CN101735992A - 饲料工业专用的外源性复合酶制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及饲料工业专用的外源性复合酶制剂及其制备方法和应用，其中复合酶制剂含木聚糖酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶、纤维素酶、果胶酶等五种水溶性非淀粉多糖酶和植酸酶。本发明所含水溶性非淀粉多糖酶和植酸酶之间活性配比根据常见饲料原料中非淀粉多糖及植酸的种类和含量设计，既能够充分发挥两种酶之间的协同效应，又具有最科学经济配比。本发明可提高饲料中非淀粉多糖类抗营养因子及植酸的降解效率，消除其抗营养作用，提高饲料的吸收和转化率，提高饲料中磷利用率，大幅降低无机磷的用量，降低生产成本，为饲料加工企业和养殖户带来可观的经济效益，同时能够大大降低动物排泄物中氮和磷的含量，从而减少环境污染，具有显著的社会效益。

Description

饲料工业专用的外源性复合酶制剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及饲料用酶制剂，尤其涉及一种饲料工业专用的外源性复合酶制剂及其制备方法和应用。

背景技术

改革开放以来，我国国民经济持续高速发展，人民生活水平显著提高，对畜产品的需求也随之增加。畜牧业的迅速发展导致对饲料需求量的锐升，我国人均耕地面积不足世界的1/2，人口众多，资源相对缺乏，如何开发各种植物资源服务于畜牧及饲料行业的发展至关重要。近年来，受国际能源价格飙升的影响，生产玉米乙醇获利良多，导致玉米价格大幅度上涨。作为饲料主要能量原料，玉米占饲料配方中的比重极大，玉米价格飞涨，使得畜牧业本来就偏紧的玉米供应更是严重压缩，“人车争粮”已经成为一个现实的社会问题。与此同时，国际大豆近年来价格也是成倍的上涨，饲料中主要蛋白原料豆粕的价格则水涨船高；而随着磷矿资源的日益减少，磷酸氢钙及磷酸二氢钙的价格也是涨幅惊人。以上诸多因素的叠加极大地增加了畜牧业生产成本，使得众多的饲料厂家开始更多的尝试使用小麦、米糠及其它工业副产品、棉粕、菜粕及其他杂粕等来代替玉米和豆粕；各种减少配方中无机磷的尝试也得到高度重视。

小麦、工副产品料及杂粕等原料在配方中大量使用的原因是其含有较多的水溶性非淀粉多糖(SNSP)及植酸(Phyticacid)，是单胃动物主要的抗营养因子，是影响这些物质在饲料配方中大量使用的主要原因。水溶性非淀粉多糖(SNSP)主要有：阿拉伯木聚糖、β-甘露聚糖、纤维素、葡聚糖、果胶等。

水溶性非淀粉多糖(SNSP)不能被单胃动物所消化利用，而且阻碍其它营养物质吸收、利用，并造成饲料利用率下降、畜禽胃肠疾病等负面影响，主要抗营养作用表现在：(1)增加肠道食糜粘度，使食糜流速减慢，降低采食量；阻止消化酶与食糜的结合，降低消化率，与消化酶结合，增加消化酶分泌量。(2)营养屏障作用。SNSP是植物细胞壁的重要组成成份，阻碍内源酶进入细胞内消化其中淀粉、蛋白质、脂肪等营养物质。(3)增加有害菌在肠道后段的繁殖，粪便含水量增加，使养殖环境变差，加大疾病发生机会。

植酸是植物性原料中普遍存在的抗营养因子，在玉米、麦麸、米糠、豆粕、棉粕等杂粕的含量中均较高。该物质对单胃动物的营养吸收利用造成很大的负面影响。植酸抗营养作用主要是由其极强鳌合能力造成：(1)植酸和磷及其它微量元素(钙、锌、锰、镁、铜、碘、钼)鳌合成植酸-矿物质复合物，使这些元素不能被动物利用。(2)植酸在低于蛋白质等电点的酸性条件下，与蛋白质直接鳌合成不溶解的植酸-氨基酸鳌合物，从而使蛋白质消化率降低；在高于蛋白质等电点的碱性条件下，植酸先与矿物质元素阳离子鳌合成植酸-矿物质复合物，再与氨基酸鳌合成不溶解的植酸-矿物质-氨基酸三元复合物；这两类植酸-氨基酸鳌合物都不能被蛋白酶水解，所以同时影响饲料中蛋白质和矿物质的消化率。(3)植酸在酸性至中性条件下鳌合能力最强，而大部分消化道的pH正在这个范围，植酸与动物体内消化酶结合，降低消化酶的活性，使消化率下降。植酸对单胃动物的营养吸收利用造成很大的负面影响。

饲料中添加酶制剂是消除SNSP和植酸等抗营养因子、提高配方中小麦、副料和杂粕用量的有效方法，既可以节省饲料成本，又可以促进消化，减少动物粪尿中氮、磷等矿物质的排放，减轻环境污染发放。目前，市售的非淀粉多糖酶制剂，往往其中某一种酶活性配备很高，其它他酶活性配比极低或只是象征性的有一些，不能够较全面的消除SNSP的抗营养作用，更不能做到根据酶的底物量和比例来确定酶活及比例，甚至忽视植酸络合而造成的活性破坏。对饲料抗营养因子含量或种类针对性较差。

已有研究表明，植酸酶对植酸的水解不仅取决于植酸酶的活性，还取决于植酸酶与植酸的接触程度。非淀粉多糖是构成植物细胞壁的重要成分，水溶性非淀粉多糖的粘性会阻碍动物体对植酸酶作用于植酸的产物肌醇和磷酸的吸收，非淀粉多糖酶能加速细胞壁的破裂并降低粘度，可为植酸酶与植酸的接触提供更多机会，从而加速了植酸从植酸复合物中释放。与此同时，在动物体内的酸性条件下，饲料中的植酸具有很强的鳌合能力，能鳌合饲料中添加的外源酶和部分动物内源酶，对SNSP酶也不例外，这样一部分酶被鳌合，势必会降低酶的活性，使消除抗营养作用降低。通过植酸酶对植酸的降解，可提高非淀粉多糖酶与非淀粉多糖的接触效率。因而，两类酶的组合更能发挥出协同效应，提高整体的降解水平。但两类酶配合使用时，各自的活性应该如何配比，怎样才能减少浪费，获得最佳经济效益，尚未有研究。

基于以上情况，为了更科学的配比酶活以较全面消除水溶性非淀粉多糖和植酸的抗营养作用，提高饲料的吸收和转化率，降低生产成本，减少环境污染，并减少各单酶的浪费，降低成本，发明人经过深入实践与科学实验，针对当前饲用酶制剂的不足，发明了一种饲料复合酶制剂。

发明内容

本发明的目的就是为解决大部分酶制剂产品的功能缺陷而提供一种能较全面消除饲料的抗营养作用、提高饲料吸收率和转化率、同时具有最科学、最经济配比的饲料工业专用的外源性复合酶制剂及其制备方法和应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

饲料工业专用的外源性复合酶制剂，其特征在于，包含木聚糖酶，β-甘露聚糖酶，纤维素酶，β-葡聚糖酶，果胶酶等五种水溶性非淀粉多糖酶(SNSP酶)，并同时含有植酸酶；该外源性复合酶制剂包含固态型或液态型两种剂型。

当添加量为200g/吨饲料时，固态型外源性复合酶制剂中各酶酶活性为：3800U/g≤木聚糖酶活性≤5700U/g，1800U/g≤β-甘露聚糖酶活性≤2500U/g，1900U/g≤纤维素酶活性≤2600U/g，1200U/g≤β-葡聚糖酶活性≤2050U/g，2450U/g≤果胶酶活性≤2920U/g，2250U/g≤植酸酶活性≤2650U/g。

当添加量为150ml/吨饲料时，液态型外源性复合酶制剂中各酶活性为：5060U/ml≤木聚糖酶活性≤7600U/ml，2400U/ml≤β-甘露聚糖酶活性≤3350U/ml，2550U/ml≤纤维素酶活性≤3480U/ml，1600U/ml≤β-葡聚糖酶活性≤2750U/ml，3260U/ml≤果胶酶活性≤3890U/ml，3000U/ml≤植酸酶活性≤3530U/ml。

所述的木聚糖酶，β-甘露聚糖酶，纤维素酶，β-葡聚糖酶，果胶酶等五种水溶性非淀粉多糖酶各酶活性之和与植酸酶活性之间的最佳活性比是5.5∶1。

饲料工业专用的外源性复合酶制剂的制备方法，其特征在于，该方法包括：

(1)五种水溶性非淀粉多糖酶的制备，包括木聚糖酶的制备，β-甘露聚糖酶的制备，纤维素酶的制备，β-葡聚糖酶的制备，果胶酶的制备；

(2)植酸酶的制备；

(3)将制备得到的五种水溶性非淀粉多糖酶与植酸酶按比例组合，得到饲料工业专用的外源性复合酶制剂。

所述的木聚糖酶的制备包括以下工艺步骤：

(1)发酵培养

a.菌种与培养基

菌种黑曲霉斜面培养基(PDA)：马铃薯400g、葡萄糖20g、琼脂18g、水1000ml，液体种子培养基：葡萄糖50g、蛋白胨0.20g、(NH₄)₂HPO₄0.56g、KH₂PO₄0.144g、MgSO₄·7H₂O 0.12g、啤酒45ml、蒸馏水1000ml，发酵培养基培养为：玉米芯5％，K₂HPO₄0.2％，豆粕2％，麸皮93％，水含量60％；

b.菌种培养

挑取PDA斜面培养基上单菌落于液体种子培养基，200r/min，摇瓶培养，温度28℃，时间24h，孢子数大于109/ml；

c.发酵培养

按8％接种量将种子培养液接种于发酵培养基上，充分搅拌混匀，温度30℃，12小时翻曲一次，培养64h；测湿曲酶活可达15000U/g以上；木聚糖酶活性测定参照DNS法，于2.4mL0.5％桦木木聚糖溶液(pH4.6柠檬酸2Na₂HPO₄缓冲液配制)中加入0.1mL适当稀释的酶液，50℃准确反应15min，立即加入2.5ml DNS试剂终止反应，沸水浴7min显色，迅速冷却后加水5mL混匀，于540nm比色；每分钟产生相当于1μmol还原糖(以木糖计)的酶量定义为1个酶活性单位(IU)；

(2)酶的提取

酶的分离纯化除特别注明外，所有纯化过程均在10℃以下进行，所用缓冲液均为pH7.5，0.02mol/L的Na₂HPO₄NaH₂PO₄缓冲溶液；取一定量的固态发酵曲，用6倍体积缓冲液40℃振荡浸提30min，过滤收集第1次滤液，得粗酶液，于粗酶液中添加硫酸铵至65％饱和度，4℃静置过夜，离心(4℃，10000r/min，15min)，弃上清液；沉淀用少量缓冲液溶解，测酶活，根据酶活检测结果，选择进行浓缩或稀释，用于配制复合酶。

所述的β-甘露聚糖酶的制备包括以下工艺步骤：

(1)发酵培养

a.菌种与培养基

菌株Bacillus Lentus GL-5种子培养基(质量浓度，g/L)：槐豆胶15，牛肉蛋白胨8，酵母提取物4，KH₂PO₄MgSO₄·7H₂O 0.25；发酵培养基(质量浓度，g/L)：槐豆胶15，牛肉蛋白胨8，酵母提取物4，KH₂PO₄，MgSO₄.7H₂O 0.25；

b.菌种培养

挑取Bacillus Lentus GL-5单菌落，接种于种子培养基，培养温度35℃，摇床转速200r/min，时间24h，活菌计数大于1010个/ml；

c.发酵培养

按照5％～10％的接种量将摇瓶培养菌种接入发酵培养基，培养时间48小时，温度37℃，通风量1L/L/min，48小时左右测发酵液酶活酶活，酶活大于1900U/ml；β-甘露聚糖酶活力测定参照Akino方法，在0.9ml0.5％(W/V)角豆胶底物中(pH9.0，0.05mol/L甘氨酸-NaOH缓冲液配制)加入适当稀释的酶液0.1ml，50℃水浴反应10min，用DNS法测定产生的还原糖量；酶活力定义为：在上述反应条件下，每分钟释放1μmol相当于甘露糖的还原糖所需的酶量为一个酶活力单位；

(2)酶的提取

发酵液于4℃14000rpm/min离心去除菌体和残渣，得上清液即为粗酶液，在上清液中缓慢加入硫酸铵至30％饱和度，4℃过夜，9000rpm/min去除杂蛋白，去除杂蛋白，于上清液中缓慢加入硫酸铵至饱和度85％，4℃过夜，收集沉淀，40℃干燥，用于配制固态复合酶制剂，溶于少量pH9.0、0.01mol/LTris-HCl缓冲液中，经蒸馏水透析去除铵离子，依酶活检测结果进行浓缩或者稀释，用于配制复合酶。

所述的纤维素酶的制备包括以下工艺步骤：

(1)发酵培养

a.菌种与培养基

菌种黑曲霉(A.niger)，察氏培养基：NaNO₃3.0g、KCl 0.5g、FeSO₄0.01g、K₂HPO₄1.0g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、蔗糖20.0g、琼脂20.0g、水1000ml，pH6.7；液体种子培养基：葡萄糖50g、蛋白胨0.20g、(NH₄)2HPO₄0.56g、KH₂PO₄0.144g、MgSO₄·7H₂O 0.12g、啤酒45ml、蒸馏水1000ml；发酵培养基(按以下比例配制)：麸皮60g、纤维素粉40g、豆粕10g、(NH₄)₂SO₄2g、MgSO₄·7H₂O 0.05g、K₂HPO₄0.18g水1000ml；上述培养基灭菌条件：压力为1.01×105Pa，时间为30min；

b.菌种培养

黑曲霉菌种接于察氏培养基上30℃培养48h，挑单菌落，接种于种子培养基，培养温度30℃，摇床转速200r/min，时间24h，孢子数大于1010个/ml；

c.发酵培养

按照5％的接种量将摇瓶培养菌种接入发酵培养基，充分搅拌混匀，进行固体发酵，培养时间72小时，温度30℃，12小时翻曲一次，72小时左右测发酵液酶活酶活，酶活大于9000U/g；以1.0ml 2.0％(w/v)CMC溶液为底物(用pH5.0柠檬酸缓冲液配制)，加0.5ml稀释酶液，于50℃保温30min，然后加入1.0ml DNS溶液，沸水浴煮沸5min，再放入冷水中冷却至室温；用721分光光度计在530nm处测定光密度OD值，同时相同条件下作空白样调零；酶活力定义：在pH5.0、50℃条件下，30min内1g固体酶粉水解羧甲基纤维素钠生成1μmol葡萄糖的酶量，称为1个酶活力单位；

(2)酶的提取

发酵结束后，将湿酶曲于40℃下低温烘干、粉碎，可用于配制固态复合酶；称取适量干酶曲，加入6倍体积缓冲溶液40℃浸提1h，过滤，将经过3000r/min离心所得上清，加入3倍体积的冷无水乙醇，充分沉淀后，再经3000r/min离心，将所得沉淀自然风干，依据酶活检测结果可用于配置固态复合酶制剂；需要时加入pH6.8 0.02mol/LNa₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液至发酵液体积，溶解沉淀即得粗酶液，根据酶活进行浓缩或者稀释用于配制复合酶制剂。

所述的β-葡聚糖酶的制备包括以下工艺步骤：

(1)发酵培养

a.菌种与培养基

菌种地衣芽孢杆菌GL-4，斜面培养基(g/l)：蔗糖6，蛋白胨10，酵母浸膏5，磷酸氢二钾，硫酸锰50ppm，NaOH调节pH7.0-7.2，琼脂粉20；液体发酵培养基：麦麸1.41％，鱼粉0.80％，硝酸钾0.34％，硫酸镁0.11％，起始pH6.0；

b.种子培养

0.9％生理盐水洗茄子瓶斜面得悬浮液，接入种子罐，35℃培养20h，得108/L孢子液；

c.发酵培养

5％接量将种子液接入发酵罐，罐压0.05MPa，搅拌270r/min，通风量1.2m3/(m3.min)，pH6.0，培养时间50小时，发酵液酶活大于1300U/ml；酶活检测1ml酶液在60℃，pH5.0的条件下，每分钟水解葡聚糖释放出1μmol葡萄糖的酶量，即一个酶活单位，以U/g表示；

(2)酶的提取

将发酵液14000r/min离心得上清液，上清液先用60％饱和硫酸铵沉淀，调至pH5.2，10000r/min离心10min，弃其沉淀，再将上清液用硫酸铵调饱和度至90％，离心收集沉淀，低温干燥，粉碎检测酶活可用于配制制固态复合酶；将上述沉淀其溶醋酸缓冲液(0.02mol/L，pH4.0)中，离心取上清，测酶酶活，依据检测结果决定浓缩或稀释，用于配制复合酶；

所述的果胶酶的制备包括以下工艺步骤：

(1)发酵培养

a.菌种与培养基

黑曲霉菌种，土豆葡萄糖培养基：土豆20％、葡萄糖2％、pH6.4，发酵培养基(g/l)：苹果渣4.5g、麸皮2.0g、豆饼粉2.0g、K₂HPO₄0.06g、(NH₄)₂SO₄0.085g、CaCl₂0.04g；

b.菌种制备

取黑曲霉单菌落于土豆葡萄糖培养基，28℃，摇瓶200r/min，培养时间24，孢子数大于109/ml；

c.发酵培养

在曲盘种进行，培养基厚度4cm，接种量0.05％，pH自然，28℃培养55小时，测酶活可达4000U/g；DNS法测酶活1g固体酶粉在40℃，pH4.2的条件下，每分钟水解果胶释放出1μmol半乳糖醛酸的酶量，即一个酶活单位，以U/g表示；

(2)酶的提取

取一定量的固态发酵曲，用6倍体积缓冲液40℃振荡浸提30min，过滤收集第1次滤液，再用4倍体积缓冲液洗涤滤渣，过滤收集第2次滤液，将第1、2次滤液合并，测定酶活力；在滤液中缓慢搅拌加入硫酸铵至饱和度为达20％，用氨水调其pH至8.0，4℃过夜，次日3000r/min离心，取上清液，缓慢加入固体硫酸铵，使其饱和度达90％，4℃过夜，次日离心，取沉淀，干燥，可用配制固态复合酶；将上述沉淀溶于适量0.05mol/L，pH5.2的醋酸钠缓冲液中，3000r/min离心，取上清，测酶活，根据酶活决定进行浓缩或稀释，用于配制液体型复合酶。

所述的植酸酶的制备包括以下工艺步骤：

(1)发酵培养

a.菌种与培养基

aspergillus niger s8菌种，种子培养基采用PDA培养基，固体培养基：麸皮∶米糠＝4∶6为主要培养基成分，添加1％(NH₄)₂SO₄，0.3％MgSO₄；

b.菌种制备

aspergillus nigers8菌种接入PDA摇瓶，200r/min培养30℃，培养24h，孢子数大于109个/ml；

c.发酵培养

接种量5％，30℃培养4天，30小时翻曲一次，发酵结束测酶活大于6500U/g，酶活定义1g固体酶粉在37℃，pH5.5的条件下，每分钟水解植酸十二钠1释放出1μmol无机磷的酶量，即一个酶活单位，以U/g表示；

(2)酶的提取

取一定量的固态发酵曲，用6倍体积缓冲液40℃振荡浸提30min，过滤收集第1次滤液，再用4倍体积缓冲液洗涤滤渣，过滤收集第2次滤液，将第1、2次滤液合并，测定酶活力；在滤液中缓慢搅拌加入硫酸铵至饱和度为达20％，用氨水调其pH至8.0，4℃过夜，次日3000r/min离心，取上清液，缓慢加入固体硫酸铵，使其饱和度达90％，4℃过夜，次日离心，取沉淀，干燥，可用配制固态复合酶；将上述沉淀溶于适量0.05mol/L，pH2的醋酸钠缓冲液中，3000r/min离心，取上清，测酶活，根据酶活决定进行浓缩或稀释，用于配制复合酶。

所述的五种水溶性非淀粉多糖酶与植酸酶按比例组合工艺包括：将以上工艺所获取的单酶依据水溶性非淀粉多糖与植酸在常见饲料原料中的含量和比例(如表1)计算酶的活性和比例范围，并组合，得外源性固态型复合酶制剂或液态

表1常见饲料原料中主要非淀粉多糖的种类及含量(％)

型复合酶制剂。

所述的木聚糖酶、β-甘露聚糖酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶，果胶酶等五种水溶性非淀粉多糖酶，以及植酸酶可以从市售产品中获取。

饲料工业专用的外源性复合酶制剂的应用，其特征在于，当用于颗粒饲料时，采用制粒过程的后喷方法，每吨饲料将150ml饲料工业专用的外源性复合酶制剂液体酶混合喷洒在制粒冷却后的动物饲料表面，以减少制粒过程中的高温高压高湿对酶活的破坏作用。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明复合酶制剂产品设计从植酸和可溶性非淀粉多糖两方面考虑消除饲料中的抗营养因子，且涉及可溶性非淀粉多糖酶酶种多，作用范围广。

饲料中的可溶性非淀粉多糖主要包括木聚糖、葡聚糖、甘露聚糖、纤维素、果胶酶5种，为了全面消除饲料中包含的抗营养因子，本发明较全面的把针对以上多糖的酶设计进了复合酶产品中，该复合酶涉及消除的可溶性非淀粉多糖的种类多，使用性更强，可用于的饲料原料更广。

考虑充分发挥可溶性非淀粉多糖酶和植酸酶的协同效应，并获得两类酶的最佳活性配比。

本发明涉及的各单酶酶活配比，是以饲料中各抗营养因子的含量比为依据，避免了市场上现有产品有的酶种酶活过低，不能彻底消除抗营养因子，又避免了有的酶种酶活过高造成成本增加浪费现象。

本发明能同时降低氮和磷两种物质对环境的污染。

SNSP酶的添加提高了动物对氮源的利用率，减少了排泄物中氮的含量，植酸酶将植酸分解产生肌醇和磷酸，无机物磷酸能被动物体吸收利用，减少了排泄物中磷的含量，这样通过使用本发明复合酶，能同时减少氮和磷对环境的污染，避免了现有市售产品添加后，动物排泄物中不是氮含量过高就是磷含量过高的现象发生。

本发明同时提供两种型态的复合酶制剂，固体剂型可用于粉料，液态型制剂通过制粒后喷技术用于颗粒料，可以有效避免制粒过程中出现热对酶的破坏作用。

所有的酶制剂都是具有活性的蛋白质，因而在极端情况下(如：高温、pH等)蛋白质发生变性，从而失去活性。颗粒料制粒过程中的高温高压和湿度可以消灭饲料中的杂菌，同样可以破坏任何酶制剂。因此如何克服饲料制粒过程种高温对酶活性的破坏成为饲料厂商亟待解决的难题和限制该行业发展的瓶颈。

为解决由于酶制剂在饲料制粒过程中活性破坏严重的难题，我们采用饲料复合酶液体制剂加之我们独有的制粒后喷技术。该制粒后喷技术主要包括三部分：感应系统、计算机系统、压力泵及喷洒系统。感应系统主要感应饲料颗粒大小、重量、流速，并转变为信号；计算机系统主要接收感应系统传来的信号，计算出单位时间内所喷洒酶制剂的容量及所需压力；压力泵及喷洒系统主要接收计算机系统的指示，适时把定量的酶制剂喷洒到颗粒饲料上。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

本发明复合酶制剂在猪养殖中的应用实例。

本发明饲料复合酶制剂在山东兖矿集团××养殖有限公司猪场进行。试验选择320头、体重15kg左右的杜洛克×长白×大约克健康仔猪(来自该场的200头母猪所产，胎次为3-4胎、出生日龄相近)按照体重、遗传一致的原则，随机分成10大组，其中1个为对照9个为试验组，每小组4个重复，每重复10头，公母各半，各组的起始体重经显著性分析差异不显著(P＜0.05)。日粮为玉米、小麦、豆粕型。试验用酶制剂为粉剂，活性如下：3800U/g≤木聚糖酶活性≤5700U/g，1800U/g≤β-甘露聚糖酶活性≤2500U/g，1900U/g≤纤维素酶活性≤2600U/g，1200U/g≤β-葡聚糖酶活性≤2050U/g，2450U/g≤果胶酶活性≤2920U/g，2250U/g≤植酸酶活性≤2650U/g。

酶制剂添加方案如下表所示：

表1SNSP酶和植酸酶添加比例

试验期开始、结束时，逐头称重，每天观察试验猪采食、粪便及活动情况，记录各试验组耗料量，发现病猪及时治疗，对淘汰和死亡猪，不作补充，但称其体重并计算当时其所在组的平均耗料量，试验在仔猪、中猪、大猪的前、中、后期不同阶段分别随机采取各组猪只的粪便，每组3个点。经过135天的试验结果如下：

处理组别

项目	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
											日增重(kg)	0.561	0.582	0.598	0.599	0.626	0.644	0.665	0.666	0.672	0.675
料肉比	3.38	3.29	3.21	3.19	3.11	3.04	2.95	2.95	2.90	2.87
											腹泻率(％)	5.62	5.22	5.31	5.37	4.26	4.12	4.09	3.97	3.67	3.50
排泄物氮含量(％)	1.66	1.55	1.47	1.40	1.86	1.54	1.36	1.33	1.25	1.23
											排泄物磷含量(％)	1.01	0.65	0.62	0.51	0.45	0.43	0.39	0.37	0.35	0.32

项目	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
											饲料增重成本(元/kg)	6.55	6.41	6.28	6.28	5.94	5.91	6.06	6.12	6.18	6.21

试验结果表明：添加本发明复合酶组的各项指标均高于对照组。随着酶制剂的添加量的增加，日增重、料肉比、腹泻率、排泄物氮含量、排泄物磷含量等指标改善度越大，从饲料增重成本角度考核以第6组实验成果最优；加本发明复合酶可以明显降低仔猪腹泻，这与酶降解饲料中的抗营养因子，促进饲料消化的机理相吻合；饲料中添加本发明复合酶能明显降低猪氮和磷的排放。

综合各项指标，猪饲料使用本发明复合酶制剂可促进猪只生长，提高饲料利用率，降低低猪只腹泻、死亡，有效提高养猪经济效益。在试验日粮条件下筛选得出本发明复合酶制剂的最佳添加量为200g/吨饲料，可溶性粉多糖酶各酶酶活性之和与植酸酶酶活性最佳活性比为：5.5∶1。

为了进一步验证本发明饲料复合酶制剂在猪养殖生产中的应用效果，根据中心试验的结果，选择最佳配比酶制剂200g/吨，在生产条件下作扩大试验。扩大试验场地选在安徽长丰县一猪场。试验为单因子对比试验，试验选择400头杜×长×大体重20千克健康仔猪，经过110天的试验，体重达95千克左右结束，试验分高营养组和低营养组，低营养组以20％的小麦替代玉米，并对配方作轻微调整。试验组添加200g/吨本发明饲料复合酶，并减少0.1％有效磷。试验统计了猪的增重、料肉比和经济效益，结果详见下表：

试验结果显示：在高营养日粮组中，试验组猪日增重高于对照组4.57％，平均料肉比低于对照组2.37％；在低营养日粮组中，添加本发明复合酶的猪日增重、料肉比比对照组更有优势，日增重高于对照组5.45％，平均料肉比低于对照组3.43％；测算每公斤增重成本，无论是高营养日粮还是低营养日粮，试验组的成本均低于对照组，尤其是低营养日粮，试验组的成本均明显低于对照组。

实施例2

本发明饲料复合酶制剂在肉鸡养殖中的应用实例。

中心试验我们选择在福建龙岩一科技有限公司鸡场进行。试验按肉鸡品种及日粮中本发明酶制剂的不同添加量设计。试验组饲料配方中按有效磷比对照组降低0.075％、0.1％、0.125％处理，其余与对照组相同。

试验各选择1000羽健康、食欲正常，采食量、出生日期一致的AA肉鸡，按照体重、遗传一致的原则，随机分成10组，1个试验组，9个对照组。每组5个重复，每重复100羽。试验采用液态型酶制剂，活性为：5060U/ml≤木聚糖酶活性≤7600U/ml，2400U/ml≤β-甘露聚糖酶活性≤3350U/ml，2550U/ml≤纤维素酶活性≤3480U/ml，1600U/ml≤β-葡聚糖酶活性≤2750U/ml，3260U/ml≤果胶酶活性≤3890U/ml，3000U/ml≤植酸酶活性≤3530U/ml。

酶制剂添加方案如下表所示：

表1SNSP酶和植酸酶添加比例

试验分为三阶段饲养，白鸡前、后期分别为0-20天、21-47天，黄鸡前、中、后期分别为0-30天、31-55天和55-83天。试验开始、结束时应于清晨空腹全部称重，试验前、中期结束时抽取5％称重，记录试验鸡只的体重、耗料及死亡等情况，统计各组鸡日增重、料肉比、腹泻率，排泄物含氮量、排泄物磷含量、饲料增重成本等指标，结果如下：

项目	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
											日增重(g)	44.26	45.95	46.80	47.70	48.20	48.6	48.90	49.20	49.40	49.6
料肉比	2.32	2.28	2.25	2.20	2.15	2.11	2.10	2.12	2.09	2.05
											腹泻率(％)	5.83	5.42	5.33	5.30	4.19	4.14	4.10	3.87	3.77	3.53
排泄物氮含量(％)	1.97	1.56	1.45	1.44	1.76	1.56	1.37	1.32	1.24	1.22
											排泄物磷含量(％)	0.99	0.64	0.61	0.50	0.43	0.40	0.38	0.36	0.35	0.31
饲料增重成本(元/kg)	5.86	5.77	5.71	5.68	5.67	5.61	5.68	5.71	5.73	5.75

试验结果表明：添加本发明复合酶组的各项指标均高于对照组。随着酶制剂的添加量的增加，日增重、料肉比、腹泻率、排泄物氮含量、排泄物磷含量等指标改善度越大，加本发明复合酶可以明显降低鸡腹泻，这与酶降解饲料中的抗营养因子，促进饲料消化的机理相吻合；饲料中添加本发明复合酶能明显降低鸡氮和磷的排放。

综合各项指标，鸡饲料使用本发明复合酶制剂可促进猪只生长，提高饲料利用率，降低低猪只腹泻、死亡，有效提高养猪经济效益。在试验日粮条件下筛选得出本发明液态型复合酶制剂的最佳添加量为150ml/吨饲料，可溶性非淀粉多糖酶各酶酶活性之和与植酸酶酶活性最佳活性比为：5.5∶1。

在完成本发明饲料复合酶在肉鸡上使用中心试验的前提下，发明人又在浙江长兴坞一肉鸡场和横山桥肉鸡场进行了扩大试验，进一步求证本发明复合酶在不同生产日粮条件下的使用效果，从而为在饲料业内全面推广应用提供科学的依据。试验采用AA白羽肉鸡和南京佳禾黄羽肉鸡，分别于自2007年8月2日至9月20日，7月16日至9月12日进行，试验为单因子对比试验，选择白羽肉鸡和黄羽肉鸡各6000羽，随机分成2组，每组3个重复，每重复1000羽，试验肉鸡三阶段饲养，采用常规的玉米豆粕型日粮，按试验设计方案分别加工成粗细适宜的粉饲料饲喂根据项目要求记录相关技术数据(肉鸡的增重、耗料、死亡等)，并进行效益分析。试验结果统计详见下表：

上述试验结果显示添加复合酶制剂日粮的鸡，无论是快速型生长的AA肉鸡还是生长相对慢的黄羽肉鸡，试验组增重、料肉比都高于对照组，改善率分别为5.13％、4.75％和5.83％、5.29％。试验组肉鸡的成活率都有改善。肉鸡饲料使用复合酶制剂在提高肉鸡生长速度降低料肉比的同时又可降低肉鸡的增重成本，无论是白羽肉鸡还是黄羽肉鸡，每公斤增重成本有4-6％的改善，以白鸡为例，每公斤增重成本比对照组下降0.25元，每羽鸡降低饲料成本0.63元，可以提高的经济效益相当可观。

由此可得出结论：在肉鸡日粮中添加本发明复合酶制剂，可促进肉鸡生长，提高成活率，有效提高养鸡经济效益。

实施例3

本发明饲料复合酶制剂在肉鸭养殖中的应用实例。

本发明饲料复合酶制剂在肉鸭养殖中应用的中心试验场地在张家港一鸭场进行。试验选择1000羽健康、正常、出生日期相近的樱桃谷肉鸭。按照体重、遗传一致的原则，随机分成10组，1个对照组，9个试验组，每组5个重复，每重复50羽；试验肉鸭采用二阶段饲养(前期、后期)，分别饲喂各期饲料，饲养周期约为42天；试验开始、试验结束时，应于清晨空腹称重，记录试验鸭的个体重，并记录各组试验鸭的饲料消耗量及死亡只数。试验用酶制剂为粉剂，活性如下：3800U/g≤木聚糖酶活性≤5700U/g，1800U/g≤β-甘露聚糖酶活性≤2500U/g，1900U/g≤纤维素酶活性≤2600U/g，1200U/g≤β-葡聚糖酶活性≤2050U/g，2450U/g≤果胶酶活性≤2920U/g，2250U/g≤植酸酶活性≤2650U/g。

酶制剂添加方案如下表所示：

表1SNSP酶和植酸酶添加比例

试验结果见下表：

试验项目	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
											全期日增重(g)	72.54	72.81	72.93	73.45	74.21	74.92	75.01	75.08	75.22	75.31
改善(％)		+0.37	+0.54	+1.25	+2.30	+3.28	+3.40	+3.50	+3.70	+3.82
											全期料肉比	2.23	2.20	2.18	2.16	2.15	2.14	2.15	2.16	2.16	2.19
改善(％)		-1.35	-2.24	-3.14	-3.58	-4.04	-3.58	-3.14	3.14	-1.79
											全期成活率(％)	91.04	92.46	93.51	94.37	95.22	96.68	96.89	96.95	97.05	97.22

试验项目	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
											差异(％)		+1.56	+2.71	+3.66	+4.59	+6.20	+6.42	+6.49	+6.60	+6.79
腹泻率(％)	5.96	5.72	5.68	5.51	5.05	4.63	4.51	4.31	4.26	4.19
											排泄物氮含量(％)	1.90	1.78	1.67	1.60	1.54	1.32	1.30	1.29	1.27	1.21
排泄物磷含量(％)	1.04	0.87	0.79	0.71	0.67	0.46	0.43	0.39	0.36	0.33
											增重成本(元/kg)	4.39	4.34	4.33	4.30	4.29	4.26	4.29	4.31	4.34	4.35

从上表可以看出10个试验组肉鸭的生长、料肉比均比对照组均有改善，其中试验组6的全程日增重比对照组提高3.28％，料肉比降低4.04％；试验组肉鸭的成活率比对照组提高1.5-6.7％，提高幅度较大，试验各组肉鸭的每公斤增重饲料成本与对照组比有不同程度的下降，说明使用本发明复合酶可降低肉鸭生产成本。综合上述试验结果，建议肉鸭饲料中以添加0.2kg/吨的本发明复合酶为宜。

为了进一步证实本发明复合酶在生产日粮条件下的使用效果，从而为在饲料业内全面推广应用提供科学的依据，发明人又在安徽省某禽业有限公司所属养鸭场进行了扩大试验。试验选择健康、体重接近的1日龄北京鸭和樱桃谷肉鸭各3600羽，随机分成3个处理组，每组3个重复，每个重复400羽，公、母自然混合；试验采用双因子(2×2)试验设计方法，试验组分别添加本发明复合酶0.1kg/吨和0.2kg/吨，试验期为49天，试验测定肉鸭的日增重、料重比和死亡率，结果如下：

上表的试验结果显示：北京鸭和樱桃谷鸭日增重均比对照组有提高，尤其是北京鸭，试验2组高于对照组4％；料肉比、死亡率均比对照组改善的幅度更明显；添加本发明饲料复合酶的试验组在每公斤增重成本上具有明显的优势，以北京鸭为例，添加酶制剂0.2kg/吨的试验组比对照组每千克增重降低成本0.60元，降低了12.12％。

Claims (14)

1.饲料工业专用的外源性复合酶制剂，其特征在于，包含木聚糖酶，β-甘露聚糖酶，纤维素酶，β-葡聚糖酶，果胶酶等五种水溶性非淀粉多糖酶(SNSP酶)，并同时含有植酸酶；该外源性复合酶制剂包含固态型或液态型两种剂型。

2.根据权利要求1所述的饲料工业专用的外源性复合酶制剂，其特征在于，当添加量为200g/吨饲料时，固态型外源性复合酶制剂中各酶酶活性为：3800U/g≤木聚糖酶活性≤5700U/g，1800U/g≤β-甘露聚糖酶活性≤2500U/g，1900U/g≤纤维素酶活性≤2600U/g，1200U/g≤β-葡聚糖酶活性≤2050U/g，2450U/g≤果胶酶活性≤2920U/g，2250U/g≤植酸酶活性≤2650U/g。

3.根据权利要求1所述的饲料工业专用的外源性复合酶制剂，其特征在于，当添加量为150ml/吨饲料时，液态型外源性复合酶制剂中各酶活性为：5060U/ml≤木聚糖酶活性≤7600U/ml，2400U/ml≤β-甘露聚糖酶活性≤3350U/ml，2550U/ml≤纤维素酶活性≤3480U/ml，1600U/ml≤β-葡聚糖酶活性≤2750U/ml，3260U/ml≤果胶酶活性≤3890U/ml，3000U/ml≤植酸酶活性≤3530U/ml。

4.根据权利要求2或3所述的饲料工业专用的外源性复合酶制剂，其特征在于，所述的木聚糖酶，β-甘露聚糖酶，纤维素酶，β-葡聚糖酶，果胶酶等五种水溶性非淀粉多糖酶各酶活性之和与植酸酶活性之间的最佳活性比是5.5∶1。

5.饲料工业专用的外源性复合酶制剂的制备方法，其特征在于，该方法包括：

(1)五种水溶性非淀粉多糖酶的制备，包括木聚糖酶的制备，β-甘露聚糖酶的制备，纤维素酶的制备，β-葡聚糖酶的制备，果胶酶的制备；

(2)植酸酶的制备；

(3)将制备得到的五种水溶性非淀粉多糖酶与植酸酶按比例组合，得到饲料工业专用的外源性复合酶制剂。

6.根据权利要求5所述的饲料工业专用的外源性复合酶制剂的制备方法，其特征在于，所述的木聚糖酶的制备包括以下工艺步骤：

(1)发酵培养

a.菌种与培养基

菌种黑曲霉斜面培养基(PDA)：马铃薯400g、葡萄糖20g、琼脂18g、水1000ml，液体种子培养基：葡萄糖50g、蛋白胨0.20g、(NH₄)₂HPO₄0.56g、KH₂PO₄0.144g、MgSO₄·7H₂O0.12g、啤酒45ml、蒸馏水1000ml，发酵培养基培养为：玉米芯5％，K₂HPO₄0.2％，豆粕2％，麸皮93％，水含量60％；

b.菌种培养

挑取PDA斜面培养基上单菌落于液体种子培养基，200r/min，摇瓶培养，温度28℃，时间24h，孢子数大于109/ml；

c.发酵培养

按8％接种量将种子培养液接种于发酵培养基上，充分搅拌混匀，温度30℃，12小时翻曲一次，培养64h；测湿曲酶活可达15000U/g以上；木聚糖酶活性测定参照DNS法，于2.4mL0.5％桦木木聚糖溶液(pH4.6柠檬酸2Na₂HPO₄缓冲液配制)中加入0.1mL适当稀释的酶液，50℃准确反应15min，立即加入2.5mlDNS试剂终止反应，沸水浴7min显色，迅速冷却后加水5mL混匀，于540nm比色；每分钟产生相当于1μmol还原糖(以木糖计)的酶量定义为1个酶活性单位(IU)；

(2)酶的提取

酶的分离纯化除特别注明外，所有纯化过程均在10℃以下进行，所用缓冲液均为pH7.5，0.02mol/L的Na₂HPO₄NaH₂PO₄缓冲溶液；取一定量的固态发酵曲，用6倍体积缓冲液40℃振荡浸提30min，过滤收集第1次滤液，得粗酶液，于粗酶液中添加硫酸铵至65％饱和度，4℃静置过夜，离心(4℃，10000r/min，15min)，弃上清液；沉淀用少量缓冲液溶解，测酶活，根据酶活检测结果，选择进行浓缩或稀释，用于配制复合酶。

7.根据权利要求5所述的饲料工业专用的外源性复合酶制剂的制备方法，其特征在于，所述的β-甘露聚糖酶的制备包括以下工艺步骤：

(1)发酵培养

a.菌种与培养基

菌株Bacillus Lentus GL-5种子培养基(质量浓度，g/L)：槐豆胶15，牛肉蛋白胨8，酵母提取物4，KH₂PO₄ MgSO₄·7H₂O 0.25；发酵培养基(质量浓度，g/L)：槐豆胶15，牛肉蛋白胨8，酵母提取物4，KH₂PO₄，MgSO₄.7H₂O0.25；

b.菌种培养

挑取Bacillus Lentus GL-5单菌落，接种于种子培养基，培养温度35℃，摇床转速200r/min，时间24h，活菌计数大于1010个/ml；

c.发酵培养

按照5％～10％的接种量将摇瓶培养菌种接入发酵培养基，培养时间48小时，温度37℃，通风量1L/L/min，48小时左右测发酵液酶活酶活，酶活大于1900U/ml；β-甘露聚糖酶活力测定参照Akino方法，在0.9ml0.5％(W/V)角豆胶底物中(pH9.0，0.05mol/L甘氨酸-NaOH缓冲液配制)加入适当稀释的酶液0.1ml，50℃水浴反应10min，用DNS法测定产生的还原糖量；酶活力定义为：在上述反应条件下，每分钟释放1μmol相当于甘露糖的还原糖所需的酶量为一个酶活力单位；

(2)酶的提取

发酵液于4℃14000rpm/min离心去除菌体和残渣，得上清液即为粗酶液，在上清液中缓慢加入硫酸铵至30％饱和度，4℃过夜，9000rpm/min去除杂蛋白，去除杂蛋白，于上清液中缓慢加入硫酸铵至饱和度85％，4℃过夜，收集沉淀，40℃干燥，用于配制固态复合酶制剂，溶于少量pH9.0、0.01mol/LTris-HCl缓冲液中，经蒸馏水透析去除铵离子，依酶活检测结果进行浓缩或者稀释，用于配制复合酶。

8.根据权利要求5所述的饲料工业专用的外源性复合酶制剂的制备方法，其特征在于，所述的纤维素酶的制备包括以下工艺步骤：

(1)发酵培养

a.菌种与培养基

菌种黑曲霉(A.niger)，察氏培养基：NaNO₃3.0g、KCl0.5g、FeSO₄0.01g、K₂HPO₄1.0g、MgSO₄·7H₂O0.5g、蔗糖20.0g、琼脂20.0g、水1000ml，pH6.7；液体种子培养基：葡萄糖50g、蛋白胨0.20g、(NH₄)2HPO₄0.56g、KH₂PO₄0.144g、MgSO₄·7H₂O0.12g、啤酒45ml、蒸馏水1000ml；发酵培养基(按以下比例配制)：麸皮60g、纤维素粉40g、豆粕10g、(NH₄)₂SO₄2g、MgSO₄·7H₂O0.05g、K₂HPO₄0.18g水1000ml；上述培养基灭菌条件：压力为1.01×105Pa，时间为30min；

b.菌种培养

黑曲霉菌种接于察氏培养基上30℃培养48h，挑单菌落，接种于种子培养基，培养温度30℃，摇床转速200r/min，时间24h，孢子数大于1010个/ml；

c.发酵培养

按照5％的接种量将摇瓶培养菌种接入发酵培养基，充分搅拌混匀，进行固体发酵，培养时间72小时，温度30℃，12小时翻曲一次，72小时左右测发酵液酶活酶活，酶活大于9000U/g；以1.0ml2.0％(w/v)CMC溶液为底物(用pH5.0柠檬酸缓冲液配制)，加0.5ml稀释酶液，于50℃保温30min，然后加入1.0mlDNS溶液，沸水浴煮沸5min，再放入冷水中冷却至室温；用721分光光度计在530nm处测定光密度OD值，同时相同条件下作空白样调零；酶活力定义：在pH5.0、50℃条件下，30min内1g固体酶粉水解羧甲基纤维素钠生成1μmol葡萄糖的酶量，称为1个酶活力单位；

(2)酶的提取

发酵结束后，将湿酶曲于40℃下低温烘干、粉碎，可用于配制固态复合酶；称取适量干酶曲，加入6倍体积缓冲溶液40℃浸提1h，过滤，将经过3000r/min离心所得上清，加入3倍体积的冷无水乙醇，充分沉淀后，再经3000r/min离心，将所得沉淀自然风干，依据酶活检测结果可用于配置固态复合酶制剂；需要时加入pH6.8 0.02mol/LNa₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液至发酵液体积，溶解沉淀即得粗酶液，根据酶活进行浓缩或者稀释用于配制复合酶制剂。

9.根据权利要求5所述的饲料工业专用的外源性复合酶制剂的制备方法，其特征在于，所述的β-葡聚糖酶的制备包括以下工艺步骤：

(1)发酵培养

a.菌种与培养基

菌种地衣芽孢杆菌GL-4，斜面培养基(g/l)：蔗糖6，蛋白胨10，酵母浸膏5，磷酸氢二钾，硫酸锰50ppm，NaOH调节pH7.0-7.2，琼脂粉20；液体发酵培养基：麦麸1.41％，鱼粉0.80％，硝酸钾0.34％，硫酸镁0.11％，起始pH6.0；

b.种子培养

0.9％生理盐水洗茄子瓶斜面得悬浮液，接入种子罐，35℃培养20h，得108/L孢子液；

c.发酵培养

5％接量将种子液接入发酵罐，罐压0.05MPa，搅拌270r/min，通风量1.2m3/(m3.min)，pH6.0，培养时间50小时，发酵液酶活大于1300U/ml；酶活检测1ml酶液在60℃，pH5.0的条件下，每分钟水解葡聚糖释放出1μmol葡萄糖的酶量，即一个酶活单位，以U/g表示；

(2)酶的提取

将发酵液14000r/min离心得上清液，上清液先用60％饱和硫酸铵沉淀，调至pH5.2，10000r/min离心10min，弃其沉淀，再将上清液用硫酸铵调饱和度至90％，离心收集沉淀，低温干燥，粉碎检测酶活可用于配制制固态复合酶；将上述沉淀其溶醋酸缓冲液(0.02mol/L，pH4.0)中，离心取上清，测酶酶活，依据检测结果决定浓缩或稀释，用于配制复合酶。

10.根据权利要求5所述的饲料工业专用的外源性复合酶制剂的制备方法，其特征在于，所述的果胶酶的制备包括以下工艺步骤：

(1)发酵培养

a.菌种与培养基

黑曲霉菌种，土豆葡萄糖培养基：土豆20％、葡萄糖2％、pH6.4，发酵培养基(g/l)：苹果渣4.5g、麸皮2.0g、豆饼粉2.0g、K₂HPO₄0.06g、(NH₄)₂SO₄0.085g、CaCl₂0.04g；

b.菌种制备

取黑曲霉单菌落于土豆葡萄糖培养基，28℃，摇瓶200r/min，培养时间24，孢子数大于109/ml；

c.发酵培养

在曲盘种进行，培养基厚度4cm，接种量0.05％，pH自然，28℃培养55小时，测酶活可达4000U/g；DNS法测酶活1g固体酶粉在40℃，pH4.2的条件下，每分钟水解果胶释放出1μmol半乳糖醛酸的酶量，即一个酶活单位，以U/g表示；

(2)酶的提取

取一定量的固态发酵曲，用6倍体积缓冲液40℃振荡浸提30min，过滤收集第1次滤液，再用4倍体积缓冲液洗涤滤渣，过滤收集第2次滤液，将第1、2次滤液合并，测定酶活力；在滤液中缓慢搅拌加入硫酸铵至饱和度为达20％，用氨水调其pH至8.0，4℃过夜，次日3000r/min离心，取上清液，缓慢加入固体硫酸铵，使其饱和度达90％，4℃过夜，次日离心，取沉淀，干燥，可用配制固态复合酶；将上述沉淀溶于适量0.05mol/L，pH5.2的醋酸钠缓冲液中，3000r/min离心，取上清，测酶活，根据酶活决定进行浓缩或稀释，用于配制液体型复合酶。

11.根据权利要求5所述的饲料工业专用的外源性复合酶制剂的制备方法，其特征在于，所述的植酸酶的制备包括以下工艺步骤：

(1)发酵培养

a.菌种与培养基

aspergillus niger s8菌种，种子培养基采用PDA培养基，固体培养基：麸皮∶米糠＝4∶6为主要培养基成分，添加1％(NH₄)₂8O₄，0.3％MgSO₄；

b.菌种制备

aspergillus nigers8菌种接入PDA摇瓶，200r/min培养30℃，培养24h，孢子数大于109个/ml；

c.发酵培养

接种量5％，30℃培养4天，30小时翻曲一次，发酵结束测酶活大于6500U/g，酶活定义1g固体酶粉在37℃，pH5.5的条件下，每分钟水解植酸十二钠1释放出1μmol无机磷的酶量，即一个酶活单位，以U/g表示；

(2)酶的提取

取一定量的固态发酵曲，用6倍体积缓冲液40℃振荡浸提30min，过滤收集第1次滤液，再用4倍体积缓冲液洗涤滤渣，过滤收集第2次滤液，将第1、2次滤液合并，测定酶活力；在滤液中缓慢搅拌加入硫酸铵至饱和度为达20％，用氨水调其pH至8.0，4℃过夜，次日3000r/min离心，取上清液，缓慢加入固体硫酸铵，使其饱和度达90％，4℃过夜，次日离心，取沉淀，干燥，可用配制固态复合酶；将上述沉淀溶于适量0.05mol/L，pH2的醋酸钠缓冲液中，3000r/min离心，取上清，测酶活，根据酶活决定进行浓缩或稀释，用于配制复合酶。

12.根据权利要求5所述的饲料工业专用的外源性复合酶制剂的制备方法，其特征在于，所述的五种水溶性非淀粉多糖酶与植酸酶按比例组合工艺包括：将以上工艺所获取的单酶依据水溶性非淀粉多糖与植酸在常见饲料原料中的含量和比例(如表1)计算酶的活性和比例范围，并组合，得外源性固态型复合酶制剂或液态

表1常见饲料原料中主要非淀粉多糖的种类及含量(％)

型复合酶制剂。

13.根据权利要求5所述的饲料工业专用的外源性复合酶制剂的制备方法，其特征在于，所述的木聚糖酶、β-甘露聚糖酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶，果胶酶等五种水溶性非淀粉多糖酶，以及植酸酶可以从市售产品中获取。

14.饲料工业专用的外源性复合酶制剂的应用，其特征在于，当用于颗粒饲料时，采用制粒过程的后喷方法，每吨饲料将150ml饲料工业专用的外源性复合酶制剂液体酶混合喷洒在制粒冷却后的动物饲料表面，以减少制粒过程中的高温高压高湿对酶活的破坏作用。