CN110591931A - 一种巴斯德毕赤酵母、产生的耐高温酶及应用 - Google Patents

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CN110591931A CN201910924476.7A CN201910924476A CN110591931A CN 110591931 A CN110591931 A CN 110591931A CN 201910924476 A CN201910924476 A CN 201910924476A CN 110591931 A CN110591931 A CN 110591931A
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pichia pastoris
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gene
temperature
protease
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彭楠
刘玲
常章兵
田建平
梁运祥
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Sichuan Runge Biotechnology Co ltd
Huazhong Agricultural University
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Sichuan Runge Biotechnology Co ltd
Huazhong Agricultural University
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products

Abstract

本发明提供一种巴斯德毕赤酵母、产生的耐高温蛋白酶及应用，属于微生物技术领域；本发明通过选育一种可产生耐高温酶的巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)AN‑PK‑9K‑GS115，然后将其进行培养，从发酵液中提取耐高温蛋白酶，将其用于羽毛粉的水解，可以有效水解羽毛粉，将其中蛋白质组分高效降解为小肽成分或者氨基酸成分，从而提高蛋白质的消化率，增加采食量，提高动物健康水平。

Description

一种巴斯德毕赤酵母、产生的耐高温酶及应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种巴斯德毕赤酵母、产生的耐高温蛋白酶及应用。
背景技术
羽毛粉可广泛用于畜禽水产等高蛋白质饲料，蛋白质含量可高达80％，氨基酸组份比较齐全，其赖氨酸、蛋氨酸低于进口鱼粉外，其余微量元素均高于鱼粉，而且胱氨酸的含量居所有天然饲料之首，是很好的蛋白质饲料资源。在春秋换毛季节饲喂食羽毛粉,对毛绒的生长发育有利，同时还有减少鸡,鸭,啄肛,跳毛,貂、狐自咬和食毛现象的作用。羽毛粉为全营养食品，能提高皮毛动物健康水平，提高繁育能力，促进皮毛状况的改善，毛色变得更加健康、光泽。羽毛的主要成分为蛋白质，分子量较大，不易被动物体吸收，因此需要用蛋白酶先进行水解，将其分解为可以为动物体吸收利用的小分子多肽或氨基酸，从而增加蛋白质的消化率，改善蛋白质生物学效价。
但是一般的蛋白酶对羽毛粉的水解效果均不太理想，究其原因，是由于蛋白酶的制备过程中有一个高温干燥的过程，一般的蛋白酶在高温下容易降低活性甚至失活。
发明内容
本发明目的之一在于提供一种可产生耐高温酶的巴斯德毕赤酵母，目的之二在于提供这种酵母产生的耐高温蛋白酶在水解羽毛粉方面的应用。
本发明为解决上述技术问题，所采用的技术方案如下：
技术方案一：
一种巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)AN-PK-9K-GS115，保藏编号为：CCTCCNO：M 2019593；
其通过如下方法进行选育：
A、以枯草芽孢杆菌中蛋白酶表达基因为原始基因来源；
B、利用重叠延伸PCR技术获得目的基因序列Fpk；
C、将目的基因插入表达载体：插入构建的常规的巴斯德毕赤酵母表达载体p9kNTS、p9kMFⅡ，插入位点为EcoR1/Not1：
D、将上述表达载体进行重组和线性化；
E、电转化巴斯德毕赤酵母工程菌：经重组和线性化后，电转化；
F、初筛、复筛，最后获得目标菌株。
作为本发明的进一步改进，所述的步骤F具体过程为：摇瓶酶活测定筛选，以筛选到的p9kNTS-Fpk-GS115作为宿主菌，将重组质粒p9kNTS-Fpk、p9kMFⅡ-Fpk线性化后进行二次电转化，再依次进行10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL的G418梯度高拷贝筛选，并利用福林酚比色法进行蛋白酶酶活检测，获得目标菌株。
G418(Geneticin,遗传霉素)是一种氨基糖苷类抗生素,在分子遗传试验中，是稳定转染最常用的抗性筛选试剂。它通过抑制转座子Tn601，Tn5的基因,干扰核糖体功能而阻断蛋白质合成，对原核和真核等细胞产生毒素,包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞,也包括原生动物和蠕虫。当neo基因被整合进真核细胞DNA后,则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA,从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达,使细胞获得抗性而能在含有G418的选择性培养基中生长。G418的这一选择特性,已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。
技术方案二：
一种由巴斯德毕赤酵母产生的耐高温蛋白酶，其氨基酸序列表如SEQ ID NO:2所示。
进一步的，在20～80℃的条件下具有活性和热稳定性，在65℃条件下，活性可保持3h不变，在40～50℃的条件下，24h后有60％以上的活性；在pH 6～11范围内均有活性，当pH7～9时24h内酶活性保存率为100％。
作为本发明的进一步改进，获取过程如下：将巴斯德毕赤酵母AN-PK-9K-GS115通过甲醇补料发酵后，将发酵液经过板框过滤，再进一步喷雾干燥制成粉末状酶制剂，即为耐高温蛋白酶。耐高温蛋白酶活力大于等于50000U/mL，小于等于100000U/mL，比活力大于等于3000U/mg，小于等于5000U/mg。
技术方案三：
编码由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的耐高温蛋白酶的编码基因。
进一步的，编码基因由SEQ ID NO:1的核苷酸序列组成的耐高温蛋白酶基因。
技术方案四：
上述耐高温蛋白酶在酶解羽毛粉方面的应用，水解羽毛粉的方法如下：将耐高温蛋白酶按照料水比1:10加入到羽毛粉培养基中，在酶活1000-1500U/g、温度65℃、pH9.0条件下酶解3-4h。
除羽毛粉以外，本发明获得的耐高温蛋白酶在水解血粉、肉骨粉、蚕蛹和豆粕方面也有较佳的效果。
与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：
本发明所述的巴斯德毕赤酵母AN-PK-9K-GS115(pichia pastorisAN-PK-9K-GS115)是由毕赤酵母通过基因工程手段改造而成的，其形态及生理生化特征包括：呈乳白色，菌体镜检呈椭圆形或圆形，为甲醇营养型菌。可以产生能够有效水解羽毛粉的耐高温蛋白酶。
本发明产生的高温蛋白酶在20～80℃的条件下具有活性和热稳定性，在65℃条件下，活性可保持3h不变，在40～50℃的条件下，24h后有60％以上的活性；在pH 6～11范围内均有活性，当pH7～9时24h内酶活性保存率为100％；可以有效水解羽毛粉，将其中蛋白质组分高效降解为小肽成分或者氨基酸成分，从而提高蛋白质的消化率，增加采食量，提高动物健康水平。
本发明对羽毛粉的液体酶解方法操作简便，有利于节省时间，降低工业成本。
本发明对羽毛粉的处理温和无污染，不会破坏羽毛粉中的营养成分，具有较好的应用前景。
本分明对羽毛粉的充分利用，可以有效缓解饲料蛋白质资源的不足，促进畜牧业和饲料产业的发展。
为提高羽毛粉的水解效果，可以先用NaOH稀溶液对羽毛进行预处理，以破坏羽毛本身的致密结构。
镁离子可以作为金属离子螯合剂，一定浓度范围内可以提高蛋白酶活性。为进一步提高羽毛粉的水解效果，在水解过程中可以添加镁离子溶液。
本发明的巴斯德毕赤酵母AN-PK-9K-GS115(pichia pastorisAN-PK-9K-GS115)，保藏号为CCTCC NO：M 2019593，保藏日期为2019年7月30日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明所述的枯草芽孢杆菌为市售产品，以下实施例均为购买的北京三药的枯草芽孢杆菌，货号：SP02568,规格：103cfu/颗；有效期：12个月；储存：-20℃或-20℃以下；菌株来源：由中国医学细菌保藏管理中心(National Center For Medical CultureCollections,CMCC)提供的0代菌种生产；传代次数：第4代。
实施例1：
本实施例所述巴斯德毕赤酵母AN-PK-9K-GS115通过如下方法进行选育：
A、以购买自北京三药的枯草芽孢杆菌为原始基因来源，菌株货号为SP02568；
B、利用重叠延伸PCR技术获得基因序列Fpk；重叠延伸PCR技术即采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来；
进行PCR扩增过程中条件如下：(含10倍缓冲液以及Taq酶，dNTP等In-Fusion试剂盒)获得目的基因序列Fpk(如SEQ ID NO:1所示)；
引物F：5’-ctcctgccaagctgaagc-3’，
引物R：5’-gatcatggaacggattc-3’，
扩增程序：95℃2min；95℃30s，56℃30s，72℃1min，45个循环；72℃5min；4℃保存；
C、将目的基因插入表达载体：插入构建的常规的巴斯德毕赤酵母表达载体p9kNTS、p9kMFⅡ，插入位点为EcoR1/Not1：
D、将上述表达载体进行重组和线性化；
E、电转化巴斯德毕赤酵母AN-PK-9K-GS115：经重组和线性化后，电转化；
F、摇瓶酶活测定筛选，以筛选到的p9kNTS-Fpk-GS115作为宿主菌，将重组质粒p9kNTS-Fpk、p9kMFⅡ-Fpk线性化后进行二次电转化，再将转化子依次在浓度为10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL的G418平板上划线筛选，即梯度高拷贝筛选，并利用福林酚比色法进行蛋白酶酶活检测，获得目标菌株。
用目标菌株获取耐高温蛋白酶：巴斯德毕赤酵母AN-PK-9K-GS115的诱导表达和检测。
(1)将得到的巴斯德毕赤酵母AN-PK-9K-GS115转接到YPD平板上，然后挑选单菌落转接到发酵培养基中，在30℃，180rpm条件下，培养20-24h作为种子液。
发酵培养基：85％磷酸26.7mL/L，CaSO4 0.93g/L，K2SO4 18.2g/L，MgSO4·7H2O14.9g/L，KOH 4.13g/L，甘油40g/L。
(2)将种子液质量分数为5％接入中含有35L BSM无机盐培养基(上海钰博生物科技有限公司)的50L发酵罐中，控制pH值在5，温度为30℃，调节搅拌速度为600rpm，溶氧量DO控制在10％，随着发酵的进行溶氧量上升到30％且持续30-60min时，调节搅拌速度为800rpm，并且补充一次甲醇(补充量为总体积的1.5％)，并且根据溶氧量的变化和持续时间补充甲醇，以保持甲醇的浓度始终维持在1.5％。总发酵时间为48-72h，自发酵开始每12h取样一次，5000rpm离心15min，分别取上清液和菌体，测定上清液酶活。
上述重组菌发酵后，得到羽毛粉角蛋白酶粗酶液，发酵液中的蛋白酶活性随着发酵时间的延长酶活性在增加，但不是时间越长酶活越高，经测定发现：在发酵48h时，羽毛粉角蛋白酶粗酶液酶活可达5×104U/mL，酶比活力为3×103U/mg；发酵60h时，羽毛粉角蛋白酶粗酶液酶活可达1×105U/mL，酶比活力为5×103U/mg；而在发酵72h时，羽毛粉角蛋白酶粗酶液酶活可达7×104U/mL，酶比活力为3.5×103U/mg。
以上测定酶活采用的是福林酚比色法测定蛋白酶活力，即：以干酪素作为底物，反应产物含酚羟基的氨基酸与福林酚试剂在碱性条件下发生氧化还原反应产生显示蓝色，在660nm下测定吸光值。在65℃下，每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，即为1个蛋白酶活力单位。
应用例1：
以羽毛粉为原料，用实施例1获取的耐高温蛋白酶，在料水比1：10、酶活1500U/g、温度65℃、pH9.0条件下酶解3h，检测结果表明：52％的总蛋白被酶解成为可溶性蛋白，其中46％为酸溶蛋白，氨态氮的含量为1.9％。
应用例2：
将羽毛粉用NaOH溶液浸泡处理，用实施例1获取的耐高温蛋白酶，在料水比1：10、酶活1500U/g、温度65℃、pH9.0条件下酶解3h，检测结果表明：57％的总蛋白被酶解成为可溶性蛋白，其中48％为酸溶蛋白，氨态氮的含量为2.3％；所述NaOH溶液为浓度5wt％的稀溶液。
应用例3：
羽毛粉用NaOH溶液浸泡处理，用实施例1获取的耐高温蛋白酶，在料水比1：10、酶活1500U/g、温度65℃、pH9.0、Mg+2浓度2mM条件下酶解3h，检测结果表明：60％的总蛋白被酶解成为可溶性蛋白，其中53％为酸溶蛋白，氨态氮的含量为2.6％；所述NaOH溶液为浓度5wt％的稀溶液。
应用例4：
羽毛粉用NaOH溶液浸泡处理，用实施例1获取的耐高温蛋白酶，在料水比1：10、酶活10000U/g、温度65℃、pH9.0、Mg+2浓度2mM条件下酶解12h，检测结果表明：67％的总蛋白被酶解成为可溶性蛋白，其中62.6％为酸溶蛋白，氨态氮的含量为4.1％；所述NaOH溶液为浓度5wt％的稀溶液。
应用例5：
以猪血粉为原料，用实施例1获取的耐高温蛋白酶，在料水比1：10、酶活3000U/g、温度65℃、pH9.0条件下酶解3h，检测结果表明：67％的总蛋白被酶解成为可溶性蛋白，其中54％为酸溶蛋白，氨态氮的含量为3.3％。
应用例6：
以蚕蛹为原料，用实施例1获取的耐高温蛋白酶，在料水比1：10、酶活2500U/g、温度65℃、pH9.0条件下酶解3h，检测结果表明：49％的总蛋白被酶解成为可溶性蛋白，其中47.9％为酸溶蛋白，氨态氮的含量为2.3％。
应用例7：
以豆粕为原料，用实施例1获取的耐高温蛋白酶，在料水比1：10、酶活1000U/g、温度65℃、pH9.0条件下酶解3h，检测结果表明：42.9％的总蛋白被酶解成为可溶性蛋白，其中42.7％为酸溶蛋白，氨态氮的含量为2.4％。
应用例8：
以肉骨粉为原料，用实施例1获取的耐高温蛋白酶，在料水比1：10、酶活1000U/g、温度65℃、pH9.0条件下酶解3h，检测结果表明：74.12％的总蛋白被酶解成为可溶性蛋白，其中65.71％为酸溶蛋白，氨态氮的含量为3.3％。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 华中农业大学 四川润格生物科技有限公司
<120> 一种巴斯德毕赤酵母、产生的耐高温蛋白酶及应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1617
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgcgcaact tgaccaagac atctctatta ctggccggct tatgcacagc ggcccaaatg 60
gtttttgtaa cacatgcctc agctgaagaa agcatcgaat acgaccatac gtatcaaacc 120
ccttcataca tcatcgaaaa gtcaccgcag aagccggtac aaaacacaac ccagaaagaa 180
tcgctatttt cctatcttga caagcatcaa acgcagttta agctcaaagg gaatgcgaac 240
agccattttc gcgtttcgaa aaccataaag gatccaaaga caaaacaaac gttttttaaa 300
ttaacggagg tttacaaagg aattccgatt tacggctttg aacaagcggt cgcgatgaag 360
gaaaacaaac aagtgaaaag tttctttgga aaggtgcatc cgcaaatcaa ggacgtctcc 420
gtcacaccgt ctatttctga gaaaaaagca atacatacag caaggcgtga gctcgaggct 480
tccattggaa aaatcgaata tcttgatggg gaaccaaaag gcgaattata tatctatcca 540
cacgacggtg aatatgatct cgcctacctt gtgagactct cgacatctga acctgagcct 600
ggctattggc attatttcat cgatgccaaa aacggaaagg tcatcgagtc ctttaatgcc 660
attcatgaag cggcaggtac aggaatcggc gtgtcaggtg atgaaaaaag ctttgacgtc 720
acagaacaaa atgggcgctt ttatttggct gacgaaacaa ggggaaaagg gatcaataca 780
tttgacgcga agaacctgaa cgaaaccttg tttacgcttt tgtctcaact gatcgggtat 840
acgggcaaag aaatagtcag cggcacgtcc gtatttaatg aacctgcggc tgtagacgca 900
cacgcaaatg cgcaagccgt ttacgattat tacagcaaga catttggccg tgattctttt 960
gatcaaaacg gagcaaggat tacgtctacc gtgcatgtcg gcaaacaatg gaacaatgct 1020
gcgtggaacg gtgtccagat ggtatacggg gatggagacg gttcgaaatt taagccgctg 1080
tctggatcgc tcgacattgt cgcgcatgaa atcacacacg cagtcacaca gtattccgcc 1140
ggtcttttat atcaaggaga acccggtgca ttaaatgagt ccatttctga cattatgggc 1200
gcgatggctg accgtgatga ttgggagatc ggcgaagatg tctatactcc tggtattgca 1260
ggagattcat tgcggtcatt ggaggaccca tctaagcagg gaaatccaga tcattactcg 1320
aaccgctaca caggaacaga ggattatggc ggagtccata tcaattcgtc cattcacaat 1380
aaagcagctt atcttcttgc agaaggaggc gtgcaccacg gtgtacaggt tgaagggatt 1440
gggcgtgaag caagtgaaca aatttactat cgggctttaa catattatgt aacggcatct 1500
acagatttca gcatgatgaa gcaagcggcg attgaagctg ccaatgattt atacggtgaa 1560
ggctcgaagc aatcagcttc agtcgaaaag gcgtatgagg ctgtcggcat tctatga 1617
<210> 2
<211> 538
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Arg Asn Leu Thr Lys Thr Ser Leu Leu Leu Ala Gly Leu Cys Thr
1 5 10 15
Ala Ala Gln Met Val Phe Val Thr His Ala Ser Ala Glu Glu Ser Ile
20 25 30
Glu Tyr Asp His Thr Tyr Gln Thr Pro Ser Tyr Ile Ile Glu Lys Ser
35 40 45
Pro Gln Lys Pro Val Gln Asn Thr Thr Gln Lys Glu Ser Leu Phe Ser
50 55 60
Tyr Leu Asp Lys His Gln Thr Gln Phe Lys Leu Lys Gly Asn Ala Asn
65 70 75 80
Ser His Phe Arg Val Ser Lys Thr Ile Lys Asp Pro Lys Thr Lys Gln
85 90 95
Thr Phe Phe Lys Leu Thr Glu Val Tyr Lys Gly Ile Pro Ile Tyr Gly
100 105 110
Phe Glu Gln Ala Val Ala Met Lys Glu Asn Lys Gln Val Lys Ser Phe
115 120 125
Phe Gly Lys Val His Pro Gln Ile Lys Asp Val Ser Val Thr Pro Ser
130 135 140
Ile Ser Glu Lys Lys Ala Ile His Thr Ala Arg Arg Glu Leu Glu Ala
145 150 155 160
Ser Ile Gly Lys Ile Glu Tyr Leu Asp Gly Glu Pro Lys Gly Glu Leu
165 170 175
Tyr Ile Tyr Pro His Asp Gly Glu Tyr Asp Leu Ala Tyr Leu Val Arg
180 185 190
Leu Ser Thr Ser Glu Pro Glu Pro Gly Tyr Trp His Tyr Phe Ile Asp
195 200 205
Ala Lys Asn Gly Lys Val Ile Glu Ser Phe Asn Ala Ile His Glu Ala
210 215 220
Ala Gly Thr Gly Ile Gly Val Ser Gly Asp Glu Lys Ser Phe Asp Val
225 230 235 240
Thr Glu Gln Asn Gly Arg Phe Tyr Leu Ala Asp Glu Thr Arg Gly Lys
245 250 255
Gly Ile Asn Thr Phe Asp Ala Lys Asn Leu Asn Glu Thr Leu Phe Thr
260 265 270
Leu Leu Ser Gln Leu Ile Gly Tyr Thr Gly Lys Glu Ile Val Ser Gly
275 280 285
Thr Ser Val Phe Asn Glu Pro Ala Ala Val Asp Ala His Ala Asn Ala
290 295 300
Gln Ala Val Tyr Asp Tyr Tyr Ser Lys Thr Phe Gly Arg Asp Ser Phe
305 310 315 320
Asp Gln Asn Gly Ala Arg Ile Thr Ser Thr Val His Val Gly Lys Gln
325 330 335
Trp Asn Asn Ala Ala Trp Asn Gly Val Gln Met Val Tyr Gly Asp Gly
340 345 350
Asp Gly Ser Lys Phe Lys Pro Leu Ser Gly Ser Leu Asp Ile Val Ala
355 360 365
His Glu Ile Thr His Ala Val Thr Gln Tyr Ser Ala Gly Leu Leu Tyr
370 375 380
Gln Gly Glu Pro Gly Ala Leu Asn Glu Ser Ile Ser Asp Ile Met Gly
385 390 395 400
Ala Met Ala Asp Arg Asp Asp Trp Glu Ile Gly Glu Asp Val Tyr Thr
405 410 415
Pro Gly Ile Ala Gly Asp Ser Leu Arg Ser Leu Glu Asp Pro Ser Lys
420 425 430
Gln Gly Asn Pro Asp His Tyr Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Thr Glu Asp
435 440 445
Tyr Gly Gly Val His Ile Asn Ser Ser Ile His Asn Lys Ala Ala Tyr
450 455 460
Leu Leu Ala Glu Gly Gly Val His His Gly Val Gln Val Glu Gly Ile
465 470 475 480
Gly Arg Glu Ala Ser Glu Gln Ile Tyr Tyr Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr
485 490 495
Val Thr Ala Ser Thr Asp Phe Ser Met Met Lys Gln Ala Ala Ile Glu
500 505 510
Ala Ala Asn Asp Leu Tyr Gly Glu Gly Ser Lys Gln Ser Ala Ser Val
515 520 525
Glu Lys Ala Tyr Glu Ala Val Gly Ile Leu
530 535

Claims (8)

1.一种巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)AN-PK-9K-GS115，保藏编号为：CCTCC NO：M2019593；
其通过如下方法进行选育：
A、以枯草芽孢杆菌中蛋白酶表达基因为原始基因来源；
B、利用重叠延伸PCR技术获得目的基因序列Fpk；
C、将目的基因插入表达载体：插入构建的常规的巴斯德毕赤酵母表达载体p9kNTS、p9kMFⅡ，插入位点为EcoR1/Not1：
D、将上述表达载体进行重组和线性化；
E、电转化巴斯德毕赤酵母工程菌：经重组和线性化后，电转化；
F、初筛、复筛，最后获得目标菌株。
2.根据权利要求1所述的巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)AN-PK-9K-GS115，其特征在于，所述的步骤F具体过程为：摇瓶酶活测定筛选，以筛选到的p9kNTS-Fpk-GS115作为宿主菌，将重组质粒p9kNTS-Fpk、p9kMFⅡ-Fpk线性化后进行二次电转化，再将转化子依次在浓度为10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL的G418平板上划线筛选，即梯度高拷贝筛选，并进行酶活测定筛选，获得目标菌株。
3.一种由权利要求1所述的巴斯德毕赤酵母产生的耐高温蛋白酶，其特征在于：氨基酸序列表如SEQ ID NO:2所示。
4.一种由权利要求3所述的耐高温蛋白酶，其特征在于：其在20～80℃的条件下具有活性和热稳定性，在65℃条件下，活性可保持3h不变，在40～50℃的条件下，24h后有60％以上的活性；在pH 6～11范围内均有活性，当pH7～9时24h内酶活性保存率为100％。
5.根据权利要求4所述的耐高温蛋白酶，其特征在于，获取过程如下：将巴斯德毕赤酵母AN-PK-9K-GS115通过甲醇补料发酵后，将发酵液经过板框过滤，再进一步喷雾干燥制成粉末状酶制剂。
6.编码由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的耐高温蛋白酶的基因。
7.如权利要求6所述的编码基因，其特征在于：由SEQ ID NO:1的核苷酸序列组成的耐高温蛋白酶基因。
8.根据权利要求3所述的耐高温蛋白酶在酶解羽毛粉方面的应用。
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