nm 测光密度( 水作参比) 。根据方程式y1=0.0003x+0.0048，计算已水解蛋白质的质量（mg），根据公式：DH=已水解的蛋白质的质量/总蛋白质量×100%计算样品的水解度；根据公式：小肽的平均链长≈1/DH×100%，计算样品中小肽的平均链长。测试结果如表2所示。
二、饲用复合小肽样品中小肽分子量大小测定
采用Sephadex G-15凝胶柱层析法对饲用复合小肽的分子质量（Mw）分布范围进行测定。
1试验条件：
柱子：Sephadex G-15 柱（1.0 cm×80.0 cm）；
流速：1.3 mL/min；
洗脱液：0.1 mol/L pH 7.0 Tris-HCl；
温度 ：18 ℃（YC-1 型层析试验冷柜）；
检测波长： 280 nm，经 CDMC 色谱工作站分析。
2 制作标准曲线
2.1标样制备：取酪氨酸（Mw=181.2 u）、还原型谷胱甘肽（Mw=307.22 u）、氧化型谷胱甘肽（Mw=612.66 u）、杆菌肽（Mw=1445 u）各 50 mg，分别溶于 5 mL三蒸水中，制成标准溶液。
2.2标线制作：将已处理好的 Sephadex G-15 装柱，用洗脱液洗脱至基线平稳，加入标准溶液 3 mL，并记录最大吸收峰出现时间（min），见表1，并绘制出峰时间与标准蛋白分子质量对数（lgM）的标准曲线。根据测得各标准品出峰时间为杆菌肽70.75 min， 氧化型谷胱甘肽88.40 min，还原型谷胱甘肽 102.73 min，酪氨酸113.70 min，绘制出峰时间（y）与标准蛋白分子质量对数 （x，lgM） 的标准曲线（见表3和图2）， 求得回归方程 y2=－47.728x+221.57，R2=0.9946，此方程线性关系良好，可以根据此回归方程计算小肽水解液的分子质量。
2.3 样品小肽分子量测定
将实施例1制备得到的小肽发酵液经 Sephadex G-15凝胶过滤分离（见图3）。从图3中可以看出，酶解液有 4 个明显的洗脱峰，第1 峰的出峰时间为 61.24 min，为柱前锋，第 2、3峰两个峰的出峰时间分别是 84.23、99.157 min，根据回归方程y1计算两个峰的分子质量分别为 663.59 Da和 275.98 Da， 第 4 峰出峰时间是 162.345 min，根据酪氨酸的出峰时间和不同酶解时间图谱分析判定是混合氨基酸，在 280 nm 紫外光下并不线性相关。应用部分收集器收集多肽洗脱峰，经凯式定氮测定， 第 2、3、4 峰含氮占总可溶性氮的 77.84 %，说明经酶解后小肽分子质量主要集中于 200～700Da 之间，即主要集中在2～5个小肽之间，根据氨基酸理论分子量计算小肽理论分子量为238～568 Da，即小肽的平均分子量为403Da。
同样的方法测定实施例2～16复合小肽的分子量分布范围，结果显示各实施例得到的小肽分子质量均集中于200～700Da 之间，即主要集中在2～5个小肽之间。
三、测定复合小肽样品中小肽的含量及小肽转化率
1原理
小肽发酵液中的大分子蛋白质和肽链较长的多肽用三氯醋酸溶液进行沉淀，并将其中的短链小肽用酸溶解出来，其中包括小肽和部分α-氨基酸。然后经离心、过滤、消化、蒸馏，测定其蛋白质含量即酸溶蛋白。本方法参照大豆肽粉(Soy peptides powder)中华人民共和国轻工行业标准 (QB/ T 2653 -2004)修订而成。
2试剂及仪器
100ml烧杯；10ml，25ml移液管；半微量粗蛋白质测定试剂和装置；15％三氯醋酸溶液（TCA溶液）；4500 转/ 分钟的离心机。
3方法
取样：将小肽发酵液搅拌均匀后，取10ml样品，80℃烘干，准确称重，用于测定小肽含量，重复三次。具体步骤如下：
样品用水溶解，用玻璃棒搅拌均匀，无损的移入100ml容量瓶中，定容至刻度（100 ml总样本液）静止10分钟。摇动容量瓶取15ml浑浊液用离心机4500转离心10分钟，取10ml上清液注入试管管中，再加入15%三氯醋酸10ml，静止沉降15分钟后，用定性滤纸过滤。取滤液10ml（相当于用于消化的样本液为5ml）注入干燥的消化管中，加入硫酸铜0.2g，硫酸钠3g，再加浓硫酸10ml，消化方法及蒸馏方法与凯氏定氮法相同。
样品中肽含量的计算公式：
V1——样品消耗盐酸体积
V0——试剂空白消耗盐酸体积
m——样品折算重量
m ＝ 样品称量重量 ×用于消化的样本液体积/总样本液体积
＝ 样品称量重量 × 5/100
肽转化率（%）
X0——样品中的蛋白含量（%）（凯氏定氮法测定）
测定结果如表4所示。
四、动物实验
360头相近批次、体重相近、健康状况良好的断奶仔猪随机分成18组进行实验。实验饲料采用常规仔猪商品料，在此基础上，空白组为商品饲料，对照组每吨饲料加入5kg鱼粉，实验1～16组分别加入实施例1～16的复合小肽5kg。试验从第三周开始，实验进行28天，结果表明：与对照组相比，在饲料中加入等量的本发明的复合小肽可以有效改善仔猪的日增重率、料肉比，降低腹泻率和耗料量（见表5）。
以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。
Claims (8)
1.一种饲用复合小肽的制备方法，包括如下步骤：
1）将蛋白原料、碳源和水配制成培养液，灭菌；
2）将芽孢菌接种到灭菌后的培养液中，30～37℃下振荡培养18～30h后，加入蛋白酶，35～50℃，pH6.0～7.5，继续酶解6～12h，得到小肽发酵液；或者是：往培养液中加入蛋白酶，35～50℃，pH6.0～7.5，酶解6～12h后，接种芽孢菌，30～37℃下继续振荡培养18～30h，得到小肽发酵液；
3）将小肽发酵液干燥，得到饲用复合小肽。
2.根据权利要求1所述的饲用复合小肽的制备方法，其特征在于：所述蛋白原料为豆粕、大米蛋白粉、小麦蛋白粉、玉米蛋白粉、棉粕、花生粕、马铃薯蛋白、菜粕、大豆浓缩蛋白中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的饲用复合小肽的制备方法，其特征在于：所述碳源为葡萄糖、蔗糖、淀粉中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的饲用复合小肽的制备方法，其特征在于：每100ml培养液中，含有蛋白原料20～30g、碳源0.1～1g。
5.根据权利要求1所述的饲用复合小肽的制备方法，其特征在于：所述芽孢菌为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）或/和枯草芽孢杆菌（Bcillus subtilis）或/和纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）。
6.根据权利要求1所述的饲用复合小肽的制备方法，其特征在于：所述芽孢菌的接种浓度为5×107～10×107cfu/ml培养液。
7.根据权利要求1所述的饲用复合小肽的制备方法，其特征在于：所述蛋白酶为中性蛋白酶。
8.根据权利要求1或7所述的饲用复合小肽的制备方法，其特征在于：所述蛋白酶的加入量为400～700U/g蛋白原料。
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