CN103478441A - 一种大米活性菌肽鱼饲料及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种大米活性菌肽鱼饲料及其应用，在常规鱼饲料的制备原料中的蛋白源包括发酵大米蛋白，其原料中的蛋白源包括豆粕、鱼粉和发酵大米蛋白，其中发酵大米蛋白占原料总重的4%-10%。本发明利用枯草芽孢杆菌蛋白酶降解作用，将大米蛋白饲料进行发酵培养。通过探索最适发酵条件，提高大米蛋白饲料中小分子肽和氨基酸含量，制备成菌肽活性蛋白饲料，将其添加到水产动物饲料中，实现促进生长吸收和提高抗病力的作用，降低饲料生产成本，从而增加养殖效益。

Description

一种大米活性菌肽鱼饲料及其应用

技术领域

本发明属于渔业养殖领域，涉及一种大米活性菌肽鱼饲料及其应用。

背景技术

随着水产业生产的发展，水产必需的蛋白饲料越来越缺乏。1980年全世界的水产业所需蛋白质为2.3亿吨，1990年这个数字超过3.2亿吨，2000年这个数字已超过6亿吨，而到2006年这个数字达到13亿吨左右。其中水产饲料的主要蛋白源是大米蛋白、棉粕、菜粕、酒糟等，因此，开发新型的蛋白饲料源，提高饲料利用率和降低饲料生产成本成为目前饲料资源研究焦点。

    我国是世界著名的稻米大国，有着丰富的大米蛋白资源。据统计，亚洲是世界稻米生产和消费的主要地区，占世界总产量的91%，中国的稻米总产量占据其中的37%，居世界首位。稻米也是我国第一大粮食品种，总产量占全国粮食总产量的40%左右。大米蛋白为稻米加工后的副产品，过滤掉大米浆液后剩下的残渣中蛋白质含量高达50%(干基)以上，是大米原有蛋白质含量的6～10倍（朱斌昕.大米蛋白—大米中的含量、品质及分布[J].无锡轻工业学院学报,1986,(3):67～72）。大米蛋白具有优良营养品质，是公认的优质的植物蛋白源。大米蛋白的品质优于小麦蛋白和玉米蛋白，富含各类氨基酸，且氨基酸构成配比均衡。其中赖氨酸的含量，更是远远高于其他的植物蛋白。在所有的谷物蛋白中, 大米蛋白里的氨基酸组成更接近FAO/WHO 建议模式, 是一种优质植物蛋白, 营养价值可与鸡蛋、鱼、虾及牛肉等动物蛋白相媲美（陈正行,姚惠源.米蛋白和米糠蛋白开发利用[J] .粮食与油脂, 2002, 4: 6- 9）。

枯草芽孢杆菌作为一种广泛应用的益生菌，菌体自身合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与动物体内的消化酶类一同发挥作用，促进生长代谢。且枯草芽孢杆菌自身抗逆性极强，利于保存和管理，对水产动物而言，枯草芽孢杆菌对水产中的弧菌、大肠杆菌和杆状病毒等有害细菌有很强的抑制作用，有效预防水产动物肠炎，烂鳃等疾病。分泌大量几丁质酶的功能，几丁质酶可分解病原真菌的细胞壁而抑制真菌病害，分解养殖池中的有毒有害物质，净化水质；分解池中残饵、粪便、有机物等,具有很强的清理水中垃圾小颗粒的作用。

酸溶蛋白是低分子量蛋白质的水解物，包括小肽和游离氨基酸，其中主要成分为小肽，因其易溶于酸性溶液中而得名（刘雪花. 混合菌株发酵豆粕及其特性研究[D]. 华南理工大学硕士论文, 2011）。所以用酸溶蛋白作为发酵产物的小肽含量考察指标。近年来研究发现,蛋白质的水解物小肽可直接被动物机体吸收并在细胞内作为合成蛋白质的底物；同时,小肽作为蛋白质的主要消化产物，在氨基酸消化、吸收和代谢中起着重要作用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种大米活性菌肽鱼饲料及其应用，本发明通过探索最适发酵条件，提高大米蛋白饲料中小分子肽和氨基酸含量，制备成菌肽活性蛋白饲料，将其添加到水产动物饲料中，实现促进生长吸收和提高抗病力的作用，降低饲料生产成本，从而增加养殖效益。

本发明提供的技术方案是：一种大米活性菌肽鱼饲料，在常规鱼饲料的制备原料中的蛋白源包括发酵大米蛋白，所述发酵大米蛋白的制备方法如下：

（1）将大米蛋白放入瓶中，经灭菌后加入适量无菌水；

（2）将灭菌后的大米蛋白用枯草芽孢杆菌进行发酵，发酵得到的混合物进行烘箱干燥，用粉碎机粉碎即可。

上述发酵大米蛋白的具体制备方法如下：

采用固态发酵技术，将大米蛋白10~70g放入在250ml锥形瓶中，通过115℃高压蒸汽灭菌15min，冷却至常温；

    将对数生长期枯草芽孢杆菌的种子液加入灭菌蒸馏水中，接种量为3~12%，调节pH5.5-8.5，含水量为40~70%，加入到装有大米蛋白锥形瓶中，充分混匀后封口，整个过程无菌操作；

    将锥形瓶放置于恒温培养箱中，在净化工作台无菌条件下通风搅拌， 使发酵菌种和基质充分混匀，无菌密封后继续置于恒温培养箱中培养；

    将锥形瓶放入恒温培养箱内，温度设定为22~40℃，培养时间为20~100h；

    从培养开始每间隔12h,在净化工作台无菌条件下将锥形瓶内大米蛋白用灭菌玻璃棒搅拌均匀；

    将烘箱的干燥温度调至为50℃，烘干时间为72h；

将发酵得到的混合物进行烘箱干燥后经粉碎机粉碎即得发酵大米蛋白。

进一步地，所述的大米活性菌肽鱼饲料，其原料中的蛋白源包括豆粕、鱼粉，并且所述发酵大米蛋白按原料总重量比的4%-10%替代作为蛋白源的鱼粉。

优选地，所述的大米活性菌肽鱼饲料，所述豆粕、鱼粉、发酵大米蛋白占原料总重量的比例分别为：10%-30%，10%-10%，4%-10%，更优先为：22%，20%，6%。

所述的大米活性菌肽鱼饲料，所述的发酵，其条件如下：按重量比加入1-5%葡萄糖（优选为2%），调节菌液浓度3~21%，发酵时间20-100h，发酵温度22-40℃，pH5.5-8.5。优选地，所述发酵时间72h，pH7.0，枯草芽孢杆菌种子液浓度为9%，发酵温度37℃，含水量为60%。

优选地，所述的烘箱干燥，烘干温度为50℃，时间为72h。

本发明还提供所述的大米活性菌肽鱼饲料在养殖鱼中的应用，特别是在养殖鲫鱼中的应用；也提供大米活性菌肽在制备鱼饲料中的应用。

用本发明所述大米活性菌肽鱼饲料养殖鲫鱼的方法是：选取初始体质量为20-30g的鲫鱼作为饲养对象，饲料为所述的大米活性菌肽鱼饲料，日投饲量为鱼体重的3%-5%。

    发酵产物中酸溶蛋白含量的测定方法，参照GBT 22492-2008 大豆肽粉^[6]和GBT 22729-2008 海洋鱼低聚肽^[7] 的检测方法。

    方法：称取1g（精确至0. 001g）样品。加入50mL的15%三氯乙酸溶液，混合均匀，静置10 min。将样品溶液在4000 r/min下离心10min后，弃沉淀，取全部离心清液。按照凯氏定氮法测定清液中的蛋白质水解物含量，计算出样品中酸溶蛋白质水解物的含量。蛋白质换算系数为6.25，检验结果根据样品的干燥失重，折算为干基。

本发明的优点和有益效果是：所述大米活性菌肽鱼饲料中含有发酵大米蛋白，该发酵大米蛋白是利用大米蛋白为固体培养基质，通过枯草芽孢杆菌作用进行生物发酵，开发出一种绿色、安全、高效的新型蛋白饲料，本发明大米活性菌肽鱼饲料不仅具有促生长，提高消化吸收率，而且具有调节肠道菌群平衡，防病，抗病等多种生理功能。

     本发明采用固态发酵技术，节水节能，原料来源丰富，工艺过程简单，加工成本低廉，操作方便，可实施性强，后期可以拓展到工业化生产中。

     采用枯草芽孢杆菌作为发酵菌种，安全无毒无害，由于菌种抗逆性极强，便于保存和管理，且益生菌自身也可作为一种菌体蛋白发挥营养和免疫作用。

    采用大米蛋白作为原料，具有低抗原性，无色素干扰，柔和而不刺激味觉及高营养价值，尤其是低抗原性是其有别于其它植物蛋白一个重要特点。发酵中不需要考虑抗营养分子因素的影响，不存在有害成分。且发酵过程中原料完全利用，无废物排放，不污染环境。

本发明制备的大米活性菌肽鱼饲料，各种多肽和氨基酸配比均衡，具有多种生理功能，科学，安全，卫生，且价格低廉。不仅含有水产动物更容易吸收和利用的氨基酸和多肽类营养物质，促进水产动物生长代谢，且经过菌体蛋白酶酶解产生的小肽，更可促进鱼类的摄食，提高饲料中蛋白质和微量元素的利用率，促进鱼体生长，提高鱼类某些消化酶的活力，增强鱼类的免疫力并可提高其成活率。本发明中的发酵大米蛋白不仅应用在渔业养殖领域，还可以应用在畜牧业，添加在鸡鸭牛羊的饲料中。甚至可以拓展在人类的食品加工上。具有非常广泛的应用前景。

附图说明

图1 枯草芽孢杆菌摇瓶生长曲线。

图2  发酵时间对酸溶蛋白含量的影响。

图3  发酵温度对酸溶蛋白含量的影响。

图4  起始pH值对酸溶蛋白含量的影响。

图5  接种量对酸溶蛋白含量的影响。

图6  含水量对酸溶蛋白含量的影响。

图7  装量对酸溶蛋白含量的影响。

具体实施方式

实施例1：

    斜面培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml，pH7.0，琼脂20g，121℃高压灭菌20min。

    普通琼脂培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml，pH7.0，琼脂20g，121℃高压灭菌20min。

    枯草芽孢杆菌液体种子培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml，pH7.0，121℃高压灭菌20min。

    菌种活化培养： 取80 ℃冰箱保藏的枯草芽孢杆菌菌种(由湖南普菲克生物科技有限公司提供)划线接种到斜面培养基的试管中，37℃恒温倒置培养数天，直至出现明显的菌落后，再次划线接种至普通琼脂培养基的平板上，经37℃培养24h，再次出现明显菌落。

    液体摇瓶种子培养：液体摇瓶种子培养：用接种坏挑取培养24h的斜面种子，接种于液体摇瓶种子培养基中，在37℃恒温，转速180r/min条件下振荡培养24h。

    发酵培养基制备：大米蛋白，2%葡萄糖。

    用接种坏轻轻挑取培养24h的斜面种子，接种于250ml液体摇瓶中，在 37℃180r/min条件下振荡培养0-24h，用分光光度计测定3h、6h、9h、12h、15h、18h、24h菌液浓度的OD值，并绘制菌液生长曲线。选取对数生长期的菌液做为种子液接种到发酵培养基中（如图1）。

    将对数生长期种子液将10%的接种量(V/W)接种于装量为40g/250mL三角瓶发酵培养基中，充分混合均匀后，置于37℃恒温培养箱中培养72h，从培养开始每间隔12h在净化工作台无菌条件下通风搅拌1次， 使发酵菌种和基质充分混匀，无菌密封后继续置于培养箱中培养。

    单因素试验探讨：改变不同的发酵条件，如发酵时间（24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h），发酵温度（22℃、25℃、28℃、31℃、34℃、37℃、40℃），起始pH值（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5），接种量（3%、6%、9%、12%、15%、18%、21%），含水量（40%、45%、50%、55%、60%、65 %、70%）和装量（10g、20g、30g、40g、50g、60g、70g）等，测定不同条件下酸溶蛋白含量的变化趋势，探索单因素发酵的最佳条件（如图2- 7）。

    正交试验：参照单因素试验的结果，以酸溶蛋白的含量为考察指标，选取接种量、含水量、发酵温度和pH值4个因素，每个因素各取3个水平。结果如表2：

表1  L ₉ （3 ⁴ ）正交试验因素水平表

表2  L ₉ （3 ⁴ ）正交试验结果

    按照以上的试验方法得到最佳工艺条件发酵验证试验，得到酸溶蛋白含量结果与预测结果完全一致，证明发酵方案稳定可行。

实施例2：

    参照鲫鱼的营养参数和商品饲料配方，以大米蛋白，豆粕和鱼粉作为蛋白源，鱼油为脂肪源，以大米蛋白替代6%的鱼粉，分为发酵组和未发酵组，同时以鱼粉组做对照。饲料原料经粉碎过40目筛，微量成分采取逐级扩大法混合均匀后，添加鱼油等脂肪源，经充分混合，最后加水混合，经SLX-80型软颗粒饲料机制成直径为2.5mm的硬颗粒，自然风干后置于-20℃冰柜中保存备用。基础饲料配方见表5-1。

 

表3 鲫鱼基础饲料配方(%)

名称	对照组	未发酵	发酵
				高筋面粉	8	8	8
全脂米糠	12	12	12
				大米蛋白		6
发酵大米蛋白			6
				全脂鱼粉	20	14	14
豆粕	22	22	22
				棉粕	11	11	11
菜籽粕	21.8	21.8	21.8
				磷酸二氢钙	1.8	1.8	1.8
SALT	0.2	0.2	0.2
				氯化胆碱	0.2	0.2	0.2
鱼油	1.8	1.8	1.8
				大蒜素	0.05	0.05	0.05
防霉剂	0.1	0.1	0.1
				乙氧基喹啉	0.05	0.05	0.05
鲫鱼预混料	1	1	1
				营养指标(%)
粗蛋白	36.25	36.23	36.23
				粗脂肪	7.02	6.79	6.82
粗灰分	9.13	9.45	9.44

    选取初始体质量为26g左右的鲫鱼作为实验对象，进行7周的摄食生长试验。试验分为3组，每组设置3个重复，各30尾鱼，共 270尾鲫鱼随机分在9个水族缸中。日投饲量为试验鱼体重的3%-5%，每天早上清洁缸内的污物（粪便及排泄物等），并换水1/3，每周对水缸一次涮洗，以防止水质恶化导致鱼类死亡。试验期间水族箱24h不间断充气，天气转冷后用加热棒调控水温，使水温维持在22 -27 ℃。及时捞出病死鱼，每天记录水温、投喂量和摄食情况等。

    养殖试验结束后，停食1d，后称量每缸鱼总重量，记录鱼尾数，计算出每缸鲫鱼的平均体重，增重率，成活率，特定生长率，饲料系数和蛋白质效率。计算公式如下：

    增重率(WGR,%)=(鱼末均重-鱼初均重)/初始均重×100％；

    特定生长率(SGR,%·d-1)=(Ln鱼末均重-Ln鱼初均重)/实验天数×100％；

    成活率(SR,%)=试验末尾数/试验初尾数×100％；  

    饲料系数(FCR)=饲料消耗量/体增重；

    蛋白质效率(PER)=体增重／（摄食量×饲料蛋白质含量）；

表4 大米蛋白部分替代鱼粉对鲫鱼生长的影响

处理指标	对照组	未发酵	发酵
				初均重(g)	26.16±0.04	26.11±0.17	26.10±0.12
末均重(g)	49.42±2.32b	47.32±2.27a	48.23±2.26b
				成活率(%)	97.78±1.92ab	96.67±1.14a	100.00±0.00b
增重率(%)	87.77±5.22b	79.27±0.40a	84.79±2.43b
				饲料系数	2.08±0.12a	2.38±0.18b	2.17±0.14a
特定生长率(%)	1.30±0.08b	1.22±0.14a	1.28±0.08b
				蛋白质效率(%)	1.26±0.05b	1.21±0.11a	1.25±0.06b

注: 数据用平均值±标准差表示（mean±S.E.）;同行数值后不同上标英文字母表示差异显著(P<0.05).

经过7周养殖试验，结果表明：发酵组的成活率(%)，增重率(%)显著高于未发酵组，未发酵组显著低于鱼粉对照组（p<0.05），发酵组与鱼粉对照组则无显著性差异（p>0.05）。饲料系数中发酵组与对照鱼粉组无显著性差异（p>0.05），而未发酵组显著高于鱼粉对照组和发酵组（p<0.05）。特定生长率和蛋白质效率(%)发酵组与鱼粉对照组无显著性差异（p>0.05），而未发酵组显著低于鱼粉对照组和发酵组（p<0.05）。综合全部数据，鱼粉对照组各项指标都处于最高值，但发酵组与鱼粉对照组已无显著性差异（p>0.05）。试验表明，发酵大米蛋白饲料对鱼类生长和免疫均产生了有利的影响，可以代替部分鱼粉。

Claims (10)

1.一种大米活性菌肽鱼饲料，其特征在于：在常规鱼饲料的制备原料中的蛋白源包括发酵大米蛋白，所述发酵大米蛋白的制备方法如下：

（1）将大米蛋白放入瓶中，经灭菌后加入适量无菌水；

（2）将灭菌后的大米蛋白用枯草芽孢杆菌进行发酵，发酵得到的混合物进行烘箱干燥，用粉碎机粉碎即可。

2.根据权利要求1所述的大米活性菌肽鱼饲料，其特征在于：所述鱼饲料的制备原料中的蛋白源包括豆粕、鱼粉，并且所述发酵大米蛋白按原料总重量比的4%-10%替代作为蛋白源的鱼粉。

3.根据权利要求2所述的大米活性菌肽鱼饲料，其特征在于：所述豆粕、鱼粉、发酵大米蛋白占原料总重量的比例分别为：10%-30%，10%-10%，4%-10%。

4.根据权利要求3所述的大米活性菌肽鱼饲料，其特征在于：所述豆粕、鱼粉、发酵大米蛋白占原料总重量的比例分别为：22%，20%，6%。

5.根据权利要求1-4任一项所述的大米活性菌肽鱼饲料，其特征在于：所述的发酵，其条件如下：按重量比加入1-5%葡萄糖（优选为2%），调节菌液浓度3~21%，发酵时间20-100h，发酵温度22-40℃，pH5.5-8.5。

6.根据权利要求5所述的大米活性菌肽鱼饲料，其特征在于：所述发酵时间72h，pH7.0，枯草芽孢杆菌种子液浓度为9%，发酵温度37℃，含水量为60%。

7.根据权利要求6所述的大米活性菌肽鱼饲料，其特征在于：所述的烘箱干燥，烘干温度为50℃，时间为72h。

8.权利要求1-7 任意一项所述的大米活性菌肽鱼饲料在养殖鱼中的应用，优选地，所述鱼为鲫鱼。

9.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：选取初始体质量为20-30g的鲫鱼作为饲养对象，饲料为所述的大米活性菌肽鱼饲料，日投饲量为鱼体重的3%-5%。

10.大米活性菌肽在制备鱼饲料中的应用，其中所述大米活性菌肽是通过下述工艺制备：将大米蛋白放入瓶中，经灭菌后加入适量无菌水；将灭菌后的大米蛋白用枯草芽孢杆菌进行发酵，发酵得到的混合物进行烘箱干燥，用粉碎机粉碎即可。

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