CN107653287B - 一种硫酸粘菌素的改良发酵方法 - Google Patents

一种硫酸粘菌素的改良发酵方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种硫酸粘菌素的改良发酵方法，即将培养成熟的种子液移入无菌培养基，通过控制温度，罐压，转速，残糖，补加氨水、葡萄糖和消泡剂进行发酵。本发明的有益效果为：通过控制玉米淀粉糖化后的还原糖含量，达到稳定和提高发酵水平的目的；补糖工艺的优化，对发酵的不同阶段的还原糖进行控制，达到降低菌种衰老和提高发酵水平的目的。与已知文献资料相比：更利于淀粉酶液化和糖化的过程控制，便于工人操作和控制还原糖含量；便于控制糖化过程和结果；发酵水平高；提高生产效率；原料成本方面比原有配方降低9.2％，耗糖量降低8.2％，产量提升13.0％，进一步完善工艺，提高整体效益10％以上。

Description

一种硫酸粘菌素的改良发酵方法
技术领域
本发明涉及生物医药发酵生产技术领域，具体涉及一种硫酸粘菌素的改良发酵方法。
背景技术
一、硫酸粘菌素，即多粘菌素E，为多粘菌素E1、E2和E1-2硫酸盐的复合物。英文名称：COLISTIN SULPHATE，分子式：C55H104N16O13·2.5H2SO4，分子量1441。它是由日本的小山康夫在1950年从福岛县土壤中分离到的1株多粘芽胞杆菌抗敌素变株(Bacilluspolymyxavar.colistinus)的培养液中提取的一种锁环状多肽类抗生素。理化性质：硫酸粘菌素为白色或微黄色粉末，无臭，味苦且有引湿性，微溶于甲醇、乙醇，不溶于丙酮、氯仿、乙醚等，游离碱微溶于水，pH3.0～7.5范围内较稳定。在100℃放置数小时几乎不破坏，在强酸或碱性条件下易分解。在干燥状态下，低温避光保藏，活力能保持多年不变，硫酸粘菌素粉剂室温下可保存三年。
二、硫酸粘菌素是一种富含阳离子的抗微生物肽，对多数革兰氏阴性细菌有强力抑制作用，能与革兰氏阴性菌细胞外膜上带负电的脂多糖相互作用，从而破坏膜结构并穿越内膜，使细胞膜通透性增大，内容物外漏，导致细菌死亡。硫酸粘菌素对大肠埃希菌、克雷伯菌属、肠杆菌属等有较强的杀灭作用，为畜禽顽固性痢疾等肠道常见病的首选药物。该药物具有较低的浓度(0.004％)下对革兰氏阴性菌引起的疾病有治疗和预防作用。难于从胃肠道吸收，口服在动物体内和粪便中几乎无残留、无污染，满足绿色食品的要求。在发达国家的饲养领域作为畜禽顽固性痢疾等肠道常见病的首选药物。临床应用于儿童及婴儿由于革兰氏阴性菌引起的感染，为抗铜绿假单孢菌的首选药物；也用于大肠杆菌引起的败血症、急性肠炎及尿路感染、菌痢、铜绿假单孢菌的混合感染等。与利福平、诺氟沙星、环丙沙星、磺胺嘧啶钠、对氨基苯甲酸和头孢他定等具有联合的抗菌作用，药效的协同作用表现良好。硫酸黏菌素对畜禽等动物体内有害的革兰氏阴性菌具有强大的对抗杀菌作用，是最安全的抗生素之一。
三、淀粉作为微生物发酵的碳源，近几年得到了广泛的应用。陈小煌和李自然的多粘类芽孢杆菌培养条件优化；严芬和叶秀云等的一种高密度培养多粘类芽孢杆菌的方法中使用淀粉作为碳源都能提高发酵液中的菌体浓度。孙仲奇和裘娟萍等的碳源对多粘类芽孢杆菌生长和多粘菌素E合成的影响实验中显示，在发酵培养基中添加可溶性淀粉相比葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖是菌体最适碳源和产多粘菌素E量最高的碳源。陶银英的多粘菌素E产生菌高通量诱变育种的研究提到在微生物发酵中采用葡萄糖作为单一碳源，会发生糖分解代谢阻遏效应，导致抗生素或其它初级代谢以及次级代谢产物合成受阻。而使用葡萄糖(速效碳源)和淀粉(迟效碳源)的混合碳源既可以提高初期菌浓，也可以降低糖分解代谢阻遏效应，从而提高抗生素或其它初级代谢以及次级代谢产物合成量。
然而很多微生物不能直接利用淀粉或利用量不足，当使用淀粉作为碳源使用时，一般会采用水解淀粉成葡萄糖的方式来解决和提高淀粉的利用率。水解淀粉的方式一般有三种：
3.1酸解法：
酸解法是淀粉分子和水分子在酸性和一定的温度、压力条件下反应,使淀粉分子中的糖苷键加水分解生成糖浆。
酸解法的特点：
(1)、适应于任何精制淀粉,工艺简单,水解时间短,生产效率高,糖化液过滤性能好。
(2)、必需在高温、高压和酸性条件下,易发生复合反应和分解反应.酸水解的副产物多。
3.2酸酶法：
酸酶结合法是指淀粉分子在酸性和一定的温度、压力条件下先水解反应,使淀粉初步转化,然后用淀粉酶转化,使淀粉和其它糖转化成葡萄糖。
酸酶结合法的特点：
(1)、具有酸水解法和酶解法的优点。
(2)、但是也要在高温、高压和酸性条件下进行。
(3)、只能用管道设备进行生产。
3.3双酶法：
采用酶液化和酶糖化的工艺称双酶化。
双酶法的特点：
(1)、糖化产物可控制,糖化产物品质大大改善,杂质少。
(2)、生产周期长,糖液易变质。
在微生物发酵中一般采用酶解法，可以控制糖产物的量和糖化产物的品质，而且杂质少，便于提高生产水平的稳定性。
酶解过程如图1所示。
四、还原糖浓度对发酵的影响：
在微生物发酵过程中，中后期的发酵一般采用控制底物浓度的办法来促进产物增加，即维持细胞代谢的最低浓度来促进产物产量或浓度最大化。而有些发酵产物特别是胞外产物，需要适当的底物浓度，增加胞外的渗透压，加快产物运出细胞，这样可以降低胞内的产物浓度，从而降低产物合成的反馈抑制作用，提高产物合成量。
五、现有硫酸粘菌素发酵工艺：
陈剑慧和田歌等人的专利：一种硫酸粘菌素工业生产发酵方法(专利申请号：CN201510983695.4)，配方采用的原料有玉米粉、淀粉酶、磷酸二氢钾、泡敌、糖化酶、大豆蛋白胨、花生饼粉、硫酸铵、七水硫酸亚铁(工业)和大豆油等原料；
该专利工艺如下：
液化糖化过程：发酵罐中投入玉米粉和淀粉酶，升温至80-84℃，保温液化15min,投入其它原料，降温至60-62℃，保温糖化15min。
生产过程中温度控制：0～70小时32.0～33.0℃，70～95小时31.0～32.0℃。
发酵周期80～96h，效价达到53～57万u/ml。
发明内容
本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种硫酸粘菌素的改良发酵方法。可以解决目前工艺存在问题：1.双酶法的淀粉液化和糖化工艺的稳定性；2.补糖工艺对发酵水平的影响。通过淀粉的液化和糖化，补糖工艺的优化可以稳定和提高发酵水平，可使效价提高到63～68万u/ml。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一种硫酸粘菌素的改良发酵方法，是将发酵原料玉米淀粉和淀粉酶投入至发酵罐中，定容后升温，保温液化后，再降温加入糖化酶，保温糖化，同时控制还原糖，再投入辅料，消毒后，控温控压控速进行发酵，发酵后放罐即可。
进一步的，上述的一种硫酸粘菌素的改良发酵方法，所述发酵罐为120m3罐，计料体积80m3。
进一步的，上述的一种硫酸粘菌素的改良发酵方法，按照质量百分比计，各发酵组分的加入量为：玉米淀粉2％，淀粉酶为玉米淀粉总质量的1.2％，磷酸二氢钾0.3％，泡敌0.02％，糖化酶为玉米淀粉总质量的0.6％，大豆饼粉1.3％，玉米蛋白粉1％，硫酸铵1.92％，工业用七水硫酸亚铁0.02％，大豆油1％。
进一步的，上述的一种硫酸粘菌素的改良发酵方法，定容是将玉米淀粉和淀粉酶投入至发酵罐中后，以水定容至预计体积的70％。
进一步的，上述的一种硫酸粘菌素的改良发酵方法，定容后升温温度为80.0-84.0℃，保温液化时间为16min，再降温至60.0-62.0℃。
进一步的，上述的一种硫酸粘菌素的改良发酵方法，液化降温后，加入配比量的糖化酶，保温糖化17min，控制还原糖为0.52g/100ml，再加入配比量的其余原料，消毒后进行发酵。
进一步的，上述的一种硫酸粘菌素的改良发酵方法，消毒方法是将温度控制在120.0-122.0℃，罐压控制在0.10～0.12MPa，保温30min。
进一步的，上述的一种硫酸粘菌素的改良发酵方法，发酵过程中的温度控制为30.0～32.0℃，罐压控制为0.01-0.03MPa，搅拌转速控制为95rpm。
进一步的，上述的一种硫酸粘菌素的改良发酵方法，发酵过程中的还原糖控制为：0～20小时控制为(0.5-1.0)g/100ml，21～24小时控制为(0.3-0.5)g/100ml，24～85小时控制为(0.01-0.3)g/100ml。
进一步的，上述的一种硫酸粘菌素的改良发酵方法，发酵85h后放罐，效价680000u/ml。
表1显示为发酵培养基原料配方。
表1
Figure BDA0001453058780000041
本发明的有益效果为：
一、通过控制玉米淀粉糖化后的还原糖含量，达到稳定和提高发酵水平的目的。当液化和糖化不充分时，还原糖在0-0.3g/100ml时，菌体自身的微量的酶在整个发酵周期内不能完全利用淀粉，造成原料浪费。当液化和糖化后的还原糖在0.7g/100ml以上时，还原糖含量偏高，液化的还原糖是复合糖，包含葡萄糖和麦芽糖等。当发酵前期的葡萄糖含量不足时，也会引起菌量偏低，造成延迟期和对数期延后，从而影响延迟期和对数期的产素相关的酶的合成，最终影响到发酵水平。所以当还原糖含量控制在0.5-0.6g/100ml最合适，既能增加发酵液前期的菌体含量，后期又能利用菌体自身分泌的淀粉酶来控制还原糖含量，从而保证发酵水平稳定和提高。
二、还原糖的控制：
补糖工艺的优化，对发酵的不同阶段的还原糖进行控制，达到降低菌种衰老和提高发酵水平的目的。在发酵0-20h的还原糖控制0.5-1.0，有利于菌体繁殖；中后期的还原糖含量较原工艺略高，一方面会延缓菌种提前衰退，另一方面提高了发酵液渗透压，有利于胞内发酵产物的排出，降低了合成产物的反馈抑制作用，从而提高了发酵水平。
陈剑慧和田歌等人的专利(专利申请号：CN201510983695.4)中的还原糖控制：
0～10小时(0.01-0.5)g/100ml；
10～20小时(0.5-1.0)g/100ml；
21～24小时(1.0-0.2)g/100ml；
24～96小时(0.01-0.2)g/100ml。
新工艺的还原糖控制：
0～20小时(0.5-1.0)g/100ml；
21～24小时(0.5-0.3)g/100ml；
24～86小时(0.01-0.3)g/100ml。
新工艺相比已知文献资料的优点有：
1.玉米淀粉替换成玉米粉：由于玉米淀粉比玉米粉的淀粉纯度高和杂质少，更利于淀粉酶液化和糖化的过程控制。
2.液化和糖化时间：液化和糖化的时间调整到16-20min,便于工人操作和控制还原糖含量。
3.糖化过程：糖化后投入其它原料，避免了其它原料引起糖化酶活性降低，便于控制糖化过程和结果。
4.液化和糖化后的还原糖含量：通过实验，液化和糖化后的还原糖含量控制在0.5-0.6g/100ml，发酵水平最高。
5.优化补糖工艺：提高发酵前期的还原糖浓度，有利于提高菌体浓度，缩短延迟期，提高生产效率；适当提高发酵中后期的还原糖浓度，有利于延缓菌种衰退，有利于胞内发酵产物的排出，有利于降低合成产物的反馈抑制作用，有利于提高发酵水平。
6.首次采用双酶法酶解玉米淀粉(控制酶解还原糖量)用于硫酸粘菌素大型发酵生产中。放罐：86h放罐，效价630000～680000u/ml。
使用本工艺在原料成本方面比原有配方降低9.2％，耗糖量降低8.2％，产量提升13.0％，进一步完善工艺提高整体效益10％以上。
附图说明
图1显示为酶解过程。
图2显示为硫酸粘菌素的发酵工艺图。
图3显示为淀粉液化糖化工艺图。
具体实施方式
实施例1：
一种硫酸粘菌素的改良发酵方法，采用发酵罐：120m3罐，计料体积80m3，包括以下条件和步骤：
一、淀粉的液化和糖化:首先按比例在发酵罐中投入玉米淀粉、淀粉酶，定容至预计体积的70％左右，升温至80.0-84.0℃，保温液化16min，降温至60.0-62.0℃，加入糖化酶，保温糖化17min，还原糖为0.52g/100ml,再投入其它原料(配比见表1)。
二、消毒条件：温度控制在120.0-122.0℃，罐压控制在0.10～0.12MPa，保温30min。
三、温度控制：30.0～32.0℃。
四、罐压控制：0.01-0.03MPa；
五、搅拌转速控制：95rpm
六、还原糖控制：0～20小时(0.5-1.0)g/100ml，21～24小时(0.5-0.3)g/100ml，24～85小时(0.01-0.3)g/100ml。
放罐：85h放罐，效价680000u/ml。
实施例2：
一种硫酸粘菌素的改良发酵方法，采用发酵罐：120m3罐，计料体积80m3，包括以下条件和步骤：
一、淀粉的液化和糖化：首先按比例在发酵罐中投入玉米淀粉和淀粉酶，定容至预计体积的70％左右，升温至80.0-84.0℃，保温液化18min，降温至60.0-62.0℃，加入糖化酶和其它原料，保温糖化17min，还原糖0.58g/100ml,再投入其它原料(其它原料见表1)。
二、消毒条件：温度控制在120.0-122.0℃，罐压控制在0.10～0.12MPa，保温30min。
三、温度控制：30.0～32.0℃。
四、罐压控制：0.01-0.03MPa；
五、搅拌转速控制：95rpm
六、还原糖控制：0～20小时(0.5-1.0)g/100ml，21～24小时(0.5-0.3)g/100ml，24～86小时(0.01-0.3)g/100ml。
放罐：86h放罐，效价667000u/ml。
实施例3：
一种硫酸粘菌素的改良发酵方法，采用发酵罐：120m3罐，计料体积80m3，包括以下条件和步骤：
一、淀粉的液化和糖化：首先按比例在发酵罐中投入玉米淀粉、淀粉酶，定容至预计体积的70％左右，升温至80.0-84.0℃，保温液化16min，降温至60.0-62.0℃，加入糖化酶和其它原料，保温糖化17min。还原糖0.53g/100ml,再投入其它原料(其它原料见表1)。
二、消毒条件：温度控制在120.0-122.0℃，罐压控制在0.10～0.12MPa，保温30min。
三、温度控制：30.0～32.0℃。
四、罐压控制：0.01-0.03MPa；
五、搅拌转速控制：95rpm
六、还原糖控制：0～20小时(0.5-1.0)g/100ml，21～24小时(0.5-0.3)g/100ml，24～85小时(0.01-0.3)g/100ml。
放罐：85h放罐，效价673000u/ml。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种硫酸粘菌素的改良发酵方法，其特征在于，是将发酵原料玉米淀粉和淀粉酶投入至发酵罐中，定容后升温，保温液化后，再降温加入糖化酶，保温糖化，同时控制还原糖，再投入辅料，消毒后，将培养成熟的种子液移入，控温控压控速进行发酵，发酵后放罐即可；按照质量百分比计，各发酵组分的加入量为：玉米淀粉2％，淀粉酶为玉米淀粉总质量的1.2％，磷酸二氢钾0.3％，泡敌0.02％，糖化酶为玉米淀粉总质量的0.6％，大豆饼粉1.3％，玉米蛋白粉1％，硫酸铵1.92％，工业用七水硫酸亚铁0.02％，大豆油1％；发酵过程中的还原糖控制为：0～20小时控制为(0.5-1.0)g/100ml，21～24小时控制为(0.3-0.5)g/100ml，24～85小时控制为(0.01-0.3)g/100ml。
2.根据权利要求1所述的一种硫酸粘菌素的改良发酵方法，其特征在于，所述发酵罐为120m3罐，计料体积80m3。
3.根据权利要求1所述的一种硫酸粘菌素的改良发酵方法，其特征在于，定容是将玉米淀粉和淀粉酶投入至发酵罐中后，以水定容至预计体积的70％。
4.根据权利要求1所述的一种硫酸粘菌素的改良发酵方法，其特征在于，定容后升温温度为80.0-84.0℃，保温液化时间为16min，再降温至60.0-62.0℃。
5.根据权利要求4所述的一种硫酸粘菌素的改良发酵方法，其特征在于，液化降温后，加入配比量的糖化酶，保温糖化17min，控制还原糖为0.52g/100ml，再加入配比量的其余原料，消毒后进行发酵。
6.根据权利要求5所述的一种硫酸粘菌素的改良发酵方法，其特征在于，消毒方法是将温度控制在120.0-122.0℃，罐压控制在0.10～0.12MPa，保温30min。
7.根据权利要求6所述的一种硫酸粘菌素的改良发酵方法，其特征在于，发酵过程中的温度控制为30.0～32.0℃，罐压控制为0.01-0.03MPa，搅拌转速控制为95rpm。
8.根据权利要求6所述的一种硫酸粘菌素的改良发酵方法，其特征在于，发酵85h后放罐，效价680000u/ml。
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