KR101394009B1 - 액체국의 제조 방법 - Google Patents

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아사히비루 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명의 목적은 액체국을 위한 액체 배지의 조성을 최적화하여 높은 효소 활성을 갖는 액체국을 제조하는 방법을 제공하는 것이다. 특히, 본 발명은 표면의 전부 또는 일부가 곡피로 덮인 곡류를 배양 원료로서 사용하여 질소원을 함유하는 액체 배지에서 백국균 및/또는 흑국균을 배양하는 것을 포함하는, 증강된 효소 활성을 갖는 액체국의 제조 방법을 제공한다.
액체국, 액체 배지, 효소 활성, 곡류, 질소원

Description

액체국의 제조 방법{PROCESS FOR PRODUCTION OF LIQUID KOJI}
본 발명은 액체국의 제조 방법, 특히, 증강된 효소 활성을 갖는 액체국의 제조 방법에 관한 것이다.
알콜 음료의 제조에 사용되는 국(麴)에는, 익히는(cooking) 등의 처리 후의 원료에 사상균의 포자를 접종시켜 배양한 고체국, 및 원료 및 다른 영양원을 물에 첨가하여 액체 배지를 제조하고 이어서 국균(麴菌)의 포자 또는 전배양한(pre-cultured) 국균의 균사체 등을 접종하여 배양한 액체국이 있다.
알콜 음료 예를 들어, 일본주(sake), 소주(shochu), 간장, 된장, 미림(sweet sake) 등과 같은 발효 음식의 통상적인 제조에는, 고체 배양 방법으로 제조한 고체국이라고 불리는 것이 널리 사용된다. 고체 배양 방법은 국균, 예를 들어 아스페르길루스 가와치(Aspergillus kawachii), 아스페르길루스 아와모리(Aspergillus awamori), 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger), 아스페르길루스 오리자에(Aspergillus oryzae), 아스페르길루스 소야(Aspergillus sojae) 등의 포자를, 증자한(steam-cooked) 곡류와 같은 고체 원료에 분산시켜 국균을 고체 표면에서 증식시키는 배양 방법이다.
예를 들어, 소주의 제조에는, 아스페르길루스 가와치 및 아스페르길루스 아 와모리와 같은 고체국이 널리 사용된다. 그러나, 고체 배양 방법은 원료 및 국균이 불균일하게 분산되는 배양계(culture system)이기 때문에, 온도, 수분 함량, 및 다양한 영양 성분이라고 하는 인자(factor)를 균일하게 하는 것이 어렵고, 배양 조절 면에서 매우 복잡하다. 게다가, 국의 제조는 종종 개방상태에서 수행되어서, 잡균으로부터 오염되는 것을 막기 위한 품질 관리 면에서의 주의도 요구된다. 그러므로, 고체 배양 방법은 대규모 제조에는 적절하지 않다.
반대로, 액체 배양 방법은 배양 조절 및 품질 관리가 쉬워서, 효율적인 제조에 적합하다. 그러나, 예를 들어, 효소 활성이 소주를 양조하기에 불충분하다는 등의 이유 때문에, 액체 배양 국균에 의해 수득되는 배양물은 거의 소주국으로 사용하지 않는다. 액체 배양 방법에 의해 수득되는 배양물은 액체 배양 방법에 의해 수득된 배양물 그 자체(이하, 또한 "액체국"이라 지칭됨) 뿐 아니라 배양액, 균체, 및 그들의 농축물, 또는 그들의 건조물이어도 된다.
액체 배양 방법으로 수득된 배양물을 소주와 같은 발효 음식의 제조에 사용하지 않는 주요한 이유는, 상기-언급된 이유에 추가로, 액체 배양에서는 국균의 아밀라제 및 셀룰라제와 같은 효소 생산 거동이 고체 배양에서와 상당히 상이한 것으로 공지되어 있고, 생산성 또한 전반적으로 부족한 것으로 공지되어 있기 때문이다 (비-특허 문헌 1 및 2 참조).
소주와 같은 알콜 음료의 제조에서, 알콜은 일반적으로 동시에 일어나는 당화 및 발효에 의해 생성된다. 그러므로, 국균에 포도당을 공급하는데 영향을 주는 국균의 당질분해 관련 효소, 특히 당아밀라제(glucoamylase) 및 내산성 α-아 밀라제(acid stable α-amylase)는 알콜 발효에서 주요 효소(key enzyme)이다. 그러나, 액체 배양 방법으로 수득된 배양물에서 당아밀라제의 활성이 현저하게 낮고 생산 거동 또한 고체 배양에서의 그것과 상당히 상이하다는 것이 공지되어 있다 (비-특허 문헌 3 내지 6 참조).
국균의 당아밀라제 활성을 증가시키는 방법으로서, 균사체의 성장에 중점을 두면서 국균을 배양하는 방법 (특허 문헌 1 참조) 및 국균 배양액에 배초(焙炒)한 곡류를 첨가하는 방법 (특허 문헌 2 참조) 이 보고되었다. 특허 문헌 1 에 개시된 방법은 다공성 막 또는 공극을 갖는 포괄적인 고정화제에서 배양하여 당아밀라제를 인코딩하는 신규한 유전자 glaB 을 발현시켜, 효소 활성을 유도하는 것이다. 따라서, 상기 방법은 엄격한 관리 또는 특별한 배양 장치를 요구하기 때문에, 실용적이지 않다. 특허 문헌 2 에 개시된 방법은 적어도, 원료의 일부로서 배초한 곡류를 사용하는 액체 배지에 국균을 배양하는데, 상기 방법은 곡류를 배초하는 추가적인 생산 단계를 요구한다.
본 발명의 발명자는 국균이 거의 분해하지 않는 당류를 함유하는 액체 배지를 사용하여 국균을 배양하는 방법과 관련된 발명을 제공하였다 (특허 문헌 3 참조). 상기 발명에서의 국균을 액체 배양하는 것에 의해, 일본주와 같은 발효 음식을 생산하는데 사용될 수 있는, 당아밀라제와 같은 당 분해 효소의 활성이 높은 국균 배양물을 편리하고 저렴하게 수득할 수 있다.
한편으로는, 내산성 α-아밀라제에 대해서는 최근 분자 생물학적 분석이 상세하게 이루어지고 있다 (비-특허 문헌 7 참조). 상기 분석은 하기와 같이 보 고한다: 백국균(白麴菌)은 각각 2개의 상이한 특징, 즉, 비내산성 α-아밀라제 및 내산성 α-아밀라제라는 2개의 상이한 아밀라제 유전자를 갖는다. 각 유전자의 발현 양식은 서로 매우 상이하다. 액체 배양에서, 비내산성 α-아밀라제는 충분히 생산되는 반면, 소주를 양조하는데 주요한 효소인 내산성 α-아밀라제는 거의 생산되지 않는다.
소주 제조에서는, 소주 매시(shochu mash)가 부패(putrefaction)되는 것을 막기 위해 낮은 pH 환경에서 양조한다. 비내산성 아밀라제는 낮은 pH 조건 하에 즉시 불활성화되기 때문에 소주 양조 중 해당작용에 거의 기여하지 못한다. 그러므로, 액체 배양 국균에 의한, 소주 양조 중에 해당작용에 기여한다고 여겨지는, 내산성 α-아밀라제를 높은 수율로 생산하는 것이 소주 제조를 위해 필수 불가결하다.
액체 배양 국균에서 내산성 α-아밀라제의 생산 거동은 상세하게 조사 보고되었다. 그러나, 상기 방법은 펩톤 및 구연산 완충 용액을 함유하는 합성 배지를 사용하고, 100 시간 이상의 배양 시간을 요구하여서, 실제 소주 양조에 적용하기는 어려울 수 있다 (비-특허 문헌 8 내지 10 참조).
상기 기재된 바와 같이, 통상 내산성 α-아밀라제는 액체 배양에 의해 기본적으로 생산될 수 없는 효소이고, 따라서 내산성 α-아밀라제 활성이 높은 액체국은 개발되지 않았다.
특허 문헌 1: 일본 특허 공개 제 (평)11-225746 A 호
특허 문헌 2: 일본 특허 공개 제 2001-321154 A 호
특허 문헌 3: 일본 특허 공개 제 2003-265165 A 호
비-특허 문헌 1: Iwashita K. 등: Biosci. Biotechnol. Bioche., 62, 1938-1946(1998)
비-특허 문헌 2: Yuichi Yamane 등: 일본 양조협회지(Journal of the Brewing Society of Japan), 99, 84-92(2004)
비-특허 문헌 3: Hata Y 등: J. Ferment. Bioeng., 84, 532-537 (1997)
비-특허 문헌 4: Hata Y 등: 유전자(Gene), 207, 127-134(1998)
비-특허 문헌 5: Ishida H 등: J. Ferment. Bioeng., 86, 301-307 (1998)
비-특허 문헌 6: Ishida H 등: Curr. Genet., 37, 373-379 (2000)
비-특허 문헌 7: Nagamine K 등: Biosci. Biotechnol. Bioche, 67, 2194-2202 (2003)
비-특허 문헌 8: Sudo S 등: J. Ferment. Bioeng., 76, 105-110 (1993)
비-특허 문헌 9: Sudo S 등: J. Ferment. Bioeng., 77, 483-489 (1994)
비-특허 문헌 10: Shigetoshi Sudo 등: 일본 양조협회지(Journal of the Brewing Society of Japan), 89, 768-774 (1994)
본 발명이 해결해야 할 과제
본 발명의 발명자는 표면의 전부 또는 일부가 곡피(husks)로 덮인 곡류를 배양 원료로서 함유하는 액체 배지에서 국균을 배양하는 것에 의해 소주를 제조하는데 필요한 효소, 예를 들어 당아밀라제, 내산성 α-아밀라제의 활성을 충분히 갖는 액체국이 제조될 수 있다는 것을 발견하고, 이미 특허 출원을 제출하였다 (일본 특허 출원 번호 제 2004-350661 호 및 일본 특허 출원 번호 제 2004-352320 호 참조).
그러나, 상기 방법에서 당아밀라제 및 내산성 α-아밀라제를 제외한 효소의 생산 거동은 공지되지 않았다.
본 발명의 목적은 액체국에서 전분분해 효소(amylolytic enzyme), 예를 들어 당아밀라제 및 내산성 α-아밀라제, 및 기타 효소의 효소 활성을 증강시키는 방법을 개발하는 것이다. 특히, 본 발명의 목적은 액체 배지의 조성을 최적화하는 것에 의해 높은 효소 활성을 갖는 액체국을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
과제를 해결하기 위한 수단
액체국에서 보다 높은 효소의 생산을 달성하기 위해, 본 발명의 발명자는 상기-언급된 배양 원료 및 다양한 영양원의 조합 효과에 대해 폭넓은 연구를 하여, 액체 배지에 특정 질소원을 조합하고 추가로 질소원과 함께 하나 이상의 황산 및 인산을 존재시킴으로써 전분분해 효소인 당아밀라제, 섬유소분해 효소(cellulolytic enzyme)인 셀룰라제, 및 단백질분해 효소(proteolytic enzyme)인 산성 카르복시펩티다제의 생산성이 개선될 수 있다는 것을 알아내어, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 제 1의 측면에 의하면, 증강된 효소 활성을 갖는 액체국의 제조 방법이 제공되는데, 상기 방법은 표면의 전부 또는 일부가 곡피로 덮인 곡류를 배양 원료로서 사용하여 질소원을 함유하는 액체 배지에서 백국균 및/또는 흑국균(黑麴菌)을 배양하는 것을 포함한다.
본 발명의 제 2의 측면에 의하면, 제 1의 측면에 있어서, 질소원이 질산염을 포함하는, 증강된 효소 활성을 갖는 액체국의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 제 3의 측면에 의하면, 제 1의 측면에 있어서, 질소원이 효모균체 또는 그 처리물, 곡류곡피(cereal husks) 및 곡류겨(cereal bran)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상, 또는 상기의 것들 및 질산염의 혼합물을 포함하는, 증강된 효소 활성을 갖는 액체국의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 제 4의 측면에 의하면, 제 1의 측면에 있어서, 액체 배지가 질산염을 0.05 내지 2.0 % (w/vol) 의 농도로 함유하는, 증강된 효소 활성을 갖는 액체국의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 제 5의 측면에 의하면, 제 2의 측면에 있어서, 액체 배지가 추가로 인산염을 함유하는, 증강된 효소 활성을 갖는 액체국의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 제 6의 측면에 의하면, 제 5의 측면에 있어서, 액체 배지가 인산염을 0.05 내지 1.0 % (w/vol) 의 농도로 함유하는, 증강된 효소 활성을 갖는 액체국의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 제 7의 측면에 의하면, 제 5의 측면에 있어서, 액체 배지가 추가로 황산염을 함유하는, 증강된 효소 활성을 갖는 액체국의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 제 8의 측면에 의하면, 제 7의측면에 있어서, 액체 배지가 황산염을 0.01 내지 0.5 % (w/vol) 의 농도로 함유하는, 증강된 효소 활성을 갖는 액체국의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 제 9의 측면에 의하면, 제 1의 측면에 있어서, 효소가 전분분해 효소, 섬유소분해 효소 및 단백질분해 효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 포함하는, 증강된 효소 활성을 갖는 액체국의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 제 10의 측면에 의하면, 제 1의 측면에 있어서, 곡류가 쌀, 밀, 대맥(barley), 메밀(buckwheat), 피(barnyard millet), 조(foxtail millet), 기장(millet), 고량(kaoliang) 또는 옥수수를 포함하는, 증강된 효소 활성을 갖는 액체국의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 제 11의 측면에 의하면, 제 1 내지 제 10의 측면 중 어느 한 측면에 따른 방법에 의해 수득되는 액체국이 제공된다.
본 발명의 제 12의 측면에 의하면, 제 11의 측면에 따른 액체국을 사용하는 것을 포함하는, 효소 제제의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 제 13의 측면에 의하면, 제 12의 측면에 따른 제조 방법에 의해 수득되는 효소 제제가 제공된다.
본 발명의 제 14의 측면에 의하면, 배양 원료로서 표면의 전부 또는 일부가 곡피로 덮인 곡류 및 질소원을 함유하는 액체 배지에서, 백국균 및/또는 흑국균을 배양하여 효소를 제조하는 것을 포함하는, 효소의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 제 15의 측면에 의하면, 제 14의 측면에 있어서, 질소원이 질산염을 포함하는, 효소의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 제 16의 측면에 의하면, 제 14의 측면에 있어서, 질소원이 효모균체 또는 그 처리물, 곡류곡피 및 곡류겨로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상, 또는 상기의 것들 및 질산염의 혼합물을 포함하는, 효소의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 제 17의 측면에 의하면, 제 14의 측면에 있어서, 액체 배지가 질산염을 0.05 내지 2.0 % (w/vol) 의 농도로 함유하는, 효소의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 제 18의 측면에 의하면, 제 15의 측면에 있어서, 액체 배지가 인산염을 함유하는, 효소의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 제 19의 측면에 의하면, 제 18의 측면에 있어서, 액체 배지가 인산염을 0.05 내지 1.0 % (w/vol) 의 농도로 함유하는, 효소의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 제 20의 측면에 의하면, 제 18의 측면에 있어서, 액체 배지가 추가로 황산염을 함유하는, 효소의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 제 21의 측면에 의하면, 제 20의 측면에 있어서, 액체 배지가 황산염을 0.01 내지 0.5 % (w/vol) 의 농도로 함유하는, 효소의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 제 22의 측면에 의하면, 제 14의 측면에 있어서, 효소가 전분분해 효소, 섬유소분해 효소 및 단백질분해 효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 포함하는, 효소의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 제 23의 측면에 의하면, 제 14의 측면에 있어서, 곡류가 쌀, 밀, 대맥, 메밀, 피, 조, 기장, 고량 또는 옥수수를 포함하는, 효소의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 효과
본 발명에 따르면, 표면의 전부 또는 일부가 곡피로 덮인 곡류를 배양 원료로 함유하는 액체 배지에 질소원으로서 특정 유기물 및/또는 무기물을 첨가하고, 황산염 및 인산염을 추가로 첨가하며, 상기 액체 배지에서 국균을 배양하여 액체국에서 전분분해 효소의 생산성을 현저하게 향상시킬 뿐 아니라, 섬유소분해 효소 및 단백질분해 효소를 높은 수율로 생산한다. 추가로, 국균에 의해 생산되는 효소의 생산성은 상기-언급된 효소 이외의 효소에서도 일반적으로 향상된다.
본 발명에 따라 제조한 액체국을 사용하여 소주 같은 발효 음식을 생산할 때, 섬유소분해 효소의 높은 활성으로 인해 매시 점도가 감소하기 때문에 양호한 발효가 수행되고, 알콜 수율의 증가가 기대될 수 있다. 추가로, 단백질분해 효소의 높은 활성 덕분에 아미노산의 생산이 증가되어, 뛰어난 향을 가진 발효 음식이 제조될 수 있다.
추가로, 액체 배양은 고체 배양과 비교하여 엄격하게 관리할 수 있으므로, 안정적인 품질을 가진 액체국을 저가로 생산할 수 있다.
게다가, 본 발명에서 사용되는 곡류는 미정백, 또는 적어도 곡피가 표면에 남아 있는 정도까지 정백된 것이다. 따라서, 원료 이용율 및 수율에서의 향상이 기대될 수 있다.
도면의 간단한 설명
도 1은 질소원으로 질산 칼륨을 사용한 액체 배지로 배양하여 각각 수득한 배양물의 당아밀라제 및 내산성 α-아밀라제 활성을 보인다. 검은색 막대는 각각 당아밀라제 활성 (U/ml) 을 나타내고, 백색 막대는 각각 내산성 α-아밀라제 활성 (U/ml) 을 나타낸다.
도 2는 무기질소물 및 무기염을 사용한 액체 배지로 배양하여 각각 수득한 배양물의 당아밀라제 및 내산성 α-아밀라제 활성을 보인다. 검은색 막대는 각각 당아밀라제 활성 (U/ml) 을 나타내고, 백색 막대는 각각 내산성 α-아밀라제 활성 (U/ml) 을 나타낸다.
도 3은 질소원으로 효모균체 또는 효모 자기소화물을 사용한 액체 배지로 배양하여 각각 수득한 배양물의 당아밀라제 및 내산성 α-아밀라제 활성을 보인다. 검은색 막대는 각각 당아밀라제 활성 (U/ml) 을 나타내고, 백색 막대는 각각 내산성 α-아밀라제 활성 (U/ml) 을 나타낸다.
도 4는 무기질소물, 무기염, 및 효모균체의 조합을 사용한 액체 배지로 배양하여 각각 수득한 배양물의 당아밀라제 및 내산성 α-아밀라제 활성을 보인다. 검은색 막대는 각각 당아밀라제 활성 (U/ml) 을 나타내고, 백색 막대는 각각 내산성 α-아밀라제 활성 (U/ml) 을 나타낸다.
도 5는 질소원으로 대맥겨(barley bran), 효모균체 및 무기질소물의 조합을 사용한 액체 배지로 배양하여 각각 수득한 배양물의 당아밀라제 및 내산성 α-아밀라제 활성을 보인다. 검은색 막대는 각각 당아밀라제 활성 (U/ml) 을 나타내고, 백색 막대는 각각 내산성 α-아밀라제 활성 (U/ml) 을 나타낸다.
도 6은 질소원으로 대맥곡피(barley husks) 및 효모균체의 조합을 사용한 액체 배지로 배양하여 각각 수득한 배양물의 당아밀라제 및 내산성 α-아밀라제 활성을 보인다. 검은색 막대는 각각 당아밀라제 활성 (U/ml) 을 나타내고, 백색 막대는 각각 내산성 α-아밀라제 활성 (U/ml) 을 나타낸다.
도 7은 황산염, 질산염 및 인산염을 사용한 액체 배지로 배양하여 각각 수득한 국균 배양물의 다양한 효소 활성을 보인다. (A) 내지 (D) 는 각각 당아밀라제 (GA), 내산성 α-아밀라제 (ASAA), 셀룰라제 (CEL) 및 산성 카르복시펩티다제 (ACP) 의 활성 (U/ml) 을 보인다.
본 발명을 수행하기 위한 최상의 구현예
이하, 본 발명에 대해 구체적으로 설명한다.
본 발명에 따라 액체국을 제조하는 방법은, 곡류 및 질소원 등의 원료를 첨가하여 제조한 액체 배지에서 국균을 배양하여 증강된 효소 활성을 가진 액체국을 제조하는 단계를 포함한다.
보다 구체적으로, 본 발명에서, 배양 원료로 표면의 전부 또는 일부가 곡피로 덮인 곡류를 함유하는 액체 배지를 사용하여 국균을 배양하기 때문에, 곡류 중의 전분을 당화시키는데 시간이 걸리며, 배양계 안으로의 당의 방출 속도가 느려져서, 그로 인해 액체국의 효소 활성이 증강된다. 추가로, 액체 배지는 특정 영양원을 함유하기 때문에 국균에 의해 다양한 효소가 고생산된다.
본원에서, 국균에 의해 제조되는 효소의 예는, 반드시 이에 한정되는 것은 아니나, 전분분해 효소, 예를 들어 당아밀라제 및 α-아밀라제, 섬유소분해 효소, 예를 들어 셀룰라제 및 β-글루코시다제, 단백질분해 효소, 예를 들어 산성 카르복시펩티다제 및 산성 프로테아제를 포함한다.
본 발명에서, 배양 원료로 사용되는 곡류의 예는 대맥, 쌀, 밀, 메밀, 피, 조, 기장, 고량, 옥수수 등을 포함한다. 배양 원료의 각각은 표면의 전부 또는 일부가 곡피로 덮인 형태를 요구한다. 미정백물 또는 적어도 곡피가 낟알의 표면에 남아있는 정도까지 정백된 정맥 비율 이상의 것 등을 사용할 수 있고, 현미, 현맥 등을 또한 사용할 수 있다. 쌀의 경우에, 현미, 왕겨(chaffs)가 모두 남아 있는 쌀 및 부분적으로 남아 있는 쌀을 사용할 수 있다.
예를 들어, 곡류가 대맥일 때, 미정백의 정백 비율 100 % 의 것, 또는 미정백의 정백 비율을 100 % 로 하고, 미정백의 정백 비율로부터 대맥의 곡피 비율 (일반적으로 7 내지 8 %) 을 뺀 비율, 즉 약 92% 내지 93% 정도의 정백 비율 이상의 것을 사용할 수 있다.
본원에서, "정백 비율" 이라는 용어는 곡류을 정백한 후에 남아 있는 곡류의 분율을 의미한다. 예를 들어, "정백 비율 90%" 라는 용어는 곡류의 표면층 부분의 곡피 등을 10% 깎아내는 것을 의미한다. 추가로, 본 발명에서, "현맥" 이라는 용어는 미정백의 대맥으로부터 곡피가 낟알의 표면에 남아있는 정도까지 정백된 것까지, 즉 정백 비율 90% 이상의 것을 포함한다. 추가로, "곡피" 라는 용어는 곡류 입자의 표면을 덮는 바깥 부분을 나타낸다.
상기-언급된 배양 원료 중 하나를 단독으로 사용하거나, 또는 그들 중 둘 이상의 조합을 하기의 액체 배지를 제조하는데 사용한다. 즉, 배양 원료로서 곡류는 하기 기재되는 질소원과 조합으로 물과 혼합하여 액체 배지를 제조한다. 곡류의 배합 비는 국균의 배양 중에 효소, 예를 들어 당분해 효소, 섬유소분해 효소, 및 단백 분해 효소가 선택적으로 생성, 축적되는 범위로 조정한다.
예를 들어, 대맥이 배양 원료로 사용될 때, 물에 대해 현맥을 1 내지 20% (w/vol) 첨가한 액체 배지로 제조된다. 현맥으로서 미정백의 대맥을 사용하는 경우, 보다 바람직하게는, 8 내지 10% (w/vol) 첨가한 액체 배지로 조제된다. 배양 원료로서 현맥으로서 95%-정백된 대맥을 원료로 사용하는 경우, 보다 바람직하게는, 1 내지 4% (w/vol) 첨가한 액체 배지로 제조된다.
추가로, 왕겨가 제거된 현미를 배양 원료로 사용한다면, 물에 대해 현미를 1 내지 20% (w/vol) , 바람직하게는 5 내지 13% (w/vol), 보다 바람직하게는 8 내지 10% (w/vol) 를 첨가한 액체 배지로 제조된다.
기타 곡류가 사용될 때, 액체 배지는 1 내지 20% (w/vol) 의 곡류를 첨가하여 동일한 방식으로 제조된다.
이러한 방식에서, 최적의 배합 사용량은 사용하는 원료의 정백도, 사용하는 국균주, 원료의 종류 등에 의해 상이하기 때문에, 상기의 것들을 고려하여 적절하게 선택할 수 있다.
사용되는 배양 원료의 양이 상한치를 초과하면, 배양 배지의 점도가 올라가고, 국균을 호기 배양하기 위해 필요한 산소 또는 공기의 공급이 불충분해져, 배양 진행을 악화시키므로 바람직하지 않다. 반대로, 사용되는 원료의 양이 하한치를 만족시키지 못하면, 목적하는 효소가 고생산되지 않는다.
배양 원료에 포함된 전분은 배양 전에 호화(gelatinization)될 수 있다. 전분을 호화 하는 방법은 특별히 한정되지 않고, 증기법(steaming method) 및 배초법(roasting method)을 포함하는 통상적인 방법 중 어느 것에 따라 행할 수 있다. 후술하는 액체 배지를 살균하는 단계에서, 고온고압 살균에 의해 전분의 호화온도 이상으로 가열하는 경우에는, 상기 처리에 의해 전분의 호화도 동시에 행하여진다.
액체 배지에서는, 상기-언급된 배양 원료 외에 질소원으로서 유기물, 무기물 등을 포함한다. 이러한 질소원은 국균이 증식하여 목적하는 효소를 충분히 생산하는 한 특별히 한정되지 않는다. 유기물의 예는 효모균체 또는 그의 처리물 (예를 들어, 효모균체 분해물, 효모 액기스 등), 곡류곡피 및 곡류겨 등을 포함한다. 무기물의 예는 질산염을 포함한다.
질산염은 질산 칼륨, 질산 나트륨 등을 사용할 수 있고, 특히 질산 칼륨이 바람직하다.
질소원은 단독으로 또는 2 이상의 유기물 및/또는 무기물을 조합하여 사용할 수 있다.
질소원의 첨가량은 국균의 증식을 촉진하는 한 특별히 한정되지는 않지만, 유기물로 0.1 내지 2% (w/vol), 바람직하게는 0.5 내지 1.0% (w/vol) 이고, 무기 질로서 질산염의 첨가량은 0.05 내지 2.0% (w/vol), 바람직하게는 0.1 내지 2.0% (w/vol), 보다 바람직하게는 0.2 내지 1.5 % (w/vol) 이다.
상한치를 초과하는 질소원을 첨가하는 경우에는 국균의 증식을 방해하기 때문에 바람직하지 않다. 또한, 첨가량이 하한치 미만인 경우는, 효소 생산이 촉진되지 않기 때문에 바람직하지 않다.
본 발명에서 질소원의 한 종류로 사용되는 효모의 예는 양조 또는 음식의 제조 과정에서 사용되는 맥주 효모, 와인 효모, 위스키 효모, 소주 효모, 일본주 효모 및 빵 효모 외에 사카로미세스(Saccharomyces) 속, 칸디다(Candida) 속, 토룰롭시스(Torulopsis) 속, 한세니아스포라(Hanseniaspora) 속, 한세눌라(Hansenula) 속, 데바리오미세스(Debaryomyces) 속, 사카로미콥시스(Saccharomycopsis) 속, 사카로미코데스(Saccharomycodes) 속, 피치아(Pichia) 속, 파치솔렌(Pachysolen) 속 등의 효모균체이다.
효모의 균체 그 자체로 질소원으로 사용할 수 있고, 또한 효모균체 분해물 또는 효모 액기스의 형태로 사용할 수 있다. 효모균체 분해물 또는 효모 액기스는 효모균체를 예를 들어 자기소화법 (효모균체에 원래 존재하는 단백질분해 효소를 이용하여 세포를 가용화하는 방법), 효소분해법 (미생물 또는 식물 유래의 효소 제제 등을 첨가하여 가용화하는 방법), 열수추출법 (효모균체를 열수에 일정 시간 동안 가라앉혀서 가용화하는 방법), 산 또는 염기 분해법(다양한 산 또는 염기의 첨가로 가용화하는 방법), 물리적파쇄법(초음파 처리 및 고-압 균질화 방법, 또는 글라스비드와 같은 고체와 혼합하고 섞어서 파쇄하는 방법), 및 동결-해빙법(한번 이상의 동결 및 해빙으로 파쇄하는 방법)에 의해 수득할 수 있다.
추가로, 곡류를 정백할 때 얻어지는 부산물인 쌀겨와 같은 곡류겨를 질소원으로 사용할 수 있다. 곡류의 종자는 종피 부분, 배아 부분, 배젖 부분 및 이들을 보호하는 왕겨로 구성된다. 겨는 배아 및 종피 부분으로 구성된 부분이다.
추가로, 본 발명에서, 곡류의 종피 부분인 곡류곡피를 질소원으로 사용할 수 있고 통상은 배양 원료로 사용하는 곡류와 동일한 종류의 곡류곡피를 사용한다. 상기 곡류겨 및 곡류곡피는 기타 질소원과 조합으로 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 액체 배지에서, 황산염 및 인산염을 배양 원료 및 상기 기재된 질소원에 추가로 포함할 수 있다. 상기 무기염을 병용하는 것에 의해, 전분분해 효소, 섬유소분해 효소, 단백질분해 효소 등의 효소 활성을 증강시키는 것이 가능해진다.
황산염의 예는 황산 마그네슘 7수화물, 황산 철 7수화물 및 황산 암모늄을 포함하고, 황산 마그네슘 7수화물이 특히 바람직하다. 인산염의 예는 인산 2수소 칼륨 및 인산 암모늄을 포함하고, 인산 2수소 칼륨이 특히 바람직하다.
상기 무기염은 단독으로, 또는 둘 이상을 조합하여 사용할 수 있다.
추가로, 액체 배지에서 무기염의 농도는 국균의 배양물에서 효소 예를 들어, 전분분해 효소, 섬유소분해 효소, 및 단백질분해 효소가 선택적으로 생성,축적될 수 있는 범위로 조정된다. 예를 들어, 모든 값이 w/vol 인 조건에서, 황산염의 농도는 0.01 내지 0.5%, 바람직하게는 0.02 내지 0.1%, 및 인산염의 농도는 0.05 내지 1.0%, 바람직하게는 0.1 내지 0.5%이다.
상기-언급된 무기염은 단독으로, 또는 둘 이상을 조합하여 사용할 수 있다.
액체 배지에서, 상기-언급된 질소원 및 무기염 이외의 유기물 및 무기염도 영양원으로 선택적으로 첨가할 수 있다. 첨가물은 국균의 배양을 위해 일반적으로 사용되는 물질인 이상 특별히 한정되지 않는다. 유기물의 예는 밀기울(wheat bran), 농축발효 옥수수 침출물(corn steep liquor), 대두박(soybean cake) 및 탈지대두(defatted soybean)를 포함한다. 무기염의 예는 수용성 화합물, 예를 들어 암모늄염, 칼륨염, 칼슘염, 마그네슘염 등을 포함한다. 둘 이상의 유기물 및/또는 무기염을 동시에 사용할 수 있다.
이들의 첨가량은 국균의 증식을 촉진하는 정도라면 특별히 한정되지 않는다. 유기물의 첨가량은 바람직하게는 0.1 내지 5%(w/vol) 및 무기염의 첨가량은 바람직하게는 0.1 내지 1% (w/vol) 이다.
상한치를 초과하는 영양원을 첨가하는 경우에는, 국균의 성장이 방해받기 때문에 바람직하지 않다. 반대로, 첨가량이 하한치 미만인 경우에는, 효소 생산이 촉진되지 않기 때문에 바람직하지 않다.
상기-언급된 배양 원료 및 질소원을 물과 혼합하여 수득되는 국균의 액체 배지는 선택적으로 멸균 처리될 수 있고, 처리 방법은 특별히 제한되지 않는다. 상기 방법의 예는 고온고압 멸균법을 포함하고, 이 경우, 멸균은 121 ℃ 에서 15 분간 행할 수 있다.
멸균 액체 배지를 배양 온도까지 냉각하고 이어서 백국균 및/또는 흑국균을 액체 배지에 접종한다.
본 발명에서 사용하는 국균의 예는 바람직하게는 전분분해 효소 예를 들어 당분해효소, 내산성 α-아밀라제 및 α-아밀라제, 섬유소분해 효소 예를 들어 셀룰라제 및 β-당분해효소, 및 단백 분해 효소 예를 들어 산성 카르복시펩티다제 및 산성 프로테아제를 생산할 수 있는 국균을 포함한다. 국균의 특정 예는 아스페르길루스 가와치와 같은 백국균, 아스페르길루스 아와모리 및 아스페르길루스 니게르와 같은 흑국균을 포함한다.
배지에 접종하는 국균의 형태는 임의이고, 국균의 포자 또는 균사체도 사용할 수 있다.
상기 국균은 단일 균주에 의한 배양 또는 동종 또는 이종의 둘 이상의 균주에 의한 혼합 배양 어느쪽에도 사용할 수 있다. 포자 또는 전배양하여 수득된 균사체 형태를 사용하는 것이 허용될 수 있다. 그러나, 균사체를 사용하는 것이 대수증식기(logarithmic growth)에 필요로 하는 시간이 짧아지기 때문에 바람직하다.
액체 배지에 접종되는 국균의 양은 특별히 한정되지 않지만, 액체 배지의 1 ml 당 포자의 수는 약 1 x 104 내지 1 x 106 개 정도일 수 있다. 균사체의 경우는, 전배양액을 약 0.1 내지 10% 접종하는 것이 바람직하다.
국균의 배양 온도는 생육에 영향을 미치지 않는한 특별히 한정되지는 않지만, 바람직하게는 25 내지 45 ℃, 보다 바람직하게는 30 내지 40 ℃ 에서 행하는 것이 좋다. 배양 온도가 낮으면, 국균의 증식이 늦어지기 때문에 잡균에 의한 오염이 일어나기 쉬워진다. 따라서, 배양 시간은 24 내지 72 시간의 범위로 하는 것이 바람직하다.
배양 장치는 액체 배양을 행할 수 있는 것이면 된다. 국균은 호기배양되어야 한다. 따라서, 산소 또는 공기가 배지로 공급될 수 있는 호기적 조건 하에서 배양을 행하여야 한다. 추가로, 배양 중에는 배지를 교반시켜 원료, 산소, 및 국균이 장치 내에 균일하게 분포될 수 있도록 하는 것이 바람직하다. 교반 조건 및 통기량에 대해서는, 호기 배양 환경이 유지되는 한 어떤 조건이라도 되고 따라서 배양 장치, 배지의 점도 등에 따라 적절하게 선택할 수 있다.
상기 배양 방법에 따른 배양에 의해, 효소 예를 들어 전분분해 효소, 섬유소분해 효소, 및 단백질분해 효소 등을 고생산할 수 있다. 결과적으로, 소주 양조에 사용할 수 있는 효소 활성을 갖는 액체국이 수득된다.
본 발명에 따른 액체국은 배양물 그 자체뿐만 아니라 원심분리법 등에 의해 배양물로부터 수득되는 배양액, 그들의 농축물, 그들의 건조물을 포함한다.
상기 기재된 대로, 상기-언급된 배양 방법에 따르면, 효소 예를 들어 전분분해 효소, 섬유소분해 효소, 및 단백 분해 효소 등을 고생산할 수 있다.
그러므로, 본 발명의 제 14의 측면에 기재된 효소를 제조하는 방법은 상기 기재된 액체국을 제조하는 방법과 동일하다.
본 발명의 제조 방법에 의해 수득되는 액체국은 소주와 같은 발효 음식을 제조하는데 적절하게 사용될 수 있다. 예를 들어, 일본주의 제조의 경우, 효모 또는 매시 담금(preparing) 단계; 소주를 제조하는 경우, 매시 담금 단계; 간장을 제조하는 경우에, 담금(piling) 단계; 된장을 제조하는 경우에, 담금 단계; 미림을 제조하는 경우에, 담금 단계; 감주(amazake)를 제조하는 경우에, 담금 단계에 있어서 고체국 대신 액체국을 사용할 수 있다.
추가로, 수득되는 액체국의 일부는 다음의 액체국 제조를 위한 출발 물질로 사용할 수 있다. 이러한 방식으로 액체국을 연속 제조하는 것에 의해, 안정적인 생산이 가능한 동시에 생산 효율 또한 향상될 수 있다.
상기-언급된 액체국을 사용하여 소주와 같은 발효 음식을 제조하는 경우에는, 전체 공정을 액상에서 행할 수 있다. 전체 공정을 액상에서 행하는 발효 음식의 제조 방법으로는, 예를 들어, 소주를 제조하는 경우, 옥수수, 밀, 쌀, 감자, 사탕수수등을 원료로 사용하고, 상기 원료를 약 80 ℃ 에서 내열성 효소제를 사용하여 녹여 액화한 후, 상기 액체국 및 효모가 첨가함으로써 매시가 알콜발효되도록 하며, 이어서 상압 증류법 또는 감압 증류법에 의해 증류하여 제조하는 방법을 들 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 수득되는 액체국은 높은 효소 활성을 가져서, 효소 제제 및 소화제와 같은 의약품으로도 이용될 수 있다. 이러한 경우, 수득되는 국균의 배양물을 목적하는 범위로 농축, 정화하고 적절한 부형제, 증점제, 감미료 등을 첨가하여 제형화할 수 있다.
추가로, 국균의 전분분해 효소 등의 유전자 중 촉진자(promoter) 영역을 이용하는 것에 의해, 국균 배양물 중에서 목적하는 이종단백질을 고생산 하는 것이 가능할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 등과 관련하여 보다 구체적으로 설명하겠지만, 본 발명은 이러한 실시예 등에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
액체국의 제조에서 무기질소원의 첨가
무기질소원으로서 질산 칼륨이 액체 배지에 첨가될 때의 효과가 하기에 기재된 바와 같이 조사되었다.
우선, 무첨가 (대조군), 0.2% (w/vol) 및 0.4% (w/vol) 의 질산 칼륨을 첨가한 물에, 현맥의 양이 2% (w/vol) 가 되도록 현맥을 첨가한 세가지 유형의 액체 배지를 제조하였다.
각 액체 배지 100 ml 를 용량 500 ml 의 배플 부착 삼각 플라스크(baffled conical flask)에 넣고, 오토클레이브(autoclave) 멸균 후, 액체 배지에서 전 배양시킨 백국균 (아스페르길루스 가와치 IFO4308) 을 액체 배지에 대해 1% (v/vol) 이 되도록 접종하였다. 현맥은, 95% 정백된 호주산 스털링 대맥을 사용하였다 (이하의 실시예에서도 기본적으로 동일하다).
이어서, 온도 37 ℃ 에서 진탕 속도(shaking speed) 100 rpm 으로 48시간 동안 배양하였다. 배양 종료 후, 얻어지는 각각의 배양물에서 당아밀라제 및 내산성 α-아밀라제 활성을 측정하였다. 표 1 및 도 1에는 질산 칼륨의 사용량별 액체 배지에서 배양된 국균으로부터 수득되는 배양물의 당아밀라제 및 내산성 α-아밀라제 활성을 나타냈다.
당아밀라제의 효소 활성을 측정하기 위해, 당화력 분별 정량 키트 (saccharification power fractional quantification kit) (긱코만제) 를 사용하였 다. 내산성 α-아밀라제의 효소 활성을 측정하기 위해, "Nagamine K 등: Biosci. Biltechnol. Biochem, 67, 2194-2202 (2003)" 에 기재된 방법을 약간 변형하였다. 즉, 비내산성 α-아밀라제를 산으로 처리하여 불활성화시킨 후, 이어서 내산성 α-아밀라제의 활성을 α-아밀라제 측정 키트 (긱코만제)로 측정하는 것이다. 보다 구체적으로, 배양액 1 ml 에 100mM 아세트산 완충액 (pH 3) 9 ml 를 첨가하고 37 ℃ 에서 한시간 동안 산처리 한 후에, α-아밀라제 측정 키트 (긱코만제)로 측정하였다.
표 1 및 도 1 에 보이는 바와 같이, 무첨가된 대조구(control plot)와 비교할 때, 무기질소원으로서 질산 칼륨을 첨가하여 배양한 액체 배지인 0.2% 첨가도 및 0.4% 첨가도 모두에서 당아밀라제 및 내산성 α-아밀라제 효소의 활성이 현저하게 향상되고, 당아밀라제 및 내산성 α-아밀라제 사이의 균형 또한 양호하였다.
[표 1]

 KNO3 첨가량 (w/vol)
 효소 활성 (U/ml)
당아밀라제(GA) 내산성 α-아밀라제 (ASAA)
1번(대조군) 무첨가 32.6 2.5
2번 0.20% 124.3 8.7
3번 0.40% 137.9 7.9
실시예 2
액체국 제조에서 복수의 무기물의 첨가
복수의 무기물을 첨가할 때의 효과가 하기에 기재된 바와 같이 조사되었다.
무기질소원으로서 질산 칼륨 또는 질산 나트륨, 및 무기염으로서 인산 2수소 칼륨을 표 2에 보이는 조성으로 물에 첨가하였다. 질산 나트륨의 첨가량은 질산 칼륨 2.0% 에 상당하는 몰농도인 20 mM 로부터 산출하고, 질산 이온 농도가 동 일해지도록 1.7% 을 배합하였다. 무기질소원 또는 무기염이 첨가되지 않은 물을 대조군으로 사용하였다.
상기 기재와 같이 제조한 원료수에 배양 원료로서 현맥을 2% (w/vol) 의 농도로 첨가하여, 네가지 유형의 액체 배지를 제조하였다. 실시예 1과 동일한 조건에서 백국균의 액체 배양을 행하였다. 그 이후, 당아밀라제 활성 및 내산성 α-아밀라제 활성을 실시예 1에서와 동일한 방법으로 결정하였다. 표 2 및 도 2에 그 결과를 나타내었다.
[표 2]

 배지 (2%-현맥 배지) 효소 활성 (U/ml)
무기질소원 (w/vol) 무기염 (w/vol) 당아밀라제(GA) 내산성 α-아밀라제 (ASAA)
1번(대조군) - - 32.6 2.5
2번 0.20% KNO3 0.27% KH2PO4 143.6 8.8
3번 0.17% NaNO3 0.27% KH2PO4 125.6 7.7
표 2 및 도 2 에서 보이는 바와 같이, 무첨가의 대조구와 비교할 때, 무기질소원 및 무기염을 첨가한 플롯에서 당아밀라제 및 내산성 α-아밀라제의 효소 활성이 향상되었다.
실시예 3
액체국의 제조에서 효모균체 또는 효모 자기소화물의 첨가
효모균체 또는 효모 자기소화물 (즉, 효모 액기스)을 첨가한 액체 배지를 사용하여 액체국을 제조하였다.
(1) 첨가하는 효모균체 또는 효모 자기소화물의 제조
맥주 양조 공정으로부터 회수된 맥주 효모를, 이하의 조건에서 처리하여, 액 체국 제조에 사용하는 맥주 효모균체 및 효모 자기소화물 (1) 및 (2) 를 수득하였다.
효모균체: 맥주 효모를 5,000 x g, 15 분간의 원심분리에 의해 수분함량 약70% 정도까지 탈수시켜 얻은 맥주 효모균체.
효모 자기소화물 (1): 맥주 효모균체를 등량의 물에 현탁한 후, 52 ℃ 에서 18시간 동안 혼합물을 처리하여 수득한 효모 자기소화물.
효모 자기소화물 (2): 맥주 효모균체를 등량의 젖산에 현탁한 후, 52 ℃ 에서 18시간 동안 혼합물을 처리하여 수득한 효모 자기소화물.
(2) 효모를 첨가한 액체 배지를 사용한 액체국의 제조
상기 기재한 바 대로 제조한 효모균체 및 효모 자기소화물 (1) 및 (2) 를 각각 0.20%, 0.50% 및 1% (v/vol) 이 되도록 물에 첨가하여 원료수를 제조하였다. 각 원료수에 배양 원료로서 현맥을 2% (w/vol) 의 농도로 첨가하여, 액체 배지를 제조하였다. 실시예 1과 동일한 조건에서 백국균의 액체 배양을 행하였다. 그 이후, 당아밀라제 활성 및 내산성 α-아밀라제 활성을 실시예 1에서와 동일한 방법으로 결정하였다.
대조군으로서, 현맥만을 2% 농도 (w/vol)로 물에 첨가하여 액체 배지 (즉, 플롯 1) 을 제조하고, 이어서 백국균을 실시예 1과 동일한 방식으로 접종하여 액체 배양을 행하였다. 얻어진 액체국의 당아밀라제 활성 및 내산성 α-아밀라제 활성을 실시예 1에서와 동일한 방법으로 결정하였다. 표 3 및 도 3 에 그 결과를 나타냈다.
[표 3]

 배지 (2%-현맥 배지) 효소 활성 (U/ml)
효모균체* 효모 자기소화물(1)* 효모 자기소화물(2)* 당아밀라제 (GA) 내산성 α-아밀라제 (ASAA)
1번 - - - 16.3 1.0
2번 0.2% - - 29.2 2.1
3번 0.5% - - 48.2 2.1
4번 1.0% - - 74.9 9.2
5번 - 0.2% - 35.3 2.5
6번 - 0.5% - 56.6 3.1
7번 - 1.0% - 110.0 9.6
8번 - - 0.2% 23.7 1.8
9번 - - 0.5% 59.1 5.2
10번 - - 1.0% 68.0 10.3
*: 단위는 v/vol 이다.
(3) 결과
표 3 및 도 3에 보이는 바와 같이, 무첨가된 대조구 (즉, 플롯 1) 과 비교하여 효모균체 자체를 첨가한 모든 시험구 및 효모 자기소화물을 첨가한 모든 시험구에서 당아밀라제 활성 및 내산성 α-아밀라제 활성 모두가 향상되었다. 특히, 시험구 7은 양호한 결과를 보였다. 추가로, 모든 시험구에서, 효모균체 또는 효모 자기소화물의 첨가량에 비례하여 당아밀라제 활성 및 내산성 α-아밀라제 활성이 향상되었다.
실시예 4
무기질소원 및/또는 무기염과 효모균체 조합의 첨가
질산 칼륨, 인산 2수소 칼륨, 및 효모균체를 표 4에 보이는 방식으로 조합하고 물에 첨가하여 원료수를 제조하였다. 사용한 효모균체는 맥주 양조 공정에서 회수된 맥주 효모를 원심분리에 의해 수분함량 약 70% 정도까지 탈수시켜 얻은 맥주 효모균체 그 자체 (즉, 실시예 3에서 제조한 효모균체)였다. 대조군으로 (즉, 플롯 1), 무첨가의 원료수를 사용하였다.
표 4에 보이는 조합으로 제조된 원료수에 배양 원료로서 현맥을 2% (w/vol) 의 농도로 첨가하였다. 실시예 1과 동일한 방식으로 백국균을 액체 배지에 접종하였다. 상기 액체 배지에서 당아밀라제 활성 및 내산성 α-아밀라제 활성을 각각 결정하였다. 표 4 및 도 4 에 그 결과를 나타냈다.
[표 4]

 배지 (2%-현맥 배지) 효소 활성 (U/ml)
KNO3 (w/vol) KH2PO4 (w/vol) 효모균체 (v/vol) 당아밀라제 (GA) 내산성 α-아밀라제 (ASAA)
1번(대조군) - - - 32.6 0.8
2번 0.05% - - 52.9 3.8
3번 0.10% - - 91.7 4.6
4번 0.20% - - 114.0 5.6
5번 0.40% - - 137.9 6.9
6번 - - 0.20% 40.8 2.4
7번 0.05% - 0.20% 60.3 3.7
8번 0.10% - 0.20% 101.4 5.4
9번 0.20% - 0.20% 103.6 6.4
10번 0.40% - 0.20% 139.9 8.6
11번 - - 0.50% 44.5 3.7
12번 0.05% - 0.50% 94.4 6.5
13번 0.10% - 0.50% 94.9 6.9
14번 0.20% - 0.50% 135.7 8.3
15번 0.40% - 0.50% 154.0 10.4
16번 0.20% 0.30% - 139.9 10.5
17번 0.20% 0.30% 0.20% 160.7 11.6
18번 0.20% 0.30% 0.50% 178.5 12.3
표 4 및 도 4에 보이는 바와 같이, 무첨가된 대조구 (즉, 플롯 1) 과 비교하여 모든 시험구에서 당아밀라제 활성 및 내산성 α-아밀라제 활성 모두가 극히 높았다. 특히, 시험구 15 내지 18 에서 두 효소 활성 모두가 극히 높았다. 상기 결과로부터, 무기질소원 및/또는 무기염과 효모균체와의 조합 사용에 의해 액 제 배지의 영양 균형이 개선되고, 사상균에 의한 효소 생산이 활발하게 행해지는 것으로 여겨진다.
실시예 5
대맥겨, 효모균체, 및 무기물의 조합
대맥겨 및 효모균체, 질산 칼륨 및 인산 2수소 칼륨을 표 5에 보이는 방식으로 조합하고, 물에 첨가하여 액체 배지를 위한 원료수를 제조하였다. 사용된 대맥겨는 도정 공정으로부터 회수된 70% 정백된 대맥 (스털링, 호주산) 이고, 대맥곡피 및 겨를 함유한다. 사용된 효모균체는 맥주 양조 공정에서 회수된 맥주 효모를 원심분리에 의해 수분함량 약 70% 정도까지 탈수시켜 얻은 맥주 효모균체 그 자체 (즉, 실시예 3에서 제조한 효모균체)이다. 대조군으로, 무첨가의 원료수를 사용하였다.
표 5의 조합으로 제조된 원료수에 현맥을 2% (w/vol) 의 농도로 첨가하였다. 실시예 1과 동일한 방식으로 백국균을 액체 배지에 접종하여 액체 배양을 행하였다. 상기 액체 배지에서 당아밀라제 활성 및 내산성 α-아밀라제 활성을 동일한 방식으로 각각 결정하였다. 표 5 및 도 5 에 그 결과를 나타냈다.
[표 5]

 배지 (2%-현맥 배지) 효소 활성 (U/ml)
무기 화합물 대맥겨 (w/vol) 효모균체 (v/vol) 당아밀라제 (GA) 내산성 α-아밀라제 (ASAA)
1번(대조군) - - - 25.7 0.9
2번 - 0.1% 0.1% 43.5 2.9
3번 - 0.5% 0.5% 54.6 3.9
4번 - 1.0% 1.0% 111.0 13.6
5번 - 2.0% 2.0% 50.9 8.5
6번 - 1.0% - 77.6 8.9
7번 - - 1.0% 92.3 9.5
8번 ○ 1.0% - 106.0 10.3
9번 ○ - 1.0% 318.6 15.5
○: 0.2% (w/vol) 의 질산 칼륨 및 0.3% (w/vol) 의 인산 2수소 칼륨이 첨가된 시험구.
표 5 및 도 5에 보이는 바와 같이, 무첨가된 대조구 (즉, 플롯 1) 과 비교하여 모든 시험구에서 당아밀라제 활성 및 내산성 α-아밀라제 활성 모두가 극히 높았다. 특히, 시험구 4 에서 두 효소 활성 모두가 극히 높았고, 균형도 양호했다. 상기 결과로부터, 대맥겨와 효모균체와의 조합 사용에 의해 액체 배지의 영양 균형이 개선되고, 사상균에 의한 효소 생산이 활발하게 행해지는 것으로 여겨진다.
대맥겨 또는 효모균체와 무기질소원 및 무기염의 병용 (즉, 플롯 8 및 9) 이 양호한 결과를 보였다.
실시예 6
대맥곡피 및 효모균체의 조합 첨가
질산 칼륨, 인산 2수소 칼륨, 대맥곡피, 및 효모균체를 표 6에 보이는 방식으로 조합하고, 원수에 첨가하여 액체 배지를 위한 원료수를 제조하였다. 사용된 대맥곡피는 70% 정백 대맥의 도정 공정으로부터 회수된 대맥겨를 2 mm-그물체에 통과시켜, 대맥곡피만 회수한 것이다. 추가로, 사용된 압착효모는 맥주 양조 공정에서 회수된 맥주 효모를 원심분리에 의해 수분함량 약 70% 정도까지 탈수시켜 얻은 맥주 효모균체 그 자체 (즉, 실시예 3에서 제조한 효모균체)이다. 대조군으로, 무첨가의 원수 (즉, 플롯 1)를 사용하였다.
표 6에 보이는 조합으로 제조한 원료수에 현맥을 2% (w/vol) 의 농도로 첨가하였다. 실시예 1과 동일한 방식으로 백국균을 액체 배지에 접종하여 액체 배양을 행하였다. 상기 액체 배지에서 당아밀라제 활성 및 내산성 α-아밀라제 활성을 각각 결정하였다. 표 6 및 도 6 에 그 결과를 나타냈다.
[표 6]

 배지 (2%-현맥 배지) 효소 활성 (U/ml)
효모균체 (v/vol) 대맥곡피 (w/vol) 당아밀라제 (GA) 내산성 α-아밀라제 (ASAA)
1번(대조군) - - 33.9 0.8
2번 - 0.1% 65.3 5.5
3번 - 0.5% 55.2 6.3
4번 - 1.0% 48.5 6.9
5번 - 2.0% 44.3 4.6
6번 1.0% 0.1% 94.4 9.9
7번 1.0% 0.5% 79.8 9.4
8번 1.0% 1.0% 85.8 11.0
9번 1.0% 2.0% 82.3 7.1
표 6 및 도 6에 보이는 바와 같이, 무첨가된 대조구 (즉, 플롯 1) 과 비교하여 모든 시험구에서 당아밀라제 활성 및 내산성 α-아밀라제 활성 모두가 극히 높았다. 특히, 시험구 6 내지 9 에서, 두 효소 활성 모두가 극히 높았고, 균형도 양호하였다. 상기 결과로부터, 대맥곡피와 효모균체와의 병용에 의해 액체 배지의 영양 균형이 개선되고, 사상균에 의한 효소 생산이 활발하게 행해지는 것으로 여겨진다.
실시예 7
액체국의 제조에 있어서 황산염의 첨가 효과
이하에 기재된 방법에 의해 액체국을 제조하고 그의 효소 활성을 측정하였다.
1. 전배양방법
65% 정백맥 (스털링, 호주산) 8g 및 100ml 물을 500ml 배플 부착 삼각 플라스크에 채우고 121 ℃에서 15분간 오토클레이브 멸균하였다. 냉각 후, 전배양 배지에 백국균 (아스페르길루스 가와치 NBRC4308) 을 1x106/ml 로 접종하고 37 ℃ 에서 진탕 속도 100 rpm 으로 24시간 동안 배양하였다. 상기 배지를 전배양 배지로 정의한다.
2. 본배양 방법
다섯 개의 시험구로서 2.0% (w/vol) 의 98% 정백맥 (현맥, 스털링, 호주산), 0.2% (w/vol) 질산 칼륨, 0.3% (w/vol) 인산 2수소 칼륨, 0.1% (w/vol) 황산 마그네슘 7수화물, 및 0.082% (w/vol) 염화 마그네슘 6수화물을 표 7에 보이는 조성비로 각각 함유하는 100 ml 의 액체 배지를 제조하였다. 상기 다섯개의 액체 배지를 각각 500 ml 배플 부착 삼각 플라스크에 채우고 121 ℃에서 15분간 오토클레이브 멸균하였다.
냉각 후, 1ml 의 전배양 액체를 배양 배지에 접종하고, 전체를 37 ℃ 에서 진탕 속도 100 rpm 으로 48시간 동안 배양하였다. 염화 마그네슘 6수화물의 첨 가량은 상응하는 0.1% 황산 마그네슘 7수화물의 몰 농도, 즉 8.12 mM 로부터 산출하여 각각의 시험구의 배지 중 마그네슘 농도가 동일해지도록 배합하였다.
[표 7]
배지 조성
시험구 1 2%-현맥 0.2% KNO3 0.3% KH2PO4 - -
시험구 2 2%-현맥 0.2% KNO3 0.3% KH2PO4 0.1% MgSO4·7H2O -
시험구 3 2%-현맥 0.2% KNO3 0.3% KH2PO4 - 0.082% MgCl2·6H2O
시험구 4 2%-현맥 - 0.3% KH2PO4 0.1% MgSO4·7H2O -
시험구 5 2%-현맥 0.2% KNO3 - 0.1% MgSO4·7H2O -
3. 효소 활성의 측정 방법
배양 종료 후, 당 분해 효소인 당아밀라제 (GA) 및 내산성 α-아밀라제 (ASAA) 활성을 측정하였다.
당아밀라제 (GA) 활성은 당화력 분별 정량 키트 (긱코만제)를 사용하여 측정하였다.
내산성 α-아밀라제 (ASAA) 활성 측정을 위해, Sudo S 등: J. Ferment. Bioeng., 76, 105-110 (1993), Sudo S 등: J. Ferment. Bioeng., 77, 483-489 (1994), 및 Shigetoshi Sudo 등: 일본 양조협회지(Journal of the Brewing Society of Japan), 89, 768-774 (1994)에 기재된 방법을 약간 변형하였다. 즉, 산으로 배양물을 처리하여 비내산성 α-아밀라제를 불활성화시킨 후, 이어서 내산성 α-아밀라제의 활성을 α-아밀라제 측정 키트 (긱코만제)로 측정하는 것이다. 보다 구체적으로, 배양액 1 ml 에 100mM 아세트산 완충액 (pH 3) 9 ml 를 첨가하고 37 ℃ 에서 한시간 동안 산처리 한 후에, α-아밀라제 측정 키트 (긱코만제)로 측정하였다.
동시에, 섬유소분해 효소인 셀룰라제 (CEL)의 활성 및 단백질분해 효소 중 하나인 산성 카르복시펩티다제의 활성을 측정하였다.
셀룰라제 (CEL) 활성은 카르복시메틸 셀룰로오스 (CMC) 를 기질로서 가수분해하여 생성되는 환원 당량을, 디니트로살리실산 (dinitrosalicylic acid) (DNS) 법에 의해 정량하는 방법으로 측정하였다. 보다 구체적으로, 1% CMC 기질용액 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)사의 상품명 low viscosity 를 100mM 아세트산 완충용액 (pH 5) 에 용해시킴) 1ml 에 배양액 1 ml 을 첨가하고, 40 ℃ 에서 정확히 10 분간 효소반응을 시켰다. 그 이후, 0.75% 디니트로살리실산, 1.2% 수산화 나트륨, 22.5% 주석산 칼륨 나트륨 4수화물 및 0.3% 젖당 1수화물을 함유하는 4ml 의 DNS시약을 첨가하여 잘 혼합하고, 반응을 종료하였다. 반응정지액에 함유된 환원 당량을 정량하기 위해, 반응정지액을 중탕기에서 정확히 15 분간 가열하였다. 계속하여, 실온까지 냉각시킨 후, 540nm 의 흡광도를 측정하는 것으로 포도당에 상응하는 환원 당량을 정량하였다. 1 단위 셀룰라제 (CEL) 활성은, 1 분간 1 μ몰의 포도당에 상응하는 환원당을 생성하는 효소량으로 나타내었다.
산성 카르복시펩티다제 (ACP) 활성은 산성 카르복시펩티다제 측정 키트 (긱코만제) 를 사용하여 측정하였다.
도 7 에 측정 결과를 나타냈다.
4. 결과
도 7A 에 보이는 바와 같이, 황산 마그네슘이 첨가된 시험구 2에서 당아밀라제 활성이 현저하게 향상되었다. 추가로, 도 7C 및 7D 에서 보이는 바와 같이, 황산 마그네슘이 첨가된 시험구 2에서 셀룰라제 및 산성 카르복시펩티다제의 활성이 현저하게 향상되었다. 이에 반해서, 동일한 종류의 마그네슘염인 염화 마그네슘이 첨가된 시험구 3에서는 활성이 개선되지 않았고, 이것은 효소 생산성 증대 효과의 주 이유가 황산라디칼에 있다는 것을 시사한다.
추가로, 황산 마그네슘은 첨가되었지만, 질산 칼륨 또는 인산 2수소 칼륨은 첨가되지 않은 시험구 4 및 5에서는, 효소생산성 증대 효과가 확인되지 않았다. 따라서, 질산염, 인산염 및 황산염이 함께 혼입될 때 효소 생산성이 현저히 향상된다는 것을 알 수 있다.
상기 기재된 바와 같이, 표면이 곡피로 덮인 곡류 (즉, 현맥) 과, 질산염, 인산염 및 황산염을 첨가한 액체 배지를 사용하여 국균을 배양할 때, 당아밀라제 및 내산성 α-아밀라제와 같은 소주 등을 제조하는데 필요한 효소들에 더하여, 섬유소분해 효소인 셀룰라제 및 단백질분해 효소인 산성 카르복시펩티다제를 높은 수율로 함유하는 액체국을 제조할 수 있다.
섬유소분해 효소의 높은 수율 때문에, 소주 제조에 있어서 매시 점도의 저하 또는 알콜 수율의 증대가 기대될 수 있고, 단백질분해 효소의 높은 수율 때문에 소주 매시 중 아미노산 성분이 증가되어, 뛰어난 향을 가진 소주도 생산될 수 있다.
추가로, 본 발명의 방법에 의해, 금회 측정된 효소 이외의 국균에 의해 생산되는 효소, 예를 들어 전분분해 효소들, 섬유소분해 효소들, 및 단백질분해 효소들 이 전반적으로 고생산될 수 있다고 기대된다.
본 발명에 따르면, 액체국에서 전분분해 효소의 생산성을 현저하게 향상시키는 것이 가능할 뿐 아니라, 섬유소분해 효소 및 단백질분해 효소를 높은 수율로 함유하는 액체국을 제조하는 것도 가능하다. 추가로, 액체 배양은 고체 배양과 비교하여 엄격하게 관리할 수 있으므로, 안정적인 품질을 가진 액체국을 저가로 생산할 수 있다.
본 발명에 따라 제조된 액체국을 소주 등 발효 음식의 제조에 사용함으로써, 알콜 수율 및 아미노산 생산량이 증가할 수 있고, 그로 인해 뛰어난 향을 가진 발효 음식을 효율적으로 생산할 수 있다.
게다가, 본 발명에서 사용되는 곡류는 미정백, 또는 적어도 곡피가 표면에 남아 있는 상태의 정도까지 정백된 것이다. 따라서, 원료 이용률 및 수율에서의 향상이 기대될 수 있다.

Claims (23)

  1. 표면의 전부 또는 일부가 곡피로 덮인 곡류를 배양 원료로서 사용하여, 질소원을 함유하는 액체 배지에서 백국균 및/또는 흑국균을 배양하는 것을 포함하는, 증강된 효소 활성을 갖는 액체국의 제조 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 질소원이 질산 칼륨 및 질산 나트륨으로부터 선택되는 1 종 또는 2 종인 것을 특징으로 하는, 증강된 효소 활성을 갖는 액체국의 제조 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 질소원이 효모균체 또는 그 처리물, 곡류곡피 및 곡류겨로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상, 또는 상기의 것들 및 질산 칼륨 및 질산 나트륨으로부터 선택되는 1 종 또는 2 종의 혼합물인 것을 특징으로 하는, 증강된 효소 활성을 갖는 액체국의 제조 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 액체 배지가 질산 칼륨 및 질산 나트륨으로부터 선택되는 1 종 또는 2 종을 0.05 내지 2.0 % (w/vol) 의 농도로 함유하는, 증강된 효소 활성을 갖는 액체국의 제조 방법.
  5. 제 2 항에 있어서, 액체 배지가 추가로 인산 2수소 칼륨 및 인산 암모늄으로부터 선택되는 1 종 또는 2 종을 함유하는 것을 특징으로 하는, 증강된 효소 활성을 갖는 액체국의 제조 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 액체 배지가 인산 2수소 칼륨 및 인산 암모늄으로부터 선택되는 1 종 또는 2 종을 0.05 내지 1.0 % (w/vol) 의 농도로 함유하는, 증강된 효소 활성을 갖는 액체국의 제조 방법.
  7. 제 5 항에 있어서, 액체 배지가 추가로 황산 마그네슘 7수화물, 황산 철 7수화물 및 황산 암모늄으로부터 선택되는 1 종 내지 3 종을 함유하는 것을 특징으로 하는, 증강된 효소 활성을 갖는 액체국의 제조 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 액체 배지가 황산 마그네슘 7수화물, 황산 철 7수화물 및 황산 암모늄으로부터 선택되는 1 종 내지 3 종을 0.01 내지 0.5 % (w/vol) 의 농도로 함유하는, 증강된 효소 활성을 갖는 액체국의 제조 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 효소가 전분분해 효소, 섬유소분해 효소 및 단백질분해 효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 포함하는, 증강된 효소 활성을 갖는 액체국의 제조 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 곡류가 쌀, 밀, 대맥, 메밀, 피, 조, 기장, 고량 또는 옥수수를 포함하는, 증강된 효소 활성을 갖는 액체국의 제조 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득되는 액체국.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 배양 원료로서 표면의 전부 또는 일부가 곡피로 덮인 곡류 및 질소원을 함유하는 액체 배지에서, 백국균 및/또는 흑국균을 배양하여 효소를 제조하는 것을 포함하는, 효소의 제조 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 질소원이 질산염을 포함하는, 효소의 제조 방법.
  16. 제 14 항에 있어서, 질소원이 효모균체 또는 그의 처리물, 곡류곡피 및 곡류겨로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상, 또는 상기의 것들 및 질산염의 혼합물을 포함하는, 효소의 제조 방법.
  17. 제 14 항에 있어서, 액체 배지가 질산염을 0.05 내지 2.0 % (w/vol) 의 농도로 함유하는, 효소의 제조 방법.
  18. 제 15 항에 있어서, 액체 배지가 인산염을 함유하는, 효소의 제조 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 액체 배지가 인산염을 0.05 내지 1.0 % (w/vol) 의 농도로 함유하는, 효소의 제조 방법.
  20. 제 18 항에 있어서, 액체 배지가 추가로 황산염을 함유하는, 효소의 제조 방 법.
  21. 제 20 항에 있어서, 액체 배지가 황산염을 0.01 내지 0.5 % (w/vol) 의 농도로 함유하는, 효소의 제조 방법.
  22. 제 14 항에 있어서, 효소가 전분분해 효소, 섬유소분해 효소 및 단백질분해 효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 포함하는, 효소의 제조 방법.
  23. 제 14 항에 있어서, 곡류가 쌀, 밀, 대맥, 메밀, 피, 조, 기장, 고량 또는 옥수수를 포함하는, 효소의 제조 방법.
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