CN102827908A - 一种小肽螯合铁复合物的制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种小肽螯合铁复合物的制备方法与应用。制备方法包括如下步骤：将蛋白原料、碳源和水配制成培养液，灭菌；将芽孢菌和蛋白酶接到培养液中，发酵酶解或酶解发酵，得到小肽发酵液；继续加入水溶性铁盐，控制反应温度在55～65℃，pH为5～6，螯合反应；将反应物干燥，得到小肽螯合铁复合物。本发明小肽螯合铁制备方法的螯合率高，达到95%以上，所得到的小肽螯合铁复合物在动物胃内的稳定性好，并含有多种生物活性成分，营养更加全面，可用作饲用添加剂，补充日粮的微量元素，提高动物体的免疫机能。
Description
技术领域
本发明涉及一种小肽螯合铁复合物的制备方法与应用。
背景技术
动物为了保证每一个细胞，组织，器官，腺体及系统的正常功能需要特定的微量元素，微量元素是动物不可缺少的营养物质，日粮中添加一定高质量、高利用率的微量元素对动物健康和最大限度发挥其生产潜力具有十分重要的作用（NRC，1998；Richards，2008)。
铁是人体需要量最多的微量元素，大部分以血红蛋白的形式存在于红细胞里面，是人体肌肉和含铁酶的构成成分之一，血红蛋白是红细胞里的主要成分，负责携带氧气运送到全身各处，供新陈代谢所需。铁在胚胎期和生后骨骼发育中起到重要作用，和铜、锌一样，铁也参与细胞的抗氧化作用，铁也是超氧化物歧化酶的辅助因子(Elinor McCartney 2010)。缺铁能引起贫血是世界上最为常见的营养缺乏症。某些婴儿，青春期少女和妊娠妇女因铁摄入量不足引起缺铁性贫血。一般来说，失血可产生缺铁，缺铁的人需要铁补充。适当水平的铁元素含量对维持机体功能的正常至关重要。
由于无机微量元素之间存在相互拮抗作用，比如铜、锌之间，铁、锌之间，导致吸收利用率降低。人们多超量添加希望解决缺乏问题，但不仅效果有限，还产生了对环境的污染（Cao,1997）。微量元素的缺乏能够导致许多动物代谢甚至临床疾病的发生。在家畜和禽类生产过程中，微量元素的缺乏直接导致生长缓慢和饲料转化效率下降(NRC,1998)。现在有机微量元素已成为国内外饲料及养殖行业研究的热点。
目前，市场上常见的有机微量元素主要为有机酸类微量元素和氨基酸螯合微量元素。从上世纪80年代开始出现以富马酸铁，葡萄糖酸锌等为代表的有机酸类微量元素。第二代的简单有机盐，虽然稳定性好，但与部分营养物质仍会发生拮抗作用。在消化吸收过程中受影响的因素也较多，生物学利用率仍较低。金属离子与氨基酸分子通过配位键结合后，使其分子内电荷趋于中性，形成了较稳定的化学结构（黄雪等，2008；）。但在瘤胃或单胃内酸环境下的稳定性问题一致没有很好地解决（梁建光等，2008）。
因此，研发一类生物学利用率高，在瘤胃或单胃内酸环境下的稳定性好的有机微量元素铁具有十分重要的市场意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种小肽螯合铁复合物的制备方法。
本发明所采用的技术方案是：
一种小肽螯合铁复合物的制备方法，包括如下步骤：
1）将蛋白原料、碳源和水配制成培养液，灭菌；
2）将芽孢菌接种到灭菌后的培养液中，30～37℃下振荡培养18～30h后，加入蛋白酶，35～50℃，pH6.0～7.5，继续酶解6～12h，得到小肽发酵液；或者是：往培养液中加入蛋白酶，35～50℃，pH6.0～7.5，酶解6～12h后，接种芽孢菌，30～37℃下继续振荡培养18～30h，得到小肽发酵液；
3）测定小肽发酵液中小肽的含量，灭酶后，继续加入水溶性铁盐，混合均匀，控制反应温度在55～65℃，pH为5～6，进行螯合反应；
4）将反应产物干燥，得到小肽螯合铁复合物。
所述蛋白原料为豆粕、大米蛋白粉、小麦蛋白粉、玉米蛋白粉、棉粕、花生粕、马铃薯蛋白、菜粕、大豆浓缩蛋白中的至少一种。
所述碳源为葡萄糖、蔗糖、淀粉中的至少一种。
以上原料均可在原料市场购得。
每100ml培养液中，含有蛋白原料20～30g、碳源0.1～1g。
所述芽孢菌为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）或/和枯草芽孢杆菌（Bcillus subtilis）或/和纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）。
所述芽孢菌的接种浓度为5×107～10×107cfu/ml培养液。
所述蛋白酶为中性蛋白酶，加入量为400～700U/g蛋白原料。
步骤3）中，小肽与水溶性铁盐的摩尔比为1～3：1。
所述水溶性铁盐为富马酸亚铁、硫酸亚铁、柠檬酸亚铁、乳酸亚铁、氯化亚铁、碳酸亚铁。
上述方法制备得到的小肽螯合铁复合物作为饲料添加剂的应用。
本发明的有益效果在于：
本发明小肽螯合铁制备方法的螯合率高，达到95%以上，所得到的小肽螯合铁复合物在动物胃内的稳定性好，营养更加全面，可用作饲用添加剂，补充日粮的微量元素，提高动物体的免疫机能。
附图说明
图1是标准蛋白的分子量和出峰时间曲线图
图2是小肽发酵液凝胶G-15洗脱图谱。
具体实施方式
以下实施例中所用到的菌液按以下方法制备：
从斜面试管培养基中刮取一环地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）或枯草芽孢杆菌（Bcillus subtilis）或纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）菌种加入到液体培养基中，摇瓶培养。摇瓶种子培养基与培养条件为葡萄糖1%、酵母膏0.5%、蛋白胨0.5%、牛肉膏0.5%、食盐0.05%、磷酸二氢钾0.1%。pH=7.0-7.2、121℃灭菌18分钟。于32℃恒温摇床中，200r/min振荡培养24h，得到菌种液。
以上三个菌种购自广东省微生物菌种保藏中心，地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）和枯草芽孢杆菌（Bcillus subtilis）的编号分别为GIM1.8=AS1.518，GIM1.19=AS1.210。
以下实施例中所用到的中性蛋白酶购自肇东市日成酶制剂有限公司，商品型号为：AS.1398，酶活力为50000U/g。
以下实施例中所用到的检测方法和计算公式如下所示：
一、检测小肽发酵液中小肽的含量及小肽转化率
1、原理
小肽发酵液中的大分子蛋白质和肽链较长的多肽用三氯醋酸溶液进行沉淀，并将其中的短链小肽用酸溶解出来，其中包括小肽和部分α-氨基酸。然后经离心、过滤、消化、蒸馏，测定其蛋白质含量即酸溶蛋白。本方法参照大豆肽粉(Soy peptides powder)中华人民共和国轻工行业标准 (QB/ T 2653 -2004)修订而成。
2、试剂及仪器
100ml烧杯；10ml，25ml移液管；半微量粗蛋白质测定试剂和装置；15％三氯醋酸溶液（TCA溶液）；4500 转/ 分钟的离心机。
3、方法
取样：将小肽发酵液搅拌均匀后，取10ml样品，80℃烘干，准确称重，用于测定小肽含量，重复三次。具体步骤如下：
样品用水溶解，用玻璃棒搅拌均匀，无损的移入100ml容量瓶中，定容至刻度（100 ml总样本液）静止10分钟。摇动容量瓶取15ml浑浊液用离心机4500转离心10分钟，取10ml上清液注入试管管中，再加入15%三氯醋酸10ml，静止沉降15分钟后，用定性滤纸过滤。取滤液10ml（相当于用于消化的样本液为5ml）注入干燥的消化管中，加入硫酸铜0.2g，硫酸钠3g，再加浓硫酸10ml，消化方法及蒸馏方法与凯氏定氮法相同。
样品中肽含量的计算公式：
——样品中肽含量（%）
V1——样品消耗盐酸体积
V0——试剂空白消耗盐酸体积
m——样品折算重量
m ＝ 样品称量重量 ×用于消化的样本液体积/总样本液体积
＝ 样品称量重量 × 5/100
肽转化率（%）
X0——样品中的蛋白含量（%）（凯氏定氮法测定）
发酵液干物质中小肽总质量的计算公式：
A—小肽总质量（g）
M0—发酵液干物质总质量（g）
——样品中肽含量（%）
二、小肽发酵液中小肽摩尔含量的测定和计算方法
首先，采用Sephadex G-15凝胶柱层析法对小肽发酵液中小肽的分子质量（Mw）分布范围进行测定。
1试验条件：
柱子：Sephadex G-15 柱（1.0 cm×80.0 cm）；
流速：1.3 mL/min；
洗脱液：0.1 mol/L pH 7.0 Tris-HCl；
温度 ：18 ℃（YC-1 型层析试验冷柜）；
检测波长： 280 nm，经 CDMC 色谱工作站分析。
2 制作标准曲线
2.1标样制备：取酪氨酸（Mw=181.2 u）、还原型谷胱甘肽（Mw=307.22 u）、氧化型谷胱甘肽 （Mw=612.66 u）和杆菌肽（Mw=1445 u）各 50 mg，分别溶于 5 mL三蒸水中，制成标准溶液。
2.2标线制作：将已处理好的 Sephadex G-15 装柱， 用洗脱液洗脱至基线平稳，加入标准溶液 3 mL，并记录最大吸收峰出现时间（min），见表1，并绘制出峰时间与标准蛋白分子质量对数（lgM）的标准曲线。根据测得各标准品出峰时间为杆菌肽71.30 min， 氧化型谷胱甘肽88.142 min，还原型谷胱甘肽 102.39 min，酪氨酸115.2 min，绘制出峰时间（y）与标准蛋白分子质量对数 （x，lgM)的标准曲线（见表1和图1）， 求得回归方程 y1=－47.728x+221.57，R2=0.9946，此方程线性关系良好，可以根据此回归方程计算小肽水解液的分子质量。
2.3 样品小肽分子量测定
将以下各实施例制备得到的小肽发酵液经 Sephadex G-15凝胶过滤分离（见图2）。从图2中可以看出，酶解液有 4 个明显的洗脱峰，第1 峰的出峰时间为 61.24 min，为柱前锋，第 2、3峰两个峰的出峰时间分别是 84.23、99.157 min，根据回归方程y1计算两个峰的分子质量分别为 663.59Da和 275.98 Da， 第 4 峰出峰时间是 162.345 min，根据酪氨酸的出峰时间和不同酶解时间图谱分析判定是混合氨基酸，在 280 nm 紫外光下并不线性相关。应用部分收集器收集多肽洗脱峰，经凯式定氮测定， 第 2、3、4 峰含氮占总可溶性氮的 77.84 %，说明经酶解后小肽分子质量主要集中于 200～700Da 之间，即主要集中在2～5个小肽之间，根据氨基酸理论分子量计算小肽理论分子量为238～568 Da，即小肽的平均分子量为403Da。
因此，本发明各实施例所得小肽发酵液中，小肽摩尔含量的计算公式为：
小肽摩尔含量=小肽总质量（g）÷403
三、小肽螯合铁复合物的螯合率测定：
原理：利用小肽螯合物不溶于甲醇的原理，用甲醇进行洗脱，将小肽螯合铁与无机铁进行分离，再利用原子吸收分光光度计测定总铁和无机铁含量，进行螯合率的计算。具体步骤如下：
1、标准溶液的配制：把1000ug/ml的铁标准溶液配成100ug/ml。
分别量取1ml、3ml、5ml的铁标准溶液（100 ug/ml）于100ml的容量瓶中，定容，此是1ug/ml，3ug/ml，5ug/ml的标准系列。
2、小肽螯合铁与无机铁的制备
总铁的提取：
称取0.25g左右样品于坩埚中，将坩埚放在电热板上加热，直到样品完全炭化。将坩埚转到已在550℃温度下预热15min的马福炉中灰化3h，冷却后用2ml水浸泣坩埚中内容物。如果有许多炭粒，则将坩埚放在水浴上干燥，然后，再入到马福炉中灰化2h，让其冷却再加2ml水。加入10 ml(1+1)盐酸，加热煮沸直到内容物近乎干燥，在加热期间务必避免内容物溅出。用5 ml(1+1)的盐酸加热溶解残渣后，冷却，定量转移到100ml的容量瓶中。取1ml溶液于100ml的容量瓶中，定容。
有机铁的测定：准确称取1g左右的样品于100ml的烧杯中，加入50ml的甲醇，放入恒温振荡器中（37℃）10min后，过滤，取1ml定容于100ml的容量瓶中。
3、利用原子吸收分光光度计测定总铁和无机铁含量
设备参数设定（设备型号AA2610)：灯电流I=3mA；通带AA=0.2nm；波长λ248.3 nm；燃烧器高度=7.5 mm,空气流量=6.4min;乙炔气流量=2.0L/min。
测定：1、先对标品进行检测，做出标准曲线。
2、样品检测：取稀释好的样品进行检测。
螯合率=（总铁含量-无机铁含量）/总铁含量
实施例1
小肽复合物的制备方法1，包括如下步骤：
1）培养液的制备：将100kg粗蛋白含量为46%的豆粕，100kg粗蛋白含量为60%的大米蛋白粉，100kg粗蛋白含量为65%的大豆浓缩蛋白，6kg蔗糖，用水定容到 1000L，用盐酸或氢氧化钠调整反应液pH值到6.8，121℃灭菌18分钟；
2）小肽发酵液制备：将在32℃恒温摇床中，200r/min振荡培养24h后的地衣芽孢杆菌菌种液接入上述灭菌后的1000L培养液中，使培养液中菌体浓度约为5×107cfu/ml，30℃培养24小时后，加入盐酸或氢氧化钠调节培养基pH值为7.0，加入3kg中性蛋白酶（500U/g蛋白原料），45℃继续酶解10h，得到小肽发酵液；
3）测定小肽发酵液干物质中小肽的含量为21.01%，约0.16mol，转化率37.84%；
4）将发酵液温度升高至85～90℃，保持20分钟，然后将发酵液温度调整到60℃，用盐酸或氢氧化钠调整反应液pH值到5，按1：1的肽铁摩尔比添加硫酸亚铁，鳌合3h，得到小肽螯合铁复合物；
5）将小肽螯合铁复合物置于内热烘箱中，145℃进行干燥，得成品，测定螯合率为95.32 %。
实施例2
小肽复合物的制备方法2，包括如下步骤：
培养液的制备：将100kg粗蛋白含量为46%的豆粕，100kg粗蛋白含量为60%的大米蛋白粉，100kg粗蛋白含量为65%的大豆浓缩蛋白，3kg蔗糖，3kg葡萄糖，2kg淀粉，用水定容到 1000L，用盐酸或氢氧化钠调整反应液pH值到6.8，121℃灭菌18分钟；
2）小肽发酵液制备：将在32℃恒温摇床中，200r/min振荡培养24h后的枯草芽孢杆菌菌种液接入上述灭菌后的1000L培养液中，使培养液中菌体浓度约为5×107cfu/ml，30℃培养24小时后，加入盐酸或氢氧化钠调节培养基pH值为6.8，加入2.4kg中性蛋白酶（400U/g蛋白原料），43℃继续酶解12h，得到小肽发酵液；
3）测定小肽发酵液干物质中小肽的含量为21.71%，约0.17mol，转化率为39.1%；
4）将发酵液温度升高至85～90℃，保持20分钟，然后将发酵液温度调整到60℃，用盐酸或氢氧化钠调整反应液pH值到6，按2.25：1的肽铁摩尔比添加富马酸亚铁，鳌合3h，得到小肽螯合铁复合物；
5）将小肽螯合铁复合物置于内热烘箱中，145℃进行干燥，得成品，测定螯合率为95.23%。
实施例3
小肽复合物的制备方法3，包括如下步骤：
1）培养液的制备：将100kg粗蛋白含量为46%的豆粕，100kg粗蛋白含量为60%的大米蛋白粉，100kg粗蛋白含量为65%的大豆浓缩蛋白，8kg葡萄糖，用水定容到 1000L，用盐酸或氢氧化钠调整反应液pH值到6.8，121℃灭菌18分钟；
2）小肽发酵液制备：将在32℃恒温摇床中，200r/min振荡培养24h后的纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）菌种液接入上述灭菌后的1000L培养液中，使培养液中菌体浓度约为5×107cfu，32℃培养24小时后，加入盐酸或氢氧化钠调节培养基pH值为6.8，加入3.6kg中性蛋白酶（600U/g蛋白原料），43℃继续酶解12h，得到小肽发酵液；
3）测定小肽发酵液干物质中小肽的含量为21.65%，约0.17mol，转化率为39.0%；
4）将发酵液温度升高至85～90℃，保持20分钟，然后将发酵液温度调整到60℃，用盐酸或氢氧化钠调整反应液pH值到6，按2.25：1的肽铁摩尔比添加硫酸亚铁，鳌合3h，得到小肽螯合铁复合物；
5）将小肽螯合铁复合物置于内热烘箱中，145℃进行干燥，得成品，测定螯合率为95.35%。
实施例4
小肽复合物的制备方法4，包括如下步骤：
1）培养液的制备：将100kg粗蛋白含量为46%的豆粕，100kg粗蛋白含量为60%的大米蛋白粉，100kg粗蛋白含量为65%的大豆浓缩蛋白，8kg淀粉，用水定容到 1000L，用盐酸或氢氧化钠调整反应液pH值到6.8，121℃灭菌18分钟；
2）小肽发酵液制备：将在32℃恒温摇床中，200r/min振荡培养24h后的地衣芽孢杆菌菌种液和枯草芽孢杆菌菌种液接入上述灭菌后的1000L培养液中，使培养液中地衣芽孢杆菌菌体浓度约为5×107cfu/ml，枯草芽孢杆菌菌体浓度约为5×107cfu/ml，32℃培养24小时后，加入盐酸或氢氧化钠调节培养基pH值为6.8，然后加入4.2kg中性蛋白酶（700U/g蛋白原料），40℃继续酶解12h，得到小肽发酵液；
3）测定小肽发酵液干物质中小肽的含量为20.96%，约0.16mol，转化率为37. 74%；
4）将发酵液温度升高至85～90℃，保持20分钟，然后将发酵液温度调整到60℃，用盐酸或氢氧化钠调整反应液pH值到5，按2.25：1的肽铁摩尔比添加硫酸亚铁，鳌合3h，得到小肽螯合铁复合物；
5）将小肽螯合铁复合物置于内热烘箱中，145℃进行干燥，得成品，测定螯合铁的含量，计算得出螯合率为96.30%。
实施例5
小肽复合物的制备方法5，包括如下步骤：
1）培养液的制备：50kg粗蛋白含量为46%的豆粕，25kg粗蛋白含量为50%的玉米蛋白粉、15kg粗蛋白含量为35%菜粕、20kg粗蛋白含量为48%的花生粕、65kg粗蛋白含量为60%的大米蛋白粉，25kg粗蛋白含量72%的马铃薯蛋白粉，100kg粗蛋白含量为65%的大豆浓缩蛋白，3kg蔗糖，3kg葡萄糖，2kg淀粉，用水定容到 1000L，用盐酸或氢氧化钠调整反应液pH值到6.8，用盐酸或氢氧化钠调整反应液pH值到6.8，121℃灭菌18分钟；
2）小肽发酵液制备：将在32℃恒温摇床中，200r/min振荡培养24h后的地衣芽孢杆菌菌种液接入上述灭菌后的1000L培养液中，使培养液中菌体浓度约为5×107cfu/ml，35℃培养24小时后，加入盐酸或氢氧化钠调节培养基pH值为7.0，加入3kg中性蛋白酶（500U/g蛋白原料），45℃继续酶解10h，得到小肽发酵液；
3）测定小肽发酵液干物质中小肽的含量为20.75%，约0.16mol，转化率37.08%；
4）将发酵液温度升高至85～90℃，保持20分钟，然后将发酵液温度调整到60℃，按2.25：1的肽铁摩尔比添加硫酸亚铁，用盐酸或氢氧化钠调整反应液pH值到5，鳌合3h，得到小肽螯合铁复合物；
5）将小肽螯合铁复合物置于内热烘箱中，145℃进行干燥，得成品，测定螯合率为95.57 %。
实施例6
小肽复合物的制备方法6，包括如下步骤：
1）培养液的制备：40kg粗蛋白含量为46%的豆粕，15kg粗蛋白含量为50%的玉米蛋白粉，15kg粗蛋白含量为35%菜粕，20kg粗蛋白含量为48%的花生粕，95kg粗蛋白含量为60%的大米蛋白粉，100kg粗蛋白含量为65%的大豆浓缩蛋白，15粗蛋白含量42%的棉粕，6kg葡萄糖，用水定容到 1000L，用盐酸或氢氧化钠调整反应液pH值到6.8，121℃灭菌18分钟；
2）小肽发酵液制备：将在32℃恒温摇床中，200r/min振荡培养24h后的枯草芽孢杆菌菌种液接入上述灭菌后的1000L培养液中，使培养液中菌体浓度约为5×107～10×107cfu/ml，加入盐酸或氢氧化钠调节培养基pH值为6.8，37℃培养24小时后，加入2.4kg中性蛋白酶（400U/g蛋白原料），43℃继续酶解12h，得到小肽发酵液；
3）测定小肽发酵液干物质中小肽的含量为20.75%，约0.16mol，转化率为39.01%
4）将发酵液温度升高至85～90℃，保持20分钟，然后将发酵液温度调整到60℃，按2.25：1的肽铁摩尔比添加柠檬酸亚铁，用盐酸或氢氧化钠调整反应液pH值到6，鳌合3h，得到小肽螯合铁复合物；
5）将小肽螯合铁复合物置于内热烘箱中，145℃进行干燥，得成品，测定螯合率为96. 31%。
实施例7
小肽复合物的制备方法7，包括如下步骤：
1）培养液的制备：50kg粗蛋白含量为46%的豆粕，20kg粗蛋白含量为50%的玉米蛋白粉，15kg粗蛋白含量为35%菜粕，20kg粗蛋白含量为48%的花生粕，95kg粗蛋白含量为60%的大米蛋白粉，100kg粗蛋白含量为65%的大豆浓缩蛋白，8kg淀粉，用水定容到 1000L，用盐酸或氢氧化钠调整反应液pH值到6.8，121℃灭菌18分钟；
2）小肽发酵液制备：将32℃恒温摇床中，200r/min振荡培养24h后的纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）菌种液接入上述灭菌后的1000L培养液中，使培养液中菌体浓度约为5×107～10×107cfu/ml，32℃培养24小时后，加入盐酸或氢氧化钠调节培养基pH值为6.8，加入2.4kg中性蛋白酶（400U/g蛋白原料），43℃继续酶解12h，得到小肽发酵液；
3）测定小肽发酵液干物质中小肽的含量为21.01%，约0.16mol，转化率为37.84%；
4）将发酵液温度升高至85～90℃，保持20分钟，然后将发酵液温度调整到60℃，按3：1的肽铁摩尔比添加硫酸亚铁，用盐酸或氢氧化钠调整反应液pH值到5，鳌合3h，得到小肽螯合铁复合物；
5）将小肽螯合铁复合物置于内热烘箱中，145℃进行干燥，得成品，测定螯合铁的含量，计算得出螯合率为96.51%。
实施例8
小肽复合物的制备方法8，包括如下步骤：
1） 1）培养液的制备：50kg粗蛋白含量为46%的豆粕，20kg粗蛋白含量为50%的玉米蛋白粉，15kg粗蛋白含量为35%菜粕，20kg粗蛋白含量为48%的花生粕，95kg粗蛋白含量为60%的大米蛋白粉，100kg粗蛋白含量为65%的大豆浓缩蛋白，3kg蔗糖，3kg葡萄糖，2kg淀粉，用水定容到 1000L，用盐酸或氢氧化钠调整反应液pH值到6.8，121℃灭菌18分钟；
2）小肽发酵液制备：将经过培养的地衣芽孢杆菌菌种液和枯草芽孢杆菌菌种液接入上述灭菌后的1000L培养液中，使培养液中地衣芽孢杆菌菌体浓度约为5×107cfu/ml，枯草芽孢杆菌菌体浓度约为5×107cfu/ml，于32℃恒温摇床中，200r/min振荡培养24h后，加入盐酸或氢氧化钠调节培养基pH值为6.8，然后加入3.6kg中性蛋白酶（600U/g蛋白原料），40℃继续酶解12h，得到小肽发酵液；
3）测定小肽发酵液干物质中小肽的含量为21.96%，约0.17mol，转化率为39.55%；
4）将发酵液温度升高至85～90℃，保持20分钟，然后将发酵液温度调整到60℃，按3：1的肽铁摩尔比添加乳酸亚铁，用盐酸或氢氧化钠调整反应液pH值到5，鳌合3h，得到小肽螯合铁复合物；
5）将小肽螯合铁复合物置于内热烘箱中，145℃进行干燥，得成品，测定螯合铁的含量，计算得出螯合率为95.75%。
实施例9
小肽复合物的制备方法9，包括如下步骤：
1）培养液的制备：将100kg粗蛋白含量为46%的豆粕，100kg粗蛋白含量为60%的大米蛋白粉，100kg粗蛋白含量为65%的大豆浓缩蛋白，8kg蔗糖，用水定容到 1000L，用盐酸或氢氧化钠调整反应液pH值到6.8，121℃灭菌18分钟；
2）小肽发酵液制备：灭菌结束，培养液温度降到45℃后，加入4.2kg中性蛋白酶（700U/g蛋白原料），45℃酶解12h，得到小肽酶解液；将在32℃恒温摇床中，200r/min振荡培养24h后的地衣芽孢杆菌菌种液接入小肽酶解液中，使酶解中地衣芽孢杆菌菌体浓度约为5×107cfu/ml，35℃培养24小时后，得到小肽发酵液；
3）测定小肽发酵液干物质中小肽的含量为21.56%，约0.16mol，转化率为38.83%；
4）将发酵液温度升高至85～90℃，保持20分钟，然后将发酵液温度调整到60℃，按1：1的肽铁摩尔比添加硫酸亚铁，用盐酸或氢氧化钠调整反应液pH值到5，鳌合3h，得到小肽螯合铁复合物；
5）将小肽螯合铁复合物置于内热烘箱中，145℃进行干燥，得成品，测定螯合铁的含量，计算得出螯合率为95.65%。
实施例10
小肽复合物的制备方法10，包括如下步骤：
1）培养液的制备：将100kg粗蛋白含量为46%的豆粕，100kg粗蛋白含量为60%的大米蛋白粉，100kg粗蛋白含量为65%的大豆浓缩蛋白，6kg葡萄糖，用水定容到 1000L，用盐酸或氢氧化钠调整反应液pH值到6.8，121℃灭菌18分钟；
2）小肽发酵液制备：灭菌结束，培养液温度降到45℃后，加入4.2kg中性蛋白酶（700U/g蛋白原料），45℃酶解12h，得到小肽酶解液；将在32℃恒温摇床中，200r/min振荡培养24h后的枯草芽孢杆菌菌种液接入小肽酶解液中，枯草芽孢杆菌菌体浓度约为5×107cfu/ml，32℃培养24小时后，得到小肽发酵液；
3）测定小肽发酵液干物质中小肽的含量为21.32%，约0.16mol，转化率为35.88%；
4）将发酵液温度升高至85～90℃，保持20分钟，然后将发酵液温度调整到60℃，按1：1的肽铁摩尔比添加硫酸亚铁，用盐酸或氢氧化钠调整反应液pH值到5，鳌合3h，得到小肽螯合铁复合物；
5）将小肽螯合铁复合物置于内热烘箱中，145℃进行干燥，得成品，测定螯合铁的含量，计算得出螯合率为95.32%。
实施例11
小肽复合物的制备方法11，包括如下步骤：
1）培养液的制备：将100kg粗蛋白含量为46%的豆粕，100kg粗蛋白含量为60%的大米蛋白粉，100kg粗蛋白含量为65%的大豆浓缩蛋白，3kg蔗糖，3kg葡萄糖，2kg淀粉，用水定容到 1000L，用盐酸或氢氧化钠调整反应液pH值到6.8，121℃灭菌18分钟；
2）小肽发酵液制备：灭菌结束，培养液温度降到45℃后，加入3.6kg中性蛋白酶（600U/g蛋白原料），45℃酶解12h，得到小肽酶解液；将在32℃恒温摇床中，200r/min振荡培养24h后的纳豆芽孢杆菌菌种液接入小肽酶解液中，使酶解中纳豆芽孢杆菌菌体浓度约为5×107cfu/ml，32℃培养24小时后，得到小肽发酵液；
3）测定小肽发酵液干物质中小肽的含量为21.13%，约0.16mol，转化率为38.32%；
4）将发酵液温度升高至85～90℃，保持20分钟，然后将发酵液温度调整到60℃，按2.25:1的肽铁摩尔比添加氯化亚铁，用盐酸或氢氧化钠调整反应液pH值到5，鳌合3h，得到小肽螯合铁复合物；
5）将小肽螯合铁复合物置于内热烘箱中，145℃进行干燥，得成品，测定螯合铁的含量，计算得出螯合率为95.05%。
实施例12
小肽复合物的制备方法12，包括如下步骤：
1）培养液的制备：将100kg粗蛋白含量为46%的豆粕，100kg粗蛋白含量为60%的大米蛋白粉，100kg粗蛋白含量为65%的大豆浓缩蛋白，8kg蔗糖，用水定容到 1000L，用盐酸或氢氧化钠调整反应液pH值到6.8，121℃灭菌18分钟；
2）小肽发酵液制备：灭菌结束，培养液温度降到45℃后，加入2.4kg中性蛋白酶（400U/g蛋白原料），45℃酶解12h，得到小肽酶解液；将在32℃恒温摇床中，200r/min振荡培养24h后的地衣芽孢杆菌菌种液和枯草芽孢杆菌菌种液接入小肽酶解液中，使酶解中地衣芽孢杆菌菌体浓度约为5×107cfu/ml，枯草芽孢杆菌菌体浓度约为5×107cfu/ml，32℃培养24小时后，得到小肽发酵液；
3）测定小肽发酵液干物质中小肽的含量为22.01%，约0.17mol，转化率为39.64%；
4）将发酵液温度升高至85～90℃，保持20分钟，然后将发酵液温度调整到60℃，按2.25：1的肽铁摩尔比添加硫酸亚铁，用盐酸或氢氧化钠调整反应液pH值到5，鳌合3h，得到小肽螯合铁复合物；
5）将小肽螯合铁复合物置于内热烘箱中，145℃进行干燥，得成品，测定螯合铁的含量，计算得出螯合率为96.47%。
实施例13
小肽复合物的制备方法13，包括如下步骤：
1）培养液的制备：50kg粗蛋白含量为46%的豆粕，20kg粗蛋白含量为50%的玉米蛋白粉，15kg粗蛋白含量为35%菜粕，20kg粗蛋白含量为48%的花生粕，95kg粗蛋白含量为60%的大米蛋白粉，100kg粗蛋白含量为65%的大豆浓缩蛋白，6kg葡萄糖，用水定容到 1000L，用盐酸或氢氧化钠调整反应液pH值到6.8，121℃灭菌18分钟；
2）小肽发酵液制备：灭菌结束，培养液温度降到45℃后，加入3.0kg中性蛋白酶（500U/g蛋白原料），45℃酶解12h，得到小肽酶解液；将在32℃恒温摇床中，200r/min振荡培养24h后的地衣芽孢杆菌菌种液和纳豆芽孢杆菌菌种液接入小肽酶解液中，使酶解中地衣芽孢杆菌菌体浓度约为5×107cfu/ml，纳豆芽孢杆菌菌体浓度约为5×107cfu/ml，32℃培养24小时后，得到小肽发酵液；
3）测定小肽发酵液干物质中小肽的含量为20.75%，约0.16mol，转化率为37.62%；
4）将发酵液温度升高至85～90℃，保持20分钟，然后将发酵液温度调整到60℃，按2.25：1的肽铁摩尔比添加硫酸亚铁，用盐酸或氢氧化钠调整反应液pH值到5，鳌合3h，得到小肽螯合铁复合物；
5）将小肽螯合铁复合物置于内热烘箱中，145℃进行干燥，得成品，测定螯合铁的含量，计算得出螯合率为96.87%。
实施例14
小肽复合物的制备方法14，包括如下步骤：
1）培养液的制备：50kg粗蛋白含量为46%的豆粕，20kg粗蛋白含量为50%的玉米蛋白粉，30kg粗蛋白含量为35%菜粕，20kg粗蛋白含量为48%的花生粕，60kg粗蛋白含量为60%的大米蛋白粉，20kg粗蛋白含量为80%的小麦蛋白粉，100kg粗蛋白含量为65%的大豆浓缩蛋白，4kg蔗糖，4g葡萄糖，用水定容到 1000L，用盐酸或氢氧化钠调整反应液pH值到6.8，121℃灭菌18分钟；
2）小肽发酵液制备：灭菌结束，培养液温度降到45℃后，加入4.2kg中性蛋白酶（700U/g蛋白原料），45℃酶解12h，得到小肽酶解液；将在32℃恒温摇床中，200r/min振荡培养24h后的枯草芽孢杆菌菌种液接入小肽酶解液中，枯草芽孢杆菌菌体浓度约为5×107～10×107cfu/ml，32℃培养24小时后，得到小肽发酵液；
3）测定小肽发酵液干物质中小肽的含量为21.31%，约0.16mol，转化率为38.58%；
4）将发酵液温度升高至85～90℃，保持20分钟，然后将发酵液温度调整到60℃，按2.25：1的肽铁摩尔比添加碳酸亚铁，用盐酸或氢氧化钠调整反应液pH值到5，鳌合3h，得到小肽螯合铁复合物；
5）将小肽螯合铁复合物置于内热烘箱中，145℃进行干燥，得成品，测定螯合铁的含量，计算得出螯合率为96.97%。
实施例15
小肽复合物的制备方法15，包括如下步骤：
1）培养液的制备：50kg粗蛋白含量为46%的豆粕，20kg粗蛋白含量为50%的玉米蛋白粉，15kg粗蛋白含量为35%菜粕，20kg粗蛋白含量为48%的花生粕，95kg粗蛋白含量为60%的大米蛋白粉，100kg粗蛋白含量为65%的大豆浓缩蛋白，3kg蔗糖，3kg葡萄糖，2kg淀粉，用水定容到 1000L，用盐酸或氢氧化钠调整反应液pH值到6.8，121℃灭菌18分钟；
2）小肽发酵液制备：灭菌结束，培养液温度降到45℃后，加入4.2kg中性蛋白酶（700U/g蛋白原料），45℃酶解12h，得到小肽酶解液；将在32℃恒温摇床中，200r/min振荡培养24h后的纳豆芽孢杆菌菌种液接入小肽酶解液中，使纳豆芽孢杆菌菌体浓度约为5×107～10×107cfu/ml，36℃培养24小时后，，得到小肽发酵液；
3）测定小肽发酵液干物质中小肽的含量为20.65%，约0.16mol，转化率为37.45%；
4）将发酵液温度升高至85～90℃，保持20分钟，然后将发酵液温度调整到60℃，按3：1的肽铁摩尔比添加硫酸亚铁，用盐酸或氢氧化钠调整反应液pH值到5，鳌合3h，得到小肽螯合铁复合物；
5）将小肽螯合铁复合物置于内热烘箱中，145℃进行干燥，得成品，测定螯合铁的含量，计算得出螯合率为96.65%。
实施例16
小肽复合物的制备方法16，包括如下步骤：
1）培养液的制备：50kg粗蛋白含量为46%的豆粕，20kg粗蛋白含量为50%的玉米蛋白粉，15kg粗蛋白含量为35%菜粕，20kg粗蛋白含量为48%的花生粕，95kg粗蛋白含量为60%的大米蛋白粉，100kg粗蛋白含量为65%的大豆浓缩蛋白，3kg蔗糖，3kg葡萄糖，2kg淀粉，用水定容到 1000L，用盐酸或氢氧化钠调整反应液pH值到6.8，121℃灭菌18分钟；
2）小肽发酵液制备：灭菌结束，培养液温度降到45℃后，加入4.2kg中性蛋白酶（700U/g蛋白原料），45℃酶解12h，得到小肽酶解液；将在32℃恒温摇床中，200r/min振荡培养24h后的地衣芽孢杆菌菌种液接入小肽酶解液中，使酶解中地衣芽孢杆菌菌体浓度约为5×107～10×107cfu/ml，33℃培养24小时后，得到小肽发酵液；
3）测定小肽发酵液干物质中小肽的含量为20.31%，约0.16mol，转化率为36.83%；
4）将发酵液温度升高至85～90℃，保持20分钟，然后将发酵液温度调整到60℃，按2.25：1的肽铁摩尔比添加硫酸亚铁，用盐酸或氢氧化钠调整反应液pH值到5，鳌合3h，得到小肽螯合铁复合物；
5）将小肽螯合铁复合物置于内热烘箱中，145℃进行干燥，得成品，测定螯合铁的含量，计算得出螯合率为96.94%。
本发明的小肽螯合铁在动物胃内稳定性
从有机微量元素吸收利用机制来讲，其只要在小肠以氨基酸或小肽螯合整体形式通过黏膜细胞膜、黏膜细胞和基底细胞膜进入血液的。因此如果有机微量元素在单胃低pH酸性条件下解离，它的生物学价值就会大打折扣，这一点在反刍动物上更需注意，因为它不仅有真胃还有反刍胃。测定有机微量元素螯合物的稳定性能够较为真实的反应螯合物在经过胃液消化处理后其螯合率的变化情况，即能真实反应螯合物在体内的状态与性能。
此种检测方法较单纯的溶解度检测，或者络合强度的检测更为准确。因为溶解度主要与配基有关，如赖氨酸铜的溶解度好，蛋氨酸铜的溶解度就很差。检测络合物强度（Qf值），同样不能反映有机微量元素在复杂的生物体内的稳定性。虽然生物体内主要是水环境，但生物体内有各种酶类、金属离子和诸多复杂的有机化合物，消化道不同部位酸碱状态不同，均影响着有机微量元素在体内的稳定状态。所以该方法结合是建立在模拟生物体自身生理生化环境的条件下形成的，从而更能准确反映有机微量元素螯合物的体内的状态。
1. 原理
1)利用有机微量元素不溶于甲醇的原理测定产品中微量元素的螯合率。
2)模拟猪胃环境和猪胃食物平均排空时间，进行氨基酸或小肽螯合微量元素体外模拟实验，经模拟实验处理的氨基酸或小肽螯合微量元素样品的螯合率与处理前氨基酸或小肽螯合微量元素样品的螯合率的比值，即为被测样品的动物胃内稳定性。
2. 材料
猪胃蛋白酶15000U，柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液pH2.5（0.1mol/L柠檬酸和0.2mol/L磷酸氢二钠,按0.40:10.60的体积比配制）；氢氧化钠0.2M，盐酸0.2M。
3.方法与步骤 3.1最佳胃蛋白酶添加量的确定。
取pH2.5的柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲溶液50ml，分别加入0.83、1.67、3.33、6.67、13.3、26.7、33.3mg猪胃蛋白酶(活力15000U)，配制成不同胃蛋白酶活性的模拟胃液，其胃蛋白酶活力分别为250，500，1000，2000，4000，10000U/ml，分别处理有机微量元素螯合物（杨琳等，2001；王在贵等，2009；王利民等，2009）。
3.2 处理时间的确定
根据猪的平均胃排空时间为2h来确定处理时间。
3.3 测试样品的模拟胃液处理
准确称量被测样品10.0g加入50ml模拟猪胃液中，调节pH值为2.5，置于39℃恒温水浴锅中处理2h，每隔10min分钟搅拌一次。干燥。取处理后的样品进行螯合率的测定。
3.4模拟胃内稳定系数的计算
模拟胃内稳定系数X= A/B
式中：X——被测样品的模拟动物胃环境稳定性（%）。
A——处理后样品螯合率（%）。
B——被测样品处理前螯合率（%）。
计算结果保留到小数点后两位。
经上述方法测得实施例1～16的小肽螯合铁样品的稳定性如表2所示：
动物实验
360头哺乳期母猪随机分成18组进行实验。实验饲料采用常规母猪商品料，每吨饲料加入300g硫酸锌，500g硫酸铜，150g硫酸锰，在此基础上，实验1组加入300g富马酸亚铁，实验2组加300g的甘氨酸铁，实验3～18组分别加入300g本发明实施例1~16的小肽螯合铁复合物。实验进行36天，结果表明：与无机铁、氨基酸螯合铁相比，在饲料中加入等量的本发明的小肽螯合铁复合物可以有效改善母猪的初乳铁含量，有效改善仔猪的血红蛋白含量、乳铁蛋白含量（见表3）。
以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。
Claims (10)
1.一种小肽螯合铁复合物的制备方法，包括如下步骤：
1）将蛋白原料、碳源和水配制成培养液，灭菌；
2）将芽孢菌接种到灭菌后的培养液中，30～37℃下振荡培养18～30h后，加入蛋白酶，35～50℃，pH6.0～7.5，继续酶解6～12h，得到小肽发酵液；或者是：往培养液中加入蛋白酶，35～50℃，pH6.0～7.5，酶解6～12h后，接种芽孢菌，30～37℃下继续振荡培养18～30h，得到小肽发酵液；
3）测定小肽发酵液中小肽的含量，灭酶后，继续加入水溶性铁盐，混合均匀，控制反应温度在55～65℃，pH为5～6，进行螯合反应；
4）将反应产物干燥，得到小肽螯合铁复合物。
2.根据权利要求1所述的小肽螯合铁复合物的制备方法，其特征在于：所述蛋白原料为豆粕、大米蛋白粉、小麦蛋白粉、玉米蛋白粉、棉粕、花生粕、马铃薯蛋白、菜粕、大豆浓缩蛋白中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的小肽螯合铁复合物的制备方法，其特征在于：所述碳源为葡萄糖、蔗糖、淀粉中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的小肽螯合铁复合物的制备方法，其特征在于：每100ml培养液中，含有蛋白原料20～30g、碳源0.1～1g。
5.根据权利要求1所述的小肽螯合铁复合物的制备方法，其特征在于：所述芽孢菌为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）或/和枯草芽孢杆菌（Bcillus subtilis）或/和纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）。
6.根据权利要求1所述的小肽螯合铁复合物的制备方法，其特征在于：所述芽孢菌的接种浓度为5×107～10×107cfu/ml培养液。
7.根据权利要求1所述的小肽螯合铁复合物的制备方法，其特征在于：所述蛋白酶为中性蛋白酶，加入量为400～700U/g蛋白原料。
8.根据权利要求1所述的小肽螯合铁复合物的制备方法，其特征在于：步骤3）中，小肽与水溶性铁盐的摩尔比为1～3：1。
9.根据权利要求1所述的小肽螯合铁复合物的制备方法，其特征在于：所述水溶性铁盐为富马酸亚铁、硫酸亚铁、柠檬酸亚铁、乳酸亚铁、氯化亚铁、碳酸亚铁中的至少一种。
10.权利要求1～9任一项的方法制备得到的小肽螯合铁复合物作为饲料添加剂的应用。
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