CN102154383B - 玉米粉生产赤藓糖醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属微生物发酵领域，涉及一种以玉米粉为起始原料，利用解脂假丝酵母发酵生产赤藓糖醇的方法，包括：（1）玉米粉经与分离回收的酵母菌体混合挤压处理；（2）利用酶水解反应对物料进行液化、糖化，接种发酵种子进行赤藓糖醇发酵，制得含有赤藓糖醇的发酵液；（3）发酵液经过金属微滤膜进行除菌、料液分离，上清液经过升膜蒸发器进行水分蒸发浓缩和结晶。本发明直接以玉米粉为原料；配料、酶水解和发酵培养在同一发酵罐中进行，省略了现有技术中的淀粉和葡萄糖的生产过程和装置，避免了生产过程中所产生的重复性废水处理和能源消耗，流程更经济、合理，能有效提高资源利用率。本发明所筛选的高产赤藓糖醇的解脂假丝酵母菌种，使赤藓糖醇产率提高2%左右。
Description
技术领域
本发明属微生物发酵领域，具体涉及一种以玉米粉为起始原料发酵生产赤藓糖醇的新方法。
背景技术
赤藓糖醇在自然界中分布极广，如水果、蘑菇、地衣等。另外，在发酵食品及哺乳动物体内也存在，是一种天然糖质。工业上，赤藓糖醇是由葡萄糖经发酵而得到的一种白色晶体，具有甜味，甜度为蔗糖的70%-80%，而其热量仅为0.2kcal/g。赤藓糖醇是一种四碳糖醇，其熔点为118－122°C，裂解温度为329°C，分子式为CH4O4H10，化学结构为：
赤藓糖醇具有独特的营养学特性，具有比较高的消化性，容易被小肠迅速吸收；赤藓糖醇不影响血糖和胰岛素水平，因而适宜于糖尿病人食用；由于口腔中细菌无法利用赤藓糖醇，因而不会产生蛀牙。
与大多数非糖类甜味剂相比，赤藓糖醇表现出很好的加工特性。赤藓糖醇具有爽口和类似蔗糖的甜味；可以赋予产品圆润感和质感；掩蔽不良味道，并具有清凉感；可以与其它甜味剂发生甜味的协同作用；对热和酸等加工条件表现出非常好的稳定性。
由于赤藓糖醇具有上述良好的特性，因而广泛地应用于糖果、饮料、焙烤制品，以及保健食品和药品等工业中,需求量日益增大。
尽管赤藓糖醇存在于天然植物中，但其含量较低，提取和分离成本高，不适合工业化生产。以2-丁烯-1,4-丁二醇为原料，可以通过化学合成方法来生产赤藓糖醇。目前化学合成方法存在转化率低，成本高，以及安全性等方面的问题，因此赤藓糖醇的生产主要是以葡萄糖为起始原料，经酵母发酵方法来实现的。
目前工业上赤藓糖醇的生产主要是利用葡萄糖发酵。
日本从自然界分离了一株产赤藓糖醇的丛梗孢酵母，经对其进行化学和物理诱变，得到发酵性能优良的菌株。在40-200M2发酵罐中，30%的葡萄糖培养液中发酵，在pH5-pH6，温度34°C-38°C，通气搅拌，发酵8-10天，发酵液赤藓糖醇含量为14%左右。发酵液经过滤除掉菌体，滤清液经脱色、脱盐等精制工艺，得到纯度98%以上的白色晶体产品。但是利用丛梗孢酵母，以葡萄糖为碳源的发酵技术所生产的赤藓糖醇成本较高，并且其中仍含有少量核糖醇、甘油和色素等，对提高产品纯度不利。由于发酵时间比较长，pH值比较高，所以发酵过程中污染杂菌的概率增加。
中国专利ZL200510102929.6提供了一种利用解脂假丝酵母为发酵菌株，以葡萄糖为起始原料生产赤藓糖醇的方法。该方法是以精制葡萄糖为碳源，并加入有机氮源，如酵母浸膏或蛋白胨或玉米浆，以及其它营养盐等，在有氧条件下进行发酵。
尽管利用葡萄糖发酵生产赤藓糖醇的工艺较为成熟，但是从整个赤藓糖醇生产的产业链来看，利用葡萄糖发酵在经济性、资源有效利用性，以及环境保护和废水处理等方面都存在着一定的缺陷。
葡萄糖的生产通常是以淀粉为原料，经水解（包括酸水解或酶水解）过程制备的。
而淀粉通常又是以玉米原料为用量加工制备的。
玉米淀粉生产的工艺流程主要是由以下步骤组成：
玉米清理、浸泡、破碎、胚芽分离，研磨和筛分，蛋白分离，淀粉洗涤，淀粉脱水，干燥。其中，玉米纤维、蛋白质、胚芽（玉米油）和玉米浸泡液（玉米浆）是玉米淀粉生产中所产生的主要副产品，玉米浆和淀粉洗涤等工序是主要的工业废水来源。
葡萄糖生产的工艺流程由以下步骤组成：
淀粉液化、糖化、过滤、脱色、离子交换、浓缩、结晶、干燥。
按现有技术，如以玉米为起始原料，生产赤藓糖醇，需要上述三个生产工艺过程。
从能源消耗角度来说，每一个生产过程均需要进行干燥、浓缩等重复性的耗能操作，能源消耗大。从环境保护和废水处理角度来说，每一个生产过程均产生大量的工业废水，均需进行废水处理方能排放，致使产品成本升高，环境保护压力增大。从资源的有效利用方面看，每个加工过程均会产生副产物和一定的损耗，总体资源利用效率不高。
另外，现有赤藓糖醇生产的除菌过程，采用板框过滤和添加活性炭脱色，废菌体不能回收利用，废菌体排放到污水处理厂进行生物处理，污染物排放量大。
因此，研究和开发一种能够更经济、更合理、更环保，能有效提高资源利用率的生产技术，在实现可持续发展和提高产品竞争力等方面具有重要的实际意义。
发明内容
本发明的目的在于实现直接由玉米粉为起始原料生产赤藓糖醇方法。
本发明的技术方案主要包括：将玉米粉与分离回收的酵母菌体混合配料；对物料进行液化、糖化、蛋白质水解，接种解脂假丝酵母发酵种子进行发酵，制得含有赤藓糖醇的发酵液；发酵液经分离、浓缩、结晶，制得赤蘚糖醇成品。
上述混合配料方式是将回收的酵母菌体添加的玉米粉中，经双螺杆挤压机进行混合挤压处理，制得混合物料。
上述配料、液化、糖化、蛋白质水解以及发酵均在同一发酵罐中进行。
所制得的发酵液是经过金属微滤膜进行除菌、料液分离，上清液经过升膜蒸发器进行水分蒸发、浓缩和结晶。
本发明直接以玉米粉为原料；配料、酶水解和发酵培养可在同一发酵罐中进行，省略了现有技术中的淀粉和葡萄糖的生产过程和装置，避免了生产过程中所产生的重复性废水处理和能源消耗，流程更经济、合理，能有效提高资源利用率。
本发明所述生产赤藓糖醇方法包括以下工艺过程：
1.原料及处理
（1）起始原料为粒度0.125-0.850 mm，含水量为12%-18%的玉米粉，一般选用脱胚芽和脱壳玉米粉，也可以选用全玉米粉。
玉米粉中含有大约80－85% 淀粉，8－10% 蛋白质，1.5－3.7% 糖，以及纤维素等。利用玉米粉为原料，可充分利用所含的淀粉，（包括还原糖）作为碳源，利用玉米粉中所含的蛋白质作为赤藓糖醇发酵的部分氮源。
（2）玉米粉的预处理
本发明将赤藓糖醇发酵分离回收的菌体与玉米粉混合作为发酵原料，回收利用酵母菌体，提高蛋白质含量；
所述混合预处理有四种方式可以选用：
a.玉米粉与分离回收的酵母菌体混合挤压处理；
b.玉米粉与分离回收的酵母菌体单独挤压处理；
c.玉米粉与分离回收的酵母菌体混合不经过挤压处理；
d.玉米粉与分离回收的酵母菌体单独不经过挤压处理。
为筛选优异的预处理方式，本发明人对玉米粉经极压后的性能进行了分析测试研究，获得如下可参考数据：
表1 原料玉米粉的主要组成
| 指标 | 未经挤压处理的物料 | 经挤压处理的物料 |
| 水分 % | ≤15 | 20－30 |
| 粗蛋白 % | 8－10 | 7-9 |
| 粗纤维 % | 3－5 | 3－5 |
| 淀粉 % | 80－85 | 80－85 |
| 总糖 % | 88－94 | 88－94 |
| 还原糖 % | 1.5-3.7 | 4.0－4.5 |
表2 挤压处理前、后玉米粉化学组成及堆积密度
| 指标 | 未经挤压处理的物料 | 经挤压处理的物料 |
| 水分 % | ≤15 | 20－30 |
| 粗蛋白 % | 8－10 | 7-9 |
| 粗纤维 % | 3－5 | 3－5 |
| 淀粉 % | 80－85 | 80－85 |
| 总糖 % | 88－94 | 88－94 |
| 堆积密度 g/dm | 86.1-90 | 75.6-83.5 |
表3 挤压处理前、后物料蛋白质
| 指标 | 挤压前物料 | 挤压后物料 |
| 粗蛋白 | 8－10% | 7-9% |
| 游离氨基酸 | 0.8-0.9 % | 1.6-1.7% |
表4 挤压处理前、后物料脂肪
| 指标 | 挤压前物料 | 挤压后物料 |
| 脂肪 | 0.9－1.5% | 0.4-0.8% |
依据上述试验评价，本发明人确定，优选玉米粉与分离回收酵母菌体的混合物料，经双螺杆挤压机进行混合挤压处理的方式为最佳预处理方式。
挤压处理是通过热能和机械能的作用改变了物料中的淀粉和蛋白质结构，使得淀粉颗粒的结晶结构发生破裂，形成一定程度的“胶凝化”，堆积密度降低，比表面积增大，有利于后续的淀粉液化和糖化处理。挤压处理也使得混合物料中的蛋白质结构发生变化，引起蛋白质分解和变性，这有利于后续蛋白质酶水解过程，提高蛋白质的生物利用率。此外，在挤压处理过程中的热能作用下，经挤压处理后物料的脂肪含量显著下降，这有利于减少发酵过程中的脂肪影响。
在玉米粉中添加膜分离回收的酵母菌体，利用挤压技术对上述混合物进行预处理，通过改变玉米粉的淀粉和蛋白质结构，提高物料的生物利用率，提高后续酶水解的效率；对经预处理的玉米粉进行酶水解，即液化、糖化，以及蛋白质酶水解,形成可发酵性的碳源，蛋白质水解物为酵母菌的生长提供良好的氮源，酵母菌体回收利用，无需使用价格昂贵的酵母浸膏。
2.发酵种子培养
将上述经挤压处理的物料，经酶水解反应，即液化、糖化及蛋白质酶解，糖化液DE值为90％以上，成为可发酵碳源和氮源的培养基，接入解脂假丝酵母酵母菌种进行种子培养。
3.赤蘚糖醇发酵
可采用先糖化后发酵或糖化与发酵同时进行两种方式
a. 先糖化后发酵
将上述经挤压处理的物料配料，经酶水解反应，即液化、糖化及蛋白质酶解，成为可发酵性碳源和氮源的发酵培养基，培养液DE值大于90%，接入步骤2的解脂假丝酵母发酵种子进行赤藓糖醇发酵。
b.边糖化边发酵
将上述经挤压处理的物料配料，经酶水解反应，即液化、蛋白质酶解，成为可发酵性碳源和氮源的发酵培养基，培养液DE值20－40%，在接入步骤2的解脂假丝酵母发酵种子进行赤藓糖醇发酵的同时，加入糖化酶，例如高效液体糖化酶或复合糖化酶，持续对底物进行水解，赤藓糖醇发酵和糖化反应同步进行，提高生产效率。
4.发酵液料液分离、浓缩、结晶
a.分离：利用金属微滤膜进行除菌料液分离。
b.发酵液浓缩：经料液分离得到的上清液经过升膜蒸发器进行物料水分蒸发。
c.结晶：浓缩液进行冷却，并加入晶种，制得赤藓糖醇结晶。
本发明实现了由玉米粉为起始原料，添加利用膜分离回收的酵母菌体为发酵培养基物料，进行酶水解 (液化、糖化以及蛋白质水解)，发酵生产赤藓糖醇的工业化生产过程；在赤藓糖醇发酵过程中，调控赤藓糖醇发酵耗糖速率和底物连续糖化速率，提高生产效率，同时也提供了赤藓糖醇收率；本发明还在于实现了将现有分别独立的淀粉制备、葡萄糖制备和赤藓糖醇制备的三套生产过程合并为单一生产过程，液化、糖化、蛋白质水解和赤藓糖醇发酵均在同一发酵反应罐中完成，充分利用和节省了设备，缩短生产工艺流程，显著减少设备占地面积和投资，降低能耗，提高了原料的利用率，降低生产成本，并显著减少废水处理量，有利环保。
以年产赤藓糖醇2000吨的工业化生产线为例，原生产技术需要多配套10000吨湿法淀粉生产线， 8000吨葡萄糖生产线，设施投资多耗用1000万元左右，每吨赤藓糖醇需要多耗用淀粉生产用蒸汽3吨，耗电500度，葡萄糖生产耗用蒸汽3吨，耗电300度，以及其它酸碱、树脂、活性炭等的耗用，能源消耗大。生产量越大，设备投资及相关基础投资更大。
由玉米粉为起始原料生产赤藓糖醇，添加利用膜分离回收的酵母菌体，利用挤压技术对上述混合物进行预处理，通过改变玉米粉的淀粉和蛋白质结构，提高物料的生物利用率，提高后续酶水解的效率；对经预处理的玉米粉进行酶水解，即液化、糖化，以及蛋白质酶水解，形成可发酵性的碳源。上述酶水解(液化、糖化以及蛋白质水解)和赤藓糖醇发酵在同一反应罐中进行，经料液分离得到含有赤藓糖醇的发酵液，并经浓缩、结晶和干燥得到高纯度赤藓糖醇。
本发明方法中，回收利用酵母菌体，蛋白质水解物为酵母菌的生长提供良好的氮源，无需使用价格昂贵的酵母浸膏；赤藓糖醇发酵过程中，调控赤藓糖醇发酵耗糖速率和底物连续糖化速率，提高生产效率；工艺还实现了将独立的淀粉制备、葡萄糖制备和赤藓糖醇制备的生产操作合并为单一生产操作，充分利用和提高了原料的利用率，实现缩短生产工艺流程，显著减少设备占地面积和投资，降低能耗，降低生产成本，以及显著减少废水处理量，有利环保。
鉴于现有发酵法生产赤蘚糖酶的菌株，均是针对以葡萄糖为培养基的工艺所筛选的菌株，例如ZL200510102929.6专利所提供的解脂假丝酵母CGMCC No.1431，是当前公认的以葡萄糖为底物发酵生产赤蘚糖酶的优异菌株，将其用于本发明以玉米粉为原料的发酵生产赤蘚糖酶的工艺过程中，也能获得较好的效果。但是，由于物料不同，发酵方式、条件不同，其发酵功能受到一定制约，对发酵收率和效果等产生一些不良影响。
为了选择一种最适合于本发明所述以玉米粉为起始原料的发酵工业路线的酵母菌种，本发明人重新进行了评价和筛选，公开了一种最适宜于本发明工艺过程的菌种——解脂假丝酵母（Candida lipolytica）BLB-24。
本发明所提供的解脂假丝酵母（Candida lipolytica）BLB-24，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址为北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，保藏时间为2010年11月25日，保藏号为CGMCC No.4364。
本专利所用菌种解脂假丝酵母BLB-24的筛选步骤如下：
1.菌种分离和筛选
从保龄宝工业园赤藓糖醇发酵车间附近土壤中分离得解脂假丝酵母菌株BLB-02，操作方法如下：
称取10g土壤，加入90mL无菌水中，震荡摇匀，酒精擦拭后移入超净工作台。准备6支装有9mL无菌水的试管，编号1—6。用移液枪移取1000μL悬浊液置于1 号试管，再移取1000μL 1号试管悬浊液置于2号试管，依次做六个试管梯度稀释。用移液枪分别取4、5、6号试管溶液各200μL（每个试管取2—4份）置于合适的培养基平板，用涂抹棒均匀涂抹，培养至平板长出成熟菌落，鉴定并分离纯化解脂假丝酵母菌落，将单菌落接种斜面，并接种摇瓶，初筛测定赤藓糖醇的转化率。根据摇瓶产赤藓糖醇的转化率水平筛选出斜面出发菌株—解脂假丝酵母BLB-02。
上述分离筛选培养基配方如下：
分离斜面培养基：
葡萄糖30－50％，酵母膏1.5％，琼脂粉1.5％。
摇瓶种子培养基：
葡萄糖15－20％，酵母膏1.0-1.5％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.05％，柠檬酸氨0.3-0.5％。
对上述所得解脂假丝酵母BLB-02，采用紫外线、微波复合诱变处理，通过赤藓糖醇产率测定，筛选得到用于本发明以玉米粉为起始原料的赤藓糖醇发酵生产过程的优良高产菌株。
具体操作步骤如下：
菌种诱变：
1）紫外线诱变：接种环挑取解脂假丝酵母BLB-02斜面菌落于装有无菌水的三角瓶中，置于磁力搅拌器上振荡1 h。将菌悬液倒入含无菌大头针的无菌平皿。打开平皿盖，在事先预热好的20 W的紫外灯下24 cm处照射0s、20s、40s、60s、80s、100s、120 s，不同照射剂量菌液稀释到10-1，黑暗处放置1 h。再用生理盐水分别稀释菌液到10-3，吸取稀释好的菌液0.1 mL涂布30－50％葡萄糖琼脂培养基平板，每个稀释度涂布3个平板。将涂好的平皿用黑布包好，置生化培养箱28－30℃培养3－4d左右，至长出成熟菌落，统计致死率。
2）微波诱变：选取紫外诱变后致死率90%以上菌株进行筛选，得优良菌株UV-121继续微波处理。
采用频率为2450 MHz，功率1200 W的微波炉，低火，分别以0、20、40、60、80、100s辐射处理菌株UV-121，操作步骤如紫外诱变，然后菌液稀释涂布30－50％葡萄糖琼脂培养基平板，培养3－4d，挑取成熟菌落斜面培养。
筛选：挑取斜面菌落进行赤藓糖醇发酵摇瓶实验，测定发酵液中赤藓糖醇含量。
赤藓糖醇含量测定：液相色谱法
1）试剂和材料
a) 重蒸蒸馏水。
b) 赤藓糖醇标准品：纯度不低于99％。
2）仪器和设备
高效液相色谱仪，配备示差折光检测器。
3）色谱条件
a)流动相：重蒸蒸馏水。
b)色谱柱：氢型大孔径阳离子交换树脂填充柱，树脂包含大网格磺化聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物，交联度为8％，颗粒大小为9 μm，或其他等效色谱柱。
c) 流速：0.6 mL/min。
d) 柱温：60℃。
e) 进样量：10 μL。
4) 分析步骤
a) 标准溶液制备
准确称取0.25g在105℃下干燥4h后的赤藓糖醇标准品，精确至0.0001g，转移至一个50mL容量瓶中，用流动相溶解，稀释定容至刻度，混匀后备用。色谱分析前，用0.45 μm微孔滤膜过滤。
b)试样液制备
准确称取2.0 g在105℃下干燥4h后的赤藓糖醇试样，精确至0.0001g，转移至一个50mL容量瓶中，用流动相溶解，稀释定容至刻度，混匀后备用。色谱分析前，用0.45 μm微孔滤膜过滤。
c)测定
分别对标准溶液和试样液进行色谱分析，记录60 min的色谱图。赤藓糖醇的出峰时间根据标准品的出峰时间定性。重复实验两次，得到平均峰面积值。
d）结果计算
赤藓糖醇含量以赤藓糖醇（C4H10O4）的质量分数w 1计，数值以%表示，按公式计算：
式中：
M 1 ──称取的赤藓糖醇标准品质量的数值，单位为克（g）；
m 1 ──称取的试样质量的数值，单位为克（g）；
a 1 ──试样液色谱图中赤藓糖醇平均峰面积值的数值；
A 1 ──标准溶液色谱图中赤藓糖醇平均峰面积值的数值。
从中筛选出高产率解脂假丝酵母菌株BLB-24——即解脂假丝酵母（Candida lipolytica）CGMCC No.1431。
2、菌种培养
将解脂假丝酵母菌种BLB-24，经斜面培养后，接入一级或二级种子培养基中培养，得到扩大培养的生产用菌种；然后转入生产过程中使用。
斜面培养基：葡萄糖30－50％，酵母膏1.5％，琼脂粉1.5％；pH自然，培养基在110℃湿热灭菌15－20min。培养温度28－30℃。
种子培养基：葡萄糖15－20％，酵母膏1.0－1.5％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.05％，柠檬酸氨0.4％；pH7.2－7.5；消毒115－121℃，15－20min；培养温度28－30℃。
应用解脂假丝酵母菌株BLB-24，实施本发明所述以玉米粉为起始原料发酵生产赤藓糖醇的工艺过程和工艺参数如下：
1、工业生产用种子培养
1.1起始原料预处理
1.1a 原料混合：粒度为0.125-0.850 mm，水分含量为12-18%的玉米粉与赤藓糖醇发酵回收的60－65％含量的菌体，以80:1–150:1比例(w/w)在卧式混合机中进行混合，混合时间为10-30min。
1.1b 混合原料挤压：将1.1a步骤中的混合原料利用双螺杆挤压机进行挤压处理。挤压温度为120-150°C，进料速率为1–8 kg/min。
1.2种子培养
1.2a 配料：步骤1所得的混合挤压原料与处理水按1:3－5比例投入种子罐中配料。温度控制在50-55°C，搅拌速率为100 rpm，调节料液pH 5.8-6.2。
1.2b 液化：加入耐高温淀粉酶，添加量0.5-1L／t玉米粉(干基)，通入蒸汽升温至100℃液化，保温20min。然后降温至50－55℃。
1.2c 糖化：调节pH4.5，加入高效液体糖化酶或复合糖化酶,添加量0.2-1L／t玉米粉(干基)，50－55℃搅拌保温15－36h，糖化液DE值90％以上。将糖化后的料液升温至110－121℃灭菌10－30min，然后降温。
1.2d 蛋白质酶解：糖化同时加入蛋白水解酶，添加量100-200g/t玉米粉干基。
1.2e按上述物料的10%接入扩大培养的菌种，温度控制28－35℃，pH调节至5.5－6.5，通风比控制1：0.5－1，搅拌转速100－800rpm（可调节），溶氧控制20－30％，罐压0.5－1.0Mpa , 培养20h，得到菌种液。
需要二级扩大培养的生产过程同上述操作。
2、发酵
2.1起始原料预处理
2.1a 原料混合：粒度为0.125-0.850 mm，水分含量为12%-18%的玉米粉与赤藓糖醇发酵回收的60－65％含量的菌体，以200:1–300:1比例(w/w)在卧式混合机中进行混合,混合时间为10-30min。
2.1b 混合原料挤压：将2.1a步骤中的混合原料利用双螺杆挤压机进行挤压处理。挤压温度为120-150°C，进料速率为1–8 kg/min。
2.2 赤藓糖醇发酵底物制备
2.2a 配料：将步骤1所得的原料与处理水按1:3－4比例投入发酵罐中，进行配料。温度50-55°C，搅拌速率为100 rpm，调节料液pH5.8-pH6.2。
2.2b 液化：加入耐高温淀粉酶，添加量0.5-1L／t玉米粉(干基)，通入蒸汽升温至100℃液化，保温20min。然后降温至50-55°C，液化DE20－40％。
2.2c 糖化：调节pH4.5，加入高效液体糖化酶或复合糖化酶,添加量0.2-1L／t玉米粉(干基)，50-55°C搅拌保温15－36h，糖化液DE值90％以上。
2.2d蛋白质酶解：糖化同时加入蛋白水解酶，添加量100-200g/t玉米粉干基。
2.3 赤藓糖醇发酵
2.3a 先糖化后发酵：将培养好的种子液接入2.2所得的糖化后的发酵培养基物料中，接种量10－20％，温度控制28－35℃，pH调节至5.5－6.5，通风比控制1：0.5－1，搅拌转速100-800rpm（可调节），溶氧控制20－30％，罐压0.5－1.0 Mpa。糖浓度降至0.5％以下时直接放罐走料，或者继续流加补糖，补糖浓度50－65％，补糖速率在0.3－1.0％，发酵100－130h，检测赤藓糖醇含量大于14％。
或2.3b边糖化边发酵（糖化与发酵同时进行）：将培养好的种子接入未经糖化的液化液中，接种量10－20％，温度控制28－35℃，初始pH调节至5.5－6.5，通风比控制1：0.5－1，转速100-800rpm(可调节)，溶氧控制20－30％，罐压0.5－1.0 Mpa,微滤除菌加入高效液体糖化酶或复合糖化酶1.4mL，添加量0.6L／t玉米粉干基，加入蛋白酶，0－12h，控制pH4.0以上，边糖化边发酵。糖浓度降至0.5％以下时直接放罐走料，或者继续流加补糖，补糖浓度50－65％，补糖速率在0.3－1.0％，发酵100－130h检测结果赤藓糖醇含量大于14％。
3.发酵液分离、浓缩、结晶
3.1发酵液分离：经过金属微滤膜进行除菌，料液分离，过滤温度控制在10－50℃；
3.2发酵液浓缩：上清液经过升膜蒸发器进行水分蒸发，真空度0－0.1Mpa，蒸发到浓度为40－60％，添加0.1－10％、80－150目的晶种，进行降温结晶；
3.3粗结晶：浓缩的料液进行降温结晶，经过离心分离制备粗晶体。
3.4脱色：粗晶体溶解脱色过滤处理。
3.5除杂：进行离子交换去除杂质离子。
3.6重结晶：除杂后的料液经过真空浓缩器进行边浓缩边结晶，当浓缩到一定浓度后加入不同颗粒度的晶种，降温结晶制备不同颗粒度的晶体产品。
3.7晶体分离。离心分离晶体。
3.8晶体干燥。分离后的晶体送入低温流化床进行干燥，晶体经过离心分离，低温流化床或干燥机或箱式干燥设备进行干燥，低温干燥温度小于30℃，干燥晶体经过筛分分离制备不同颗粒度的赤藓糖醇产品。
3.9包装。无菌包装成品，产品用于食品、保健品、药用辅料等领域。
本发明筛选得到的的菌种解脂假丝酵母BLB-24，为优良高产赤藓糖醇菌株，将其用于本发明所述以玉米粉为起始原料的赤藓糖醇发酵生产过程，可使发酵液中赤藓糖醇含量提高2%左右。
具体实施方式
实施例1：
1.菌种培养
取200g脱胚玉米粉，酵母菌体2.5g，经过混合挤压处理，加水定容至0.7L，接入3L种子罐中，料液预先升温至50℃，搅拌，调节料液pH值5.8－6.0，加入耐高温淀粉酶0.09mL，添加量0.6L／t淀粉干基，通入蒸汽升温100℃液化，保温20min。然后降温至50-55°C ，调节pH4.5，加入高效液体糖化酶或复合糖化酶0.09mL,添加量0.6L／t淀粉干基，加入蛋白酶0.03g,50－55℃搅拌保温20h，糖化液DE值95.3％。
将糖化料液升温至121℃灭菌20min，降温至28－35℃，料液体积0.8L，pH调节5.5－6.5，接入解脂假丝酵母CGMCC No.1431菌种培养，通风比控制1：0.5－1，搅拌转速100－800rpm（可调节），溶氧控制20－30％，罐压0.5－1.0 Mpa,培养20h，得到菌种液。
需要二级扩大培养的生产过程同上述操作。
2、发酵及后提取过程
取3000g脱胚玉米粉，酵母菌体15g，经过混合挤压处理，加入水定容至7L，接入15L发酵罐中，料液预先升温至50℃，搅拌，调节料液pH值5.8－6.0，加入耐高温淀粉酶1.4mL，添加量0.6L／t淀粉干基，通入蒸汽升温100℃液化，保温20min。液化液DE值35％。将液化料液升温至121℃灭菌15min，后降温至28－35℃，料液体积8L，初始pH调节至5.5－6.5，制得发酵培养液。
将培养好的种子接入发酵培养基，接种量10％，通风比控制1：0.5－1，转速100-800rpm(可调节)，溶氧控制20－30％，罐压0.5－1.0 Mpa,加入经膜过滤的高效液体糖化酶或复合糖化酶1.4mL,添加量0.6L／t玉米粉淀粉干基，加入蛋白酶0.45g,0－12h，控制pH4.0以上，边糖化边发酵。流加补糖，补糖浓度50－65％，补糖速率0.3－1.0％，补糖来源市售固体或液体葡萄糖或此方法玉米粉制备的过滤浓缩葡萄糖。糖浓度降至0.5％以下放罐走料，发酵120h检测赤藓糖醇含量14.8％。
将发酵液进行金属膜微滤过滤，上清液通过升膜浓缩器浓缩至55％，在结晶罐中结晶，得到结晶赤藓糖醇。将赤藓糖醇固体溶解脱色处理，经过离子交换柱脱盐，在真空条件下边浓缩边结晶，在结晶过程中，根据不同温度的溶解度不同，在结晶的过饱和点之前加入0.1－10％，80－150目不同目数的晶种，在结晶罐中结晶，所得晶体的熔点118－122℃。最后通过筛分机进行筛分处理，在净化间进行成品包装得到不同颗粒度的产品。
实施例2：
1、 菌种培养
取200g脱胚玉米粉，酵母菌体2.5g，经过挤压膨化处理，加水定容至0.7L，接入3L种子罐中，料液预先升温至50℃，搅拌，调节料液PH值5.8－6.0，加入耐高温淀粉酶0.09mL，添加量按照0.6L／t玉米粉干基，通入蒸汽升温100℃液化，保温20min。然后降温至50-55℃，调节pH4.0－4.5，加入高效液体糖化酶或复合糖化酶0.09ml,添加量0.6L／t玉米粉干基，加入蛋白酶0.03g,50－55℃搅拌糖化保温20h，糖化液DE值95.3％。
将糖化料液升温至121℃灭菌20min，降温至28－35℃，料液体积0.8L，PH调节至5.5－6.5，接入解脂假丝酵母CGMCC No.1431菌种培养，通风比控制1：0.5－1，搅拌转速100-800rpm(可调节)，溶氧控制20－30％，罐压0.5－1.0 Mpa,培养20h，得到菌种液。
需要二级扩大培养的生产过程同上述操作。
2、发酵及后提取过程
取3000g脱胚玉米粉，酵母菌体15g,经过混合挤压处理，加入水定容至7L，接入15L发酵罐中，料液预先升温至50℃，搅拌，调节料液pH值5.8－6.0，加入耐高温淀粉酶1.4mL，添加量0.6L／t玉米粉干基，通入蒸汽升温100℃液化，保温20min。然后降温至50-55℃，调节pH4.5，加入高效液体糖化酶或复合糖化酶1.4mL,添加量0.6L／t玉米粉干基，加入蛋白酶0.45g 。50－55℃搅拌糖化保温20h，糖化液DE值95.6％。将糖化料液升温至121℃灭菌15min，降温至28－35℃，料液体积8L，初始PH调节5.5－6.5，制得发酵培养液。
将培养好的种子接入发酵培养基，接种量10％，通风比控制1：0.5－1，转速100-800rpm(可调节)，溶氧控制20－30％，罐压0.5－1.0 Mpa。流加补糖，补糖浓度50－65％，补糖速率在0.3－1.0％。糖浓度降至0.5％以下放罐走料，发酵120h检测赤藓糖醇含量15.2％。
产品生产精制过程同实施例1。
实施例3：
1、菌种培养
取200g脱胚玉米粉，酵母菌体2.5g，加入水定容至0.7L，接入3L种子罐，料液预先升温至50℃，搅拌，调节料液pH值5.8－6.0，加入耐高温淀粉酶0.09mL，添加量0.6L／t玉米粉干基，料液直接通入蒸汽升温100℃液化，保温20min。然后降温至50－55℃，调节pH4.5，加入高效液体糖化酶或复合糖化酶0.09mL，加入蛋白酶0.03g，添加量0.6L／t玉米粉干基，50－55℃搅拌糖化保温20h，糖化液DE值达到94.3％。
将糖化料液升温至121℃灭菌15min，降温至28－35℃，料液体积0.8，pH调节5.5－6.5，接入解脂假丝酵母CGMCC No.1431菌种培养，通风比控制1：0.5－1，搅拌转速100-800rpm(可调节)，溶氧控制20－30％，罐压0.5－1.0 Mpa，培养20h，得到菌种液。
2、发酵及后提取过程
取3000g脱胚玉米粉，酵母菌体15g，加入水定容至7L，接入15L发酵罐中，料液预先升温至50℃，搅拌，调节料液pH值5.8－6.0，加入耐高温淀粉酶1.4mL，添加量0.6L／t玉米粉干基，通入蒸汽升温100℃液化，保温30min。液化液DE值30％。将液化料液升温至115℃灭菌20min，降温至28－35℃，料液体积8L，初始pH调节至5.5－6.5，制得发酵培养液。
将培养好的种子接入发酵培养基，接种量10％，通风比控制1：0.5－1，转速100-800rpm(可调节)，溶氧控制20－30％，罐压0.5－1.0 Mpa,加入膜过滤除菌高效液体糖化酶或复合糖化酶1.4mL，添加量0.6L／t玉米粉干基，加入蛋白酶0.45g，0－12h，控制pH4.0以上，边糖化边发酵。流加补糖，补糖浓度50－65％，补糖速率在0.3－1.0％。糖浓度降至0.5％以下放罐走料，发酵120h检测赤藓糖醇含量14.6％。
产品生产精制过程同实施例1。
实施例4：
1、 菌种培养
取200g脱胚玉米粉，酵母菌体2.5g，加水定容至0.7L，接入3L种子罐中，料液预先升温至50℃，搅拌，调节料液pH值5.8－6.0，加入耐高温淀粉酶0.09mL，添加量0.6L／t玉米粉干基，通入蒸汽升温100℃液化，保温20min。然后降温至50－55℃，调节pH4.5，加入高效液体糖化酶或复合糖化酶0.09mL，添加量0.6L／t玉米粉干基，加入蛋白酶0.03g，50－55℃搅拌保温20h，糖化液DE值92.4％。将糖化后的料液升温至121℃灭菌20min，降温至28－35℃，料液体积0.8L，pH调节5.5－6.5，接入解脂假丝酵母CGMCC No.1431菌种培养，通风比控制1：0.5－1，搅拌转速100-800rpm(可调节)，溶氧控制20－30％，罐压0.5－1.0 Mpa，培养22h，得到菌种液。
2、发酵及后提取过程
取3000g脱胚玉米粉，酵母菌体16g,加水定容至7L，接入15L发酵罐中，料液预先升温至50℃，搅拌，调节料液pH值5.8－6.0，加入耐高温淀粉酶1.4mL，添加量0.6L／t玉米粉干基，通入蒸汽升温100℃液化，保温30min。降温至50－55℃，调节pH4.5，加入高效液体糖化酶或复合糖化酶1.4ml，添加量0.6L／t玉米粉干基，加入蛋白酶0.45g，50－55℃搅拌糖化保温24h，糖化液DE值96.3％。将糖化料液升温至115℃灭菌15min，降温至28－35℃，料液体积8L，初始pH调节5.5－6.5，制备发酵培养液。
将培养好的种子接入发酵培养基，接种量10％，通风比控制1：0.5－1，转速100-800rpm(可调节)，溶氧控制20－30％，罐压0.5－1.0 Mpa。流加补糖，补糖浓度50－65％，补糖速率在0.3－1.0％。糖浓度降至0.5％以下放罐走料，发酵120h检测结果赤藓糖醇含量15.2％。
产品生产精制过程同实施例1。
实施例5：
1、菌种培养
取200g脱胚玉米粉，加水定容至0.6L，接入3L种子罐中，料液预先升温至50℃，搅拌，调节料液pH值6.0，加入耐高温淀粉酶0.15mL，添加量1L／t玉米粉干基，通入蒸汽升温100℃液化，保温20min。然后降温至60℃，调节pH4.5，加入高效液体糖化酶或复合糖化酶0.15mL,添加量1L／t玉米粉干基，加入蛋白酶0.03g，50－55℃搅拌糖化保温22h，糖化液DE值96.6％。将酵母菌体2.5g，配制料液体积0.1L，加入糖化后的料液，混合料液升温至121℃灭菌15min，然后降温至28－35℃，料液体积0.8L，pH调节至5.5－6.5，接入解脂假丝酵母BLB-24菌种培养，通风比控制1：0.5－1，搅拌转速100-800rpm(可调节)，溶氧控制20－30％，罐压0.5－1.0 Mpa, 培养20h，得到菌种液。
2、发酵及后提取过程
取3000g脱胚玉米粉，加水定容至6L，接入15L发酵罐中，料液预先升温至50℃，搅拌，调节料液pH值6.0，加入耐高温淀粉酶2.1mL，添加量1L／t玉米粉干基，通入蒸汽升温100℃液化，保温20min。然后降温至50－55℃，调节pH4.5，加入高效液体糖化酶或复合糖化酶2.1mL,添加量1L／t玉米粉干基，加入蛋白酶0.45g，50－55℃搅拌糖化保温30h，糖化液DE值97.2％。将酵母菌体15g，配制体积1L，接入糖化料液，升温至115℃灭菌15min，降温至28－35℃，料液体积8.5L，pH调节至5.5－6.5，制备发酵培养液。
将扩大培养好的种子液接入发酵培养基，接种量10％，通风比1：0.5－1，搅拌转速100-800rpm(可调节)，溶氧控制20－30％，罐压0.5－1.0 Mpa 。流加补糖，补糖浓度50－65％，补糖速率在0.3－1.0％。糖浓度降至0.5％以下放罐走料，发酵120h检测结果赤藓糖醇含量17.6％。
实施例6：
1、菌种培养
取200g脱胚玉米粉，酵母菌体2.5g，加入水定容至0.7L，接入3L种子罐，料液预先升温至50℃，搅拌，调节料液pH值5.8－6.0，加入耐高温淀粉酶0.09mL，添加量0.6L／t玉米粉干基，通入蒸汽升温100℃液化，保温20min。降温至50－55℃，调节pH4.5，加入高效液体糖化酶或复合糖化酶0.09mL，添加量0.6L／t玉米粉干基，加入蛋白酶0.03g，50－55℃搅拌保温20h，糖化液DE值92.4％。将糖化后的料液升温至121℃灭菌15min，降温至28－35℃，料液体积0.8L，PH调节至5.5－6.5，接入解脂假丝酵母BLB-24菌种培养，通风比控制1：0.5－1，搅拌转速100-800rpm(可调节)，溶氧控制20－30％，罐压0.5－1.0Mpa，培养22h，得到菌种液。
2、发酵及后提取过程
取3000g脱胚玉米粉，酵母菌体12g，柠檬酸铵或柠檬酸加氨水、无机盐等需要量，加入水定容至7L，接入15L发酵罐中，料液预先升温至50℃，搅拌，调节料液pH值5.8－6.0，加入耐高温淀粉酶1.4mL，添加量0.6L／t玉米粉干基，通入蒸汽升温100℃液化，保温20min。液化液DE值35％。将液化料液升温至121℃灭菌15min，降温至28－35℃，料液体积8L，初始pH调节5.5－6.5。
将培养好的种子接入发酵培养基，接种量10％，通风比1：0.5－1，转速100-800rpm(可调节)，溶氧控制在20－30％，罐压0.5－1.0Mpa,加入膜过滤除菌高效液体糖化酶或复合糖化酶1.4mL，添加量0.6L／t玉米粉干基，加入蛋白酶0.45g，0－12h，控制pH4.0以上，边糖化边发酵。流加补糖，补糖浓度50－65％，补糖速率在0.3－1.0％。糖浓度降至0.5％以下放罐走料，发酵120h检测赤藓糖醇含量16.2％。
产品生产精制过程同实施例1。
实施例7：
1.菌种培养
取200g玉米直接粉碎玉米粉，经过挤压膨化处理，加入水定容至0.6L，接入3L种子罐中，料液预先升温至50℃，搅拌，调节料液pH值6.0，加入耐高温淀粉酶0.15mL，添加量1L／t玉米粉干基，通入蒸汽升温100℃液化，保温20min。然后降温至50－55℃，调节pH4.5，加入高效液体糖化酶或复合糖化酶0.15mL，添加量1L／t玉米粉干基，加入蛋白酶0.03g，50－55℃搅拌保温25h，糖化液DE值94.8％。将酵母菌体2.5g，配制料液0.1L，接入糖化后的料液，升温至121℃灭菌15min，降温至28－35℃，料液0.8L，pH调节至5.5－6.5，接入解脂假丝酵母BLB-24菌种培养，通风比控制1：0.5－1，搅拌转速100-800rpm(可调节)，溶氧控制20－30％，罐压0.5－1.0Mpa，培养20h，得到菌种液。
发酵及后提取过程
取3000g玉米直接粉碎玉米粉，经过挤压膨化处理，加入水定容至6升，接入15L发酵罐中，料液预先升温至50℃，搅拌，调节料液pH值6.0，加入耐高温淀粉酶2.1mL，添加量1L／t玉米粉干基，通入蒸汽升温100℃液化，保温20分钟。然后降温至50－55℃，调节PH4.5，加入高效液体糖化酶或复合糖化酶2.1mL，添加量1L／t玉米粉干基，加入蛋白酶0.45g，60℃搅拌糖化保温20h，糖化液DE值95.1％。将酵母菌体15g，配制1L，接入糖化后的料液，升温至115℃灭菌20min，降温至28－35℃，制备发酵培养基8.5L，pH调节至5.5－6.5。
将扩大培养好的种子液接入发酵培养基，接种量10％，通风比控制1：0.5－1，搅拌转速100－800rpm（可调节），溶氧控制20－30％，罐压0.5－1.0Mpa。流加补糖，补糖浓度50－65％，补糖速率0.3－1.0％。糖浓度降至0.5％以下放罐走料，发酵120h检测结果赤藓糖醇含量16.4％。
产品生产精制过程同实施例1。
实施例8：
1、菌种培养
取200g玉米直接粉碎玉米粉，酵母菌体2.5g，经过混合挤压处理，加入水定容至0.7L，接入3L种子罐中，料液预先升温至50℃，搅拌，调节料液pH值5.8－6.0，加入耐高温淀粉酶0.09mL，添加量0.6L／t玉米粉干基，通入蒸汽升温100℃液化，保温20min。降温至50－55℃，调节pH4.5，加入高效液体糖化酶或复合糖化酶0.09mL，添加量0.6L／t玉米粉干基，加入蛋白酶0.03g，60℃搅拌保温20h，糖化液DE值92.4％。将糖化后的料液升温至121℃灭菌15min，降温至28－35℃，料液体积0.8L，pH调节至5.5－6.5，接入解脂假丝酵母BLB-24菌种培养，通风比控制1：0.5－1，搅拌转速100-800rpm(可调节)，溶氧控制20－30％，罐压0.5－1.0Mpa，培养22h，得到菌种液。
发酵及后提取过程
取3000g脱胚玉米粉，酵母菌体15g，加入水定容至7L，接入15L发酵罐中，料液预先升温至50℃，搅拌，调节料液pH值5.8－6.0，加入耐高温淀粉酶1.4mL，添加量0.6L／t淀粉干基，通入蒸汽升温100℃液化，保温25min。液化液DE值25％。将液化料液升温至115℃灭菌15min，降温至28－35℃，料液体积8L，初始pH调节5.5－6.5。
将培养好的种子接入发酵培养基，接种量10％，通风比控制1：0.5－1，转速100-800rpm(可调节)，溶氧控制20－30％，罐压0.5－1.0Mpa，加入膜过滤除菌高效液体糖化酶或复合糖化酶1.4mL，添加量0.6L／t淀粉干基，加入蛋白酶0.45g，0－12h，控制pH4.0以上，边糖化边发酵。流加补糖，补糖浓度50－65％，补糖速率0.3－1.0％。糖浓度降至0.5％以下放罐走料，发酵120h检测赤藓糖醇含量16.5％。
产品生产精制过程同实施例1。
上述技术方案及实施例中未详细描述之处，均可参照现有技术。
本发明的方法同样适用于其它以淀粉或葡萄糖为原料的菌种生产赤藓糖醇，包括但不限于解脂假丝酵母。
应该理解本发明不限于这里所示和描述的特定实施例。在此并不是想详细描述那些本领域普通技术人员在阅读本发明说明书的基础上可以做到的所有显而易见的变化和改变。但是，应当清楚的是所有这些变化和改变都包括在所附权利要求书所限定的本发明的范围内。
Claims (4)
1.一种玉米粉生产赤藓糖醇的方法，其特征在于以玉米粉为起始原料，与分离回收的酵母菌体混合配料；对物料进行液化、糖化、蛋白质水解，接种解脂假丝酵母进行发酵，制得含有赤藓糖醇的发酵液；再经分离、浓缩、结晶，制得赤藓糖醇成品；其中所说的混合配料是将回收的酵母菌体添加到玉米粉中，经双螺杆挤压机进行混合挤压处理，制得混合物料；所说的液化、糖化、蛋白质水解以及发酵过程如下：配料：将混合挤压所得的混合物料与处理水按1:3－4比例投入发酵罐中，进行配料；温度50-55°C，搅拌速率为100 rpm，调节料液pH5.8-pH6.2；液化：加入耐高温淀粉酶，添加量0.5-1L／t玉米粉干基，通入蒸汽升温至100℃液化，保温20min；然后降温至50-55°C，液化DE值20－40％；
糖化：调节pH4.5，加入高效液体糖化酶或复合糖化酶,添加量0.2-1L／t玉米粉干基，50-55°C搅拌保温15－36h，糖化液DE值90％以上；
蛋白质水解：糖化同时加入蛋白水解酶，添加量100-200g/t玉米粉干基；
赤藓糖醇发酵：将培养好的种子液接入经液化、糖化、蛋白质水解所得的物料—发酵培养基中，接种量10－20％，温度控制28－35℃，pH调节至5.5－6.5，通风比控制1：0.5－1，搅拌转速100-800rpm，溶解氧控制20－30％，罐压0.5－1.0 MPa；流加补糖，补糖浓度50－65％，补糖速率在0.3－1.0％，发酵100－130h，制得赤藓糖醇发酵液；所说的解脂假丝酵母为解脂假丝酵母，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏时间为2010年11月25日，保藏号为CGMCC No.4364。
2.如权利要求1所述玉米粉生产赤藓糖醇的方法，其特征在于所说的配料、液化、糖化、蛋白质水解以及发酵均在同一发酵罐中进行。
3.如权利要求1所述玉米粉生产赤藓糖醇的方法，其特征在于所说的起始原料玉米粉为粒度0.125-0.850 mm，含水量为12%-18%的玉米粉。
4.如权利要求1所述玉米粉生产赤藓糖醇的方法，其特征在于所说的分离、浓缩、结晶过程如下：
发酵液分离：经过金属微滤膜进行除菌，料液分离，过滤温度控制在10－50℃；
发酵液浓缩、结晶：上清液经过升膜蒸发器进行水分蒸发，真空度0－0.1Mpa，蒸发到浓度为40－60％，添加浓缩发酵液量0.1－10％的80－150目的晶种，进行降温结晶；分离后的晶体送入低温流化床进行干燥，温度小于30℃。
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