CN101554385B - 黄牛骨螯合物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及黄牛骨螯合物及其制备方法和用途，该螯合物可应用于医药、食品、保健品领域，所解决的技术问题是提供一种具有补钙作用的以黄牛骨为原料制备而得的黄牛骨螯合物，该螯合物是通过蒸煮、酶解、螯合制备而得。该螯合物的制备方法简单，操作简便，时间短，耗能低，无需特别设备，使用现有常规方法即可制备；通过上述制备方法制备而得的螯合物含钙量达27.8％、氨基酸总量为20.6％。产品外观形态品质良好，含水量和灰分含量均符合要求，具有良好的吸湿性、流动性及口感。且稳定性良好，保存时间可达2年以上。该黄牛骨螯合物可用于补充钙质和氨基酸等有益成分。
Description
技术领域
本发明涉及黄牛骨螯合物及其制备方法和用途，该螯合物可应用于医药、食品、保健品领域。
背景技术
经研究发现，矿物质经氨基酸螯合处理后，能以“氨基酸螯合物”的形式稳定溶解于pH值大于7.0的碱性小肠液中，并能参与小肠绒毛上皮细胞对氨基酸的主动转运过程而被完全吸收。这一发现，为促进人体对矿物质(尤其是钙和微量元素)的吸收和利用，带来了一项突破性的革命。
现有的氨基酸螯合钙多以无机钙与氨基酸为原料进行螯合，如中国专利申请号为200610096239.9，发明名称为氨基酸螯合钙的制备方法公开了无机钙与氨基酸通过离子交换树脂进行螯合的技术方案。
目前尚未发现以黄牛骨为原料制备螯合物的相关报道，更没有其相关制备工艺参数的报道。
发明内容
本发明所解决的技术问题是提供一种具有补钙作用的以黄牛骨为原料制备而得的黄牛骨螯合物。
解决上述技术问题是通过以下技术方案实现的：
A、蒸煮：取黄牛骨，加水，高温高压蒸煮，煎煮时间为2～10小时，得蒸煮液；其中，蒸煮压力为0.1～0.25MPa；
B、酶解：取蒸煮液维持其温度为75～80℃至少30分钟，然后降低其温度至50～55℃，按酶与底物重量比1∶10～45加入蛋白酶酶解；酶解后灭活，即得酶解液；酶解条件为：酶解温度50～55℃，控制pH值为7.5～8.0，酶解4～10小时，其中所述底物为牛骨；
C、螯合：酶解液与钙源螯合，干燥即得黄牛骨螯合物；
螯合条件为pH值为3.0～6.0，时间为3～10小时。
通过上述制备方法制备而得的螯合物含钙量可达27.8％、氨基酸总量可达20.6％。产品外观形态品质良好，含水量和灰分含量均符合要求，具有良好的吸湿性、流动性及口感。且稳定性良好，保存时间可达2年以上。该黄牛骨螯合物可用于补充钙质和氨基酸等有益成分。而且本发明螯合物在酸性(如胃液)及碱性环境中(如肠液)溶解性好，并保持稳定，不会引起便秘等不良反应；也无抗原性，不会引起过敏反应。
该螯合物的制备方法简单，操作简便，制备时间短，耗能低，无需特别设备，使用现有常规设备即可。
具体实施方式
本发明黄牛骨螯合物是采用以下方法制备而得，包括如下步骤：
A、蒸煮：取洗净处理好的新鲜黄牛骨，加水，高温高压蒸煮，煎煮时间为2～10小时，得蒸煮液；其中，蒸煮压力为0.1～0.25MPa；根据工艺筛选试验，从提取效果和成本考虑，优选煎煮时间为3小时，蒸煮压力为0.2MPa。
B、酶解：取蒸煮液维持其温度为75～80℃至少30分钟，然后降低其温度至50～55℃(可采取加水降温或关闭热源的方式)，按酶与底物重量比1∶10～45加入蛋白酶酶解；根据工艺筛选试验，从提取效果和成本考虑，优选酶与底物比1∶25～35，最优选择酶与底物比1∶35，其中所述底物为牛骨；酶解后灭活：即调整反应温度至80℃，即得酶解液。
酶解条件为：酶解温度50～55℃，控制pH值为7.5～8.0，酶解4～10小时；根据工艺筛选试验，从提取效果和成本考虑，酶解时间优选6小时。
酶解过程中所使用的蛋白酶既可以采用常规市售蛋白酶，也可以采用发明人特制的复合蛋白酶，使用该特制的复合蛋白酶所制成的产品，其口感和风味都较常规市售蛋白酶所制得的产品好，制备方法如下：
a、取新鲜或冷冻的健康黄牛胰脏，除去脂肪及结缔组织，采用浓度为25％～30％的稀醇提取激活，继以在浓度为60％～70％的浓醇中低温沉淀，经脱脂、低温干燥后即得胰酶；
b、将步骤a制备而得的胰酶与市售蛋白酶按重量配比1∶3混合，即得。
由于在制备复合蛋白酶的过程中，原料胰脏质量是提取胰酶的关键，采集的胰脏应在3小时内送入冷库，于-14℃以下冷藏；如立即投料，可不经冷冻阶段；冻胰在半融状态下应绞碎，绞好的胰浆贮存温度应低于4℃。
其具体制备过程为：将绞碎的胰浆在5～10℃条件下放置4～5小肘，按原料重缓缓加入1.2～1.5倍、预冷至0～10℃的25％乙醇，搅拌均匀，在0～10℃条件下提取12小时。然后用滤布吊滤，得胰乳；胰渣用25％～30％乙醇继续浸提，吊滤后所得浸提液供下批投料浸提用；胰乳在0～5℃条件下放置激活24小时。将已激活的胰乳，在搅拌下缓缓加入到预冷至5～10℃的乙醇中，使乙醇浓度达到60％～70％，充分搅拌均匀，在0～5℃条件下静置沉淀18～24小时。虹吸除去上层醇液，下层沉淀物即为胰酶。将沉淀物灌袋吊滤，直至滤去大部分乙醇，最后压榨干燥即得粗品。将压干后的粗酶沉淀物，经12～14目筛制成颗粒。胰酶通常含有胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶等，是一种混合酶，待用。
C、螯合：酶解液与钙源螯合，干燥即得黄牛骨螯合物；螯合条件为pH值为3.0～6.0，时间为3～10小时；根据工艺筛选试验，从提取效果和成本考虑，螯合条件优选pH值为4.0，时间为6小时。
所述钙源是指能够与氨基酸螯合的含钙制品。酶解液与钙源的用量配比，本领域技术人员可以根据酶解液的实际浓度和钙源的实际含钙量来确定。钙源可采用市售食用级或药用级的碳酸钙或葡萄糖酸钙。为了充分利用资源，钙源还可以选择蒸煮余下的牛骨，经干燥，超微粉碎后所得粉末，每升酶解液大概加入690～710g牛骨粉末即可，既可以完全利用牛骨原料，减少废物排放，实现牛副产物的综合利用，相较碳酸钙或葡萄糖酸钙为钙源制成的产品在口感、产品外观形态方面更佳，实现了产品的高品质性。
通过上述制备方法制备而得的黄牛骨螯合物氨基酸及钙含量均符合螯合物商品化要求。并通过筛选工艺确认的最佳工艺如下：
A、蒸煮：取洗净处理好的新鲜黄牛骨，加水，高温高压蒸煮，煎煮时间为3小时，得蒸煮液；其中，蒸煮压力为0.2MPa；
B、酶解：取蒸煮液维持其温度为80℃至少30分钟，然后降低其温度至50℃(可采取加水降温或关闭热源的方式)，按酶与底物比为1∶35加入蛋白酶酶解；酶解温度50℃，控制pH值为8.0，酶解6小时；酶解后灭活：即调整反应温度至80℃，即得酶解液；
C、螯合：酶解液与钙源螯合，干燥即得黄牛骨螯合物；螯合条件为pH值为4.0，时间为6小时。
最佳工艺中采用的蛋白酶和钙源分别为发明人自制复合蛋白酶和剩余牛骨所制备而得的牛骨粉。
以下为本发明制备方法的工艺筛选试验，通过下述筛选试验以说明本发明制备方法及制备而得的螯合物的有益效果。
(一)黄牛骨蒸煮压力、时间试验
1、实验目的
蒸煮是处理动物骨骼的常用方法。由于牛骨质地坚硬，常温常压难以将其中的蛋白质提取出来，所以本项目选用高温高压蒸煮黄牛骨，使牛骨中蛋白质快速、完全的溶出，为下一步利用复合多功能蛋白酶酶解黄牛骨蛋白奠定基础。但是长时间的高温高压会分解和破坏蛋白质中的的热不稳定性氨基酸，造成营养的不平衡和缺失。因此，蒸煮压力的高低及时间的长短直接关系到蛋白质的提取率及分解率。本项目设计压力为0.05～0.25MPa，时间为1～10小时进行蒸煮试验，以确定该蒸煮工艺的最佳蒸煮压力和时间。因此，本项目设计时间为1～10小时进行常温常压蒸煮试验，以确定该提取工艺的最佳蒸煮时间。
2、实验材料
(1)主要仪器
蒸煮机：型号SF15-05，浙江舟山市机械制造公司
板框式过滤器：型号jzj300，浙江海宁金正公司
阿贝折射仪：型号WZS-1，上海精密科学仪器有限公司物理光学仪器厂
氨基酸自动分析仪：型号L-8900，日本日立公司
自动凯氏定氮仪：型号Tecator1030，瑞典FOSS TECATOR公司
氮磷钙测定仪：型号NPCa-02，上海洪纪仪器设备有限公司
(2)主要试剂
混合氨基酸标准：0.1mg/ml，国药集团化学试剂有限公司，批号213205368
钙标准液：2.5mmol/L，成都市科龙化工试剂厂，批号20040608
磷标准液：1.29mmol/L，成都市科龙化工试剂厂，批号20031101
(3)原材料：鲜黄牛骨
3、实验方法
将洗净处理好的10kg黄牛骨放入蒸煮罐，加水至刻度，加压蒸煮，达到压力后分别于蒸煮的1～10小时取出少量骨汁，利用阿贝折射仪对骨汁进行白利糖度测定，评价黄牛骨中蛋白的溶出度，确定黄牛骨最佳的蒸煮压力、时间。并利用氨基酸自动分析仪、自动凯氏定氮仪和氮磷钙测定仪对该时间得到的黄牛骨汁进行蛋白质、氨基酸、钙、磷含量的测定。
4、实验结果
将黄牛骨放入蒸煮罐，压力为0.05～0.25MPa蒸煮1～10小时，进行蒸煮试验。试验重复3次，以三次平均为统计结果，结果见表1。
表1不同压力及时间对白利糖度的影响
随着压力的增加，相同蒸煮时间内，骨汁的白利糖度随压力的增加而增加，但是0.2MPa和0.25MPa压力下，白利糖度的变化不大。在同一压力下，随着时间的增加，骨汁的白利糖度不断增加。0.05MPa压力下，骨汁的白利糖度增加缓慢；0.1MPa压力下反应速度略快，白利糖度值在8～10小时达到高峰平衡；0.15MPa压力下反应速度在2～6小时上升较快，白利糖度值在7～10小时达到高峰平衡；0.2MPa和0.25MPa压力下反应速度相似，在1～2小时上升较快，白利糖度值在3～10小时达到高峰平衡。综合分析蒸煮压力、时间及经济因素，本项目高温高压蒸煮预处理黄牛骨的工艺为：将洗净处理好的10kg黄牛骨放入蒸煮罐，加水至刻度，压力设置为0.2MPa，时间设置为3小时。
在压力0.2MPa，时间3小时得到的骨汁，其蛋白质(以总N计)含量为12.68％，游离氨基酸(以N计)含量为0.47％，钙含量为0.023％，总磷(以磷计)含量为0.049％。
(二)蛋白酶用量的确定
1、实验目的
黄牛骨螯合物的质量与复合多功能蛋白酶的酶量有重大关系，酶量的多少将直接关系到产品质量的高低。本项目设计复合酶量与底物比例为1∶10、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50、1∶55、1∶60进行酶量试验，以确定复合酶的加入量效关系。
2、实验材料
(1)主要仪器
氨基酸自动分析仪：型号L-8900，日本日立公司
自动凯氏定氮仪：型号Tecator1030，瑞典FOSS TECATOR公司
pH计：型号LE438，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司
板框式过滤器：型号jzj300，浙江海宁金正公司
(2)主要试剂
混合氨基酸标准：0.1mg/ml，国药集团化学试剂有限公司，批号213205368
乙醇：500ml/瓶，AR，成都市科龙化工试剂厂，批号20040105
氢氧化钠：500g/瓶，AR，成都市科龙化工试剂厂，批号20030905
(3)原材料：鲜黄牛骨
3、实验方法
(1)蛋白酶：采用发明人自制复合蛋白酶，制备方法如前所述。
(2)骨蛋白的水解
取最佳蒸煮工艺得到的水液样品部分，置于反应锅加热并维持反应锅内溶液80℃的温度至少半小时，然后由夹层通入自来水降低锅内溶液温度至50℃，按不同酶/底物比(1∶10、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50、1∶55、1∶60)加入自制复合多功能蛋白酶，在搅拌器连续搅拌下开始酶解反应，期间调整通入反应锅夹层的蒸汽量使温度维持在50℃，并不断在反应液中加入NaOH稀溶液维持反应液的pH值于8.0。自加入复合多功能蛋白酶起至6h后酶解反应结束。此时，加大蒸汽的通入量使酶解液升温至80℃维持30min。试验重复3次，以三次平均为统计结果。
4、实验结果
在骨汁的水解试验中，随着复合多功能蛋白酶量的增加，酶解反应速度同时上升，当其复合多功能蛋白酶酶量与底物比例从1∶60、1∶55、1∶50、1∶45、1∶40、1∶35、1∶30、1∶25、1∶20、1∶10上升时，骨汁的水解度逐步增大，并在1∶35、1∶30、1∶25、1∶20、1∶10时达到相对平衡(表2)，同时其游离氨基酸量也在此比例时达到相对平衡高峰。从实验结果分析及综合经济因素分析考虑，复合多功能蛋白酶/底物之比在1∶35为最优化。
表2水解酶量对蛋白质、游离氨基酸和水解度的影响
骨汁在酶/底物比1∶35条件下反应6小时，其蛋白质(以N计)为12.67％，游离氨基酸(以N计)为1.89％。
(三)酶解时间的确定
1、实验目的
酶解时间是继水解酶量后另一个直接影响黄牛骨螯合物质量的关键因素。本项目设计酶解时间为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10小时试验，以确定水解时间关系。
2、实验材料
(1)主要仪器
氨基酸自动分析仪：型号L-8900，日本日立公司
自动凯氏定氮仪：型号Tecator1030，瑞典FOSS TECATOR公司
pH计：型号LE438，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司
板框式过滤器：型号jzj300，浙江海宁金正公司
(2)主要试剂
混合氨基酸标准：0.1mg/ml，国药集团化学试剂有限公司，批号213205368
乙醇：500ml/瓶，AR，成都市科龙化工试剂厂，批号20040105
氢氧化钠：500g/瓶，AR，成都市科龙化工试剂厂，批号20030905
(3)原材料：鲜黄牛骨
3、实验方法
(1)蛋白酶：采用发明人自制复合蛋白酶，制备方法如前所述。
(2)骨蛋白水解时间的确定
取最佳蒸煮工艺得到的水液样品部分，复合多功能蛋白酶按1/35添加，水解时间设置为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10小时来观察时间对水解液游离氨基酸含量和水解度的影响。试验重复3次，以三次平均为统计结果。
4、实验结果
在骨汁的水解时间试验中，随着时间的增加其游离氨基酸量不断增加，并在6小时达到相对平衡高峰值，其后变化放缓(表3)。这表明由于复合多功能蛋白酶的水解作用6小时便达到相对平衡高峰状态。综合实验结果分析表明，最优化酶解反应时间为6小时。
表3水解时间对游离氨基酸的影响
骨汁在酶/底物比1∶35条件下反应6小时，其蛋白质(以N计)为12.66％，游离氨基酸(以N计)为1.88％。
(四)螯合时间试验
1、实验目的
本发明制备方法利用螯合技术，将骨中的钙离子与骨汁中酶解得到的氨基酸螯合起来，形成溶解度高、易于人体吸收的骨螯合物。而在螯合过程中，pH值、螯合时间是螯合的重要参数。本试验设计pH值为3～6，时间1～10小时进行试验，以确定最佳的螯合参数。
2、实验材料
(1)主要仪器
分析天平：型号AL104，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司
真空干燥器：型号DEF-6053，上海一恒科学仪器有限公司
pH计：型号SevenGo，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司
氮磷钙测定仪：型号NPCa-02，上海洪纪仪器设备有限公司
(2)主要试剂
钙标准液：2.5mmol/L，成都市科龙化工试剂厂，批号20040608
食用级盐酸：31％，中山市顺泰化工材料有限公司，批号20050818(2)原材料：黄牛骨酶解液、自制钙源(牛骨粉)
3、实验方法
(1)pH对螯合反应的影响
在室温(25℃)下调节黄牛骨酶解液pH值为3、4、5、6。每升酶解液加入700g自制钙源，不停搅拌，反应10小时。反应结束后取上清液，喷雾干燥，测定钙含量，确定最佳的反应pH值。
(2)时间对螯合反应的影响
在室温(25℃)下调节黄牛骨酶解液pH值至最佳pH值。每升酶解液加入700g自制钙源，不停搅拌，反应1～10小时，每小时取样(上清液)，喷雾干燥，测定钙含量，确定最佳的反应时间。
4、实验结果
(1)pH对螯合反应的影响
按每升酶解液加入700g自制钙源，在不同pH条件下搅拌反应10小时，通过测定反应液上清液的钙含量。从结果可以看出(表4)，pH值为3和4时获得的螯合物中钙含量相近，且高于pH值为5和6时的钙含量。综合考虑，确定pH值为4时为螯合反应的pH值。
表4 pH值对骨螯合物钙含量的影响
| pH值 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 钙含量(％) | 28.9 | 28.3 | 17.3 | 8.6 |
酶解液在pH值为4时反应10小时，其钙含量为28.3％。
(2)时间对螯合反应的影响
当pH值为4时，每升酶解液加入700g自制钙源，不停搅拌，反应1～10小时，每小时取样(上清液)，喷雾干燥，测定钙含量。从结果可以看出(表5)，随着反应时间的延长，骨螯合物的钙含量不断增加；反应6小时后，钙含量增加趋于平缓。从经济等因素考虑，确定最佳的反应时间为6小时。
表5反应时间对骨螯合物钙含量的影响
| 时间(h) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| 钙含量(％) | 3.2 | 9.7 | 15.9 | 20.3 | 24.8 | 27.8 | 27.9 | 28.0 | 28.2 | 28.3 |
酶解液在pH值为4时反应6小时，其钙含量为27.8％。
(五)高温喷雾干燥效果试验
1、实验目的
喷雾干燥是一种在极短的时间内以简单的工艺迅速连续干燥成细颗粒状物料的过程。在这一过程中高温热空气的温度控制尤为重要，对黄牛骨螯合物的收率影响较大，并且对其外观色泽、流动性关系密切。本试验考察了在黄牛骨螯合物制备中喷雾干燥的最适温度。
2、实验材料
(1)主要仪器
压力喷雾干燥机：型号YPG-150，靖江市扬扬机械厂
恒温干燥机：型号101-2，上海实验仪器有限公司
分析天平：型号AL104，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司
真空干燥器：型号DEF-6053，上海一恒科学仪器有限公司
真空浓缩器：型号RV-05-ST，北京康林科技有限责任公司
(2)原材料：黄牛骨螯合液
3、实验方法
(1)黄牛骨螯合液的喷雾干燥
取黄牛骨螯合液10L，体积浓缩至5L，管道送入喷雾干燥器，设置不同的高温热空气进风温度进行喷雾干燥，得到骨螯合粉。
(2)含水率和灰分的测定
4、实验结果
从实验结果来看(表6)，随着喷雾干燥的高温热空气的温度的变化上升，骨螯合粉的含水率不断下降，在300℃时达到4.21％，产品的形态呈现良好。同时实验结果显示，在120℃～200℃的干燥空气温度时，其水分含量变化不大，在200℃～300℃的干燥空气温度时，其水分含量下降很快，干燥效果明显，产品外观形态品质良好。由此可见，设置300℃的干燥空气温度时，无论产品的水分含量还是产品外观形态品质，都是最优化的喷雾干燥温度条件，在该条件下得到的黄牛骨螯合粉，其含水量为4.21％，灰分为4.76％。
表6温度对高温喷雾干燥含水量和灰分含量的影响
骨螯合液在300℃喷雾干燥条件下得到的黄牛骨螯合物，其含水量为4.21％，灰分为4.76％。
(六)稳定性考察试验
1、实验目的
螯合物是否稳定，其保质期的确定，依赖于稳定性的考察实验。通过稳定性的考察实验为将来放大生产产品的质量稳定性和保质期有着重要的意义。本项目通过研究在25℃、湿度50％，产品在0、3、6、9、12、16、18、24个月后的稳定性，以确定其保质期。
2、实验材料
(1)主要仪器
氨基酸自动分析仪：型号L-8900，日本日立公司
自动凯氏定氮仪：型号Tecator1030，瑞典FOSS TECATOR公司
氮磷钙测定仪：型号NPCa-02，上海洪纪仪器设备有限公司
分析天平：型号AL104，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司
真空干燥器：型号DEF-6053，上海一恒科学仪器有限公司
(2)主要试剂
混合氨基酸标准：0.1mg/ml，国药集团化学试剂有限公司，批号213205368
钙标准液：2.5mmol/L，成都市科龙化工试剂厂，批号20040608
磷标准液：1.29mmol/L，成都市科龙化工试剂厂，批号20031101
(3)原材料：黄牛骨螯合物(按照最后确定的最佳工艺制备)
3、实验方法
将黄牛骨螯合物放置在温度为室温(25℃)、湿度为50％的密闭容器内，考察成品稳定性，时间分别为0、3、6、9、12、16、18、24个月，检测蛋白质、水分、钙、氨基酸等，试验重复3次，以三次平均为统计结果。
氨基酸的测定按GB/T 5009.124-2003执行。具体步骤同“牦牛骨髓蛋白多肽骨素稳定性考察试验”。
4、实验结果
通过0～24月的稳定性考察试验结果来看，蛋白质总量、氨基酸总量、游离氨基酸量和分类氨基酸含量在0月、6月、12月、15月、18月、24月没有显著性差异。由实验结果(表7)分析可见，在产品的24月存储过程中，产品的性质是安全和稳定的。
表7稳定性考察实验
(七)本发明黄牛骨螯合物灭菌效果试验
1、实验目的
黄牛骨螯合物是一种多肽蛋白制剂，性质上易于染菌，如何更好的灭菌是关系到产品最终安全的重要因素。本项目通过设计不同的灭菌时间以确定最佳的辐照灭菌效果。
2、实验材料
(1)主要仪器
培养箱：型号PYX-DHS-50X65-S，上海跃进医疗器械厂
(2)主要试剂
乳糖胆盐：250g/瓶，AR，沪试，批号69040361
伊红美蓝琼脂平板：按GB 4789.28中4.25规定。
乳糖发酵管：按GB 4789.28中4.10规定。
EC肉汤：按GB 4789.28中4.11规定。
革兰氏染色液：130ml/瓶，中药集团化学试剂有限公司，批号69060960
(3)原材料：黄牛骨螯合物
3、实验方法
应用方便的辐照灭菌。辐照灭菌时间非常重要，不同辐照时间的作用效果分别检测大肠杆菌、霉菌和酵母。试验重复3次，以三次平均为统计结果。具体操作同“牦牛骨髓蛋白多肽骨素灭菌效果试验”。
4、实验结果
从表8可以看出，辐照2小时后，黄牛骨螯合物的灭菌效果均符合卫生学标准。但还应对长期灭菌效果进行考察。
表8紫外灭菌时间对灭菌效果的影响
取2小时、4小时、5小时、6小时样品再进行1～24月的长期卫生学考察，结果见下表9～12。
表9 2小时灭菌样品的长期灭菌效果
表10 4小时灭菌样品的长期灭菌效果
表11 5小时灭菌样品的长期灭菌效果
表12 6小时灭菌样品的长期灭菌效果
从分别取2～6小时灭菌样再进行24个月长期考察来看，2小时灭菌样在第1月就出现菌落检测不合格；4小时灭菌样在第10月出现霉菌检测不合格；5小时灭菌样在第15月出现大肠杆菌不合格；6小时样在24个月时皆检测符合规定。由此实验可知，进行辐照灭菌最优化时间是6小时。
综上，本发明螯合物含钙量达27.8％、氨基酸总量为20.6％。产品外观形态品质良好，含水量和灰分含量均符合要求，具有良好的吸湿性、流动性及口感。且稳定性良好，保存时间可达2年以上。该黄牛骨螯合物可用于补充钙质和氨基酸等有益成分。而且本发明螯合物在酸性(如胃液)及碱性环境中(如肠液)溶解性好，并保持稳定，不会引起便秘等不良反应；也无抗原性，不会引起过敏反应。
Claims (8)
1.黄牛骨螯合物的制备方法，其特征在于：它是由如下步骤：
A、蒸煮：取黄牛骨，加水，高温高压蒸煮，煎煮时间为2～10小时，得蒸煮液；其中，蒸煮压力为0.1～0.25MPa；
B、酶解：取蒸煮液维持其温度为75～80℃至少30分钟，然后降低其温度至50～55℃，按酶与底物重量比1∶10～45加入蛋白酶酶解；酶解后灭活，即得酶解液；
酶解条件为：酶解温度50～55℃，控制pH值为7.5～8.0，酶解4～10小时；
C、螯合：酶解液与钙源螯合，干燥即得黄牛骨螯合物；螯合条件为pH值为3.0～6.0，时间为3～10小时；
其中，步骤B所述的蛋白酶由如下方法制备：
a、取新鲜或冷冻的健康黄牛胰脏，除去脂肪及结缔组织，采用浓度为25％～30％的稀醇提取激活，继以在浓度为60％～70％的浓醇中低温沉淀，经脱脂、低温干燥后即得胰酶；
b、将步骤a制备而得的胰酶与市售蛋白酶按重量配比1∶3混合，即得；
步骤C所述钙源为步骤A蒸煮余下的牛骨，经干燥，超微粉碎后所得粉末。
2.根据权利要求1所述的黄牛骨螯合物的制备方法，其特征在于：步骤A所述的煎煮时间为3小时，蒸煮压力为0.2MPa。
3.根据权利要求1所述的黄牛骨螯合物的制备方法，其特征在于：步骤B所述的酶解调节条件为控制pH值为8.0，酶解6小时。
4.根据权利要求1所述的黄牛骨螯合物的制备方法，其特征在于：步骤C所述的螯合条件为pH值为4.0，时间为6小时。
5.根据权利要求1所述的黄牛骨螯合物的制备方法，其特征在于：步骤C所述的干燥方法为喷雾干燥。
6.权利要求1～5任一项所述的制备方法制备而得的黄牛骨螯合物。
7.根据权利要求6所述的黄牛骨螯合物，其特征在于：它含有钙27.8％、氨基酸总量20.6％。
8.权利要求6所述的黄牛骨螯合物在制备用于补钙或/和补充氨基酸的药品、食品或保健品中的用途。
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