KR100449170B1

KR100449170B1 - 셀룰라아제(Cellulase)와 자일란아제(xylanase)를 생산하는 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) KK2 균주와 이에 의해 제조된 효소 및 고체 배양물

Info

Publication number: KR100449170B1
Application number: KR10-2002-0003340A
Authority: KR
Inventors: 김승욱; 홍석인; 강성우; 박양순
Original assignee: 학교법인고려중앙학원
Priority date: 2002-01-21
Filing date: 2002-01-21
Publication date: 2004-09-16
Also published as: KR20030062884A

Abstract

본 발명은 셀룰라아제(cellulase)와 자일란아제(xylanase)를 생산하는 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) KK2 균주와 이 균주에 의해 효소 및 고체배양물을 제조하는 방법에 관한 것으로 돌연변이를 통해 고 농도, 고 역가를 갖는 신규한 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) KK2를 제공하고, 액체배양 및 고체배양에 있어 저가의 배지로 고 농도, 고 역가의 효소를 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

Description

셀룰라아제(ｃｅｌｌｕｌａｓｅ)와 자일란아제(ｘｙｌａｎａｓｅ)를 생산하는 아스퍼질러스 나이거(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ) ＫＫ2 균주와 이에 의해 제조된 효소 및 고체배양물{Cellulases and xylanase-producing Aspergillus niger KK2, produced enzymes and solid materials thereof}

본 발명은 셀룰라아제(cellulase)와 자일란아제(xylanase)를 고농도로 생산하는 신규의 균주, 그리고 그 균주에 의해 제조되어지는 효소 및 고체배양물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 셀룰로오스(cellulose)와 자일란(xylan) 분해능이 있는 셀룰라아제(cellulase)와 자일란아제(xylanase)를 고 농도로 생산하는 신규한 아스퍼질러스 나이거

(Aspergillus niger) KK2 균주의 선별과 이들의 액체배양 및 고체배양을 통한 효소 및 고체배양에 의해 생산된 고체배양물의 제조방법에 관한 것이다.

셀룰로스(cellulose)와 자일란(xylan)은 지구상에 존재하는 가장 풍부한 유기물질로 석유나 석탄처럼 고갈에 대하여 걱정할 필요가 없는 영원히 재생 가능한 자원이다. 또한 한편으로 이들 자원은 농산 폐기물이 범람하고 있는 현재에 있어 주요한 환경오염원으로 작용하고 있기도 하다. 그러므로 이들 다당류에 대한 효율적인 당화공정의 개발은 식량문제, 연료문제 그리고 환경문제의 해결에 큰 도움이 될 수 있을 것으로 여겨진다.

따라서, 오랫동안 셀룰로스(cellulose)와 자일란(xylan)을 당화시키기 위한많은 연구가 있어 왔으며 그 중 특히 당화효소의 개발에 초점을 맞춰 많은 연구가 이뤄져 왔다. 그 결과 현재에는 이들 당화효소의 용도가 다양하게 개발이 되어 여러 분야에서 상업화가 되었으며 또한 새로운 응용연구도 활발하게 진행이 되고 있다.

셀룰라아제(cellulase)는 섬유산업, 제지산업, 세제산업, 사료산업 등에서 많이 이용되고 있으며 이외에도 식품산업에 있어, 저 칼로리 식품의 제조와 음식물 쓰레기의 발효 등의 다양한 용도에 적용이 되고 있다. 한편, 자일란아제(xylanase)는 제지산업, 식품산업, 사료산업 등에 많이 응용이 되고 있다.

식물에 있어 세포벽은 셀룰로스(cellulose, 불용성 β-1,4-글루칸 섬유; insoluble β-1,4-glucan fiber), 헤미셀룰로스(hemicellulose, 갈락탄; galactan, 만난; mannan, 자일란을 포함하는 비셀루로스계 다당류; noncellulosic polysaccharides), 리그닌(lignin, 복잡한 폴리페놀 구조; polyphenolic structure)과 같은 중합체(polymer)로 구성되어 있으며, 구성성분 중에서 셀룰로스(cellulose)가 가장 많이 존재하고 그 다음으로 자일란(xylan)이 주성분인 헤미셀룰로스(hemicellulose)가 많이 존재하며 이들 두 성분이 전체 식물 바이오매스(biomass)의 50% 이상을 차지한다.

셀룰로스는 포도당(glucose) 단위가 β-1,4 결합으로 연결된 동종중합체(homopolymer)로서 셀룰로스를 완전히 분해하기 위해서는 엔도-β-1,4-글루칸아제(endo-β-1,4-glucanase) [EC 3. 2. 1. 4; endo-glucanase, CMCase (CMC; carboxymethylcellulose)], 엑소-β-1,4-글루칸아제(exo-β-1,4-glucanase)[EC 3. 2. 1. 91; exo-glucanase, cellobiohydrolase, FPase (FP; filter paper)], 베타-글루코시다아제(β-glucosidase) (EC 3. 2. 1. 21; cellobiase)의 세가지 종류의 효소가 필요하다. 엔도-글루칸아제(endo-glucanse)는 안쪽에서 β-1,4 포도당 결합을 무작위적으로 절단하고 엑소-글루칸아제(exo-glucanase)가 비환원당 말단에서 포도당 이당체인 셀로비오스(cellobiose)로 절단해 나간다. 셀로비오스(cellobiose)는 베타-글루코시다아제(β-glucosidase)에 의해서 포도당으로 최종 분해가 된다.

자일란은 β-1,4-글리코시드 결합(glycosidic bond)으로 연결된 자일로스(xylose) 골격에 아세테이트(acetate) 또는 아라비노오스(arabinose), 글루쿠론산(glucuronic acid)이 가지를 이루고 있는 이종중합체(heteropolymer)이다. 일반적으로 자일란을 가수분해하기 위해서는 엔도-β-1,4 자일란아제(endo-β-1,4-xylanase) (EC 3. 2. 1. 8; endo-xylanase), 베타-자일로시다아제(β-xylosidase) (EC 3. 2. 1. 37)의 2종류의 효소가 필요하다. 엔도-자일란아제(endo-xylanase)가 자일란을 분해하여 자일로스(xylose), 자일로비오스(xylobiose) 그리고 자일로-올리고당 (xylo-oligosaccharide)을 생성하고 이때 분해되지 않은 자일로비오스(xylobiose)와 자일로-올리고당은 베타-자일로시다아제(β-xylosidase)에 의해 자일로오스(xylose)로 전환된다.

종래에 있어, 이들 효소의 생산은 주로 곰팡이(fungi)를 이용하였으며, 특히 산업적인 측면에서 효소 생산은 주로 아스퍼질러스(Aspergillus)와트리코델마(Trichoderma)를 이용하였다. 셀룰라아제(cellulase) 생산 균주로는 트리코델마 리제이(Trichoderma reesei)가 대표적인 균주로 집중 연구되었으며, 자일란아제(xylanase)는 바실러스(Bacillus)속과 아스퍼질러스(Aspergillus)속의 미생물이 주로 연구되었다. 그러나 효소의 농도 및 활성이 산업화를 충족시킬 만큼 충분하지 못하다는 문제점이 있었으며, 이들 효소의 생산을 위한 기질로 유당(lactose)과 같은 값비싼 물질을 포함하는 고가의 정제배지를 사용하기 때문에 생산단가가 높은 문제점이 있었다. 예를 들어, 바이오매스(biomass)로부터 에탄올을 생산하는 공정은 원료 물질의 재생성 및 생산 연료의 환경 친화성 등 많은 장점을 갖고 있지만 리그노셀룰로스계 물질을 원료로 하여 생산된 에탄올은 휘발유에 비해 생산 단가가 너무 높아 실용화에 장애가 되고 있다. 이러한 에탄올 생산 공정에 있어 비용의 가장 큰 부분은 효소의 생산비로서 전체 비용의 약 60 %에 해당한다.

따라서 본 발명의 목적은 효소의 생산성이 높은 신규의 균주 선별과 생산단가가 낮은 배지의 개발을 통해 경제적으로 효소를 생산하여 이를 제공하는데 있다

본 발명의 목적은 자외선 조사에 의한 돌연변이를 이용하여 셀룰라아제 (cellulase)와 자일란아제(xylanase)을 고 농도로 생산하는 개량된 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) KK2 균주를 선별하고, 볏짚, 밀기울, 기타 영양강화물질을 포함하는 저가의 배지를 개발하여 달성하였다.

이하, 본 발명의 구체적인 구성을 실시예를 들어 상세히 설명하지만 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 만 한정하지는 않는다.

도 1은 볏짚을 이용한 고체배양에서, 본 발명의 아스퍼질러스 나이거 (Aspergillus niger) KK2를 접종했을 때 배양시간에 따른 자일란아제(xylanase)의 활성 변화를 나타낸다.

도 2는 볏짚을 이용한 고체배양에서, 본 발명의 아스퍼질러스 나이거 (Aspergillus niger) KK2를 접종했을 때 배양시간에 따른 씨엠씨아제(CMCase), 베타-글루코시다아제(β-glucosidase), 베타-자일로시다아제(β-xylosidase)의 활성 변화를 나타낸다.

도 3은 볏짚과 밀기울을 일정한 비로 혼합한 고체배양에서, 본 발명의 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) KK2를 접종했을 때 자일란아제(xylanase)의 활성 변화를 나타낸다.

도 4는 볏짚과 밀기울을 일정한 비로 혼합한 고체배양에서, 본 발명의 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) KK2를 접종했을 때 씨엠씨아제(CMCase),베타-글루코시다아제(β-glucosidase), 베타-자일로시다아제(β-xylosidase)의 활성 변화를 나타낸다.

본 발명은 셀룰라아제(cellulase)와 자일란아제(xylanase)를 생산하는 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) KK2 (KFCC-11285) 균주에 관한 것이다.

또한 본 발명은 상기의 균주를 종균 배양하는 단계;

상기의 종균배양액을 본 배양배지가 들어있는 배양기에서 본 배양하여 회수하는 단계로 이루어진 것을 특징으로 하는 효소 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명의 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) KK2 선별

과 그를 이용한 셀룰라아제(cellulase), 자일란아제(xylanase)의 제조방법에 대해 상세히 설명한다.

첫째로, 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) KK2 선별 과정에 대해 상세히 설명한다. 토양으로부터 분리된 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) KKS 모균주를 PDA(potato dextrose agar) 사면배지에 접종하여 28℃에서 7일간 배양한 후 0.1% Tween 80 용액 10mL을 첨가하여 포자를 현탁시키는 것이 좋다. 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) KKS 포자현탁액을 멸균된 페트리 디시(petri dish)로 옮긴 후 50㎝ 높이에 있는 30W 자외선등으로 10∼40초간 조사하는 것이 좋다. 바람직하게는 25초간 조사하는 것이 좋다. 자외선이 조사된 아스퍼질러스나이거(Aspergillus niger)KKS 포자현탁액을 pH 7로 조정된 선별배지에 도말한 후, 28℃ 배양기에서 6일간 배양하여 콜로니 크기와 자작나무 자일란(xylan)이 분해되어 생긴 투명환(clear zone) 크기의 비가 0.7 이하인 균주들을 선별하는 것이 좋다.

동일한 방법으로 반복적으로 실험하여 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) KK1이 선별된다. 아스퍼질러스 나이거 KK1 균주를 상기와 같은 방법으로 포자현탁액을 만들어 뚜껑 달린 실험관(cap tube)에 주입한 후 방사선 돌연변이원인 [⁶⁰Co]로부터 방사되는 감마선(γ-ray)을 0 ∼ 2.5 KGy로 조사하는 것이 좋다. 바람직하게는 1.25 KGy로 조사하는 것이 좋다. 감마선이 조사된 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) KK1 포자현탁액을 상기의 선별배지에 도말하는 것이 좋다. 도말된 선별배지를 28℃ 배양기에서 6일간 배양한 후 콜로니 크기와 자작나무 자일란이 분해되어 생긴 투명환(clear zone) 크기의 비가 0.5 이하인 균주들을 선별하는 것이 좋다. 최종적으로 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) KK2를 선별하여 2001년 11월 14일 한국미생물보존센타(기탁번호 : KFCC-11285)에 기탁하였다.

상기의 방법에 의하여 선별된 균주는 자연계에서 수집된 트리코델마 (Trichoderma)속과 아스퍼질러스(Aspergillus)속의 균주에 비해 효소의 생산성이 월등히 뛰어난 균학적 성질이 있다.

둘째로, 선별된 신규의 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) KK2을 이용하여 셀룰라아제(cellulase), 자일란아제(xylanase)를 제조하는 방법에 대해 상세히 설명한다. 상기의 셀룰라아제(cellulase), 자일란아제(xylanase)는 액체배양과 고체배양의 두 가지 배양방식에 의해 제조될 수 있는 바 이하 액체배양의 경우와 고체배양의 경우로 나눠 상세히 설명하고 특히 고체배양의 경우는 그 배지가 볏짚과 밀기울을 단독 또는 병합하여 포함하고 있는 형태로 나눠 각각 상세히 설명한다.

액체배양에 의한 효소의 생산에 관한 상세한 설명은 하기와 같다.

아스퍼질러스 나이거 KK2 균주를 PDA(potato dextrose agar) 사면배지에 접종하여 28℃에서 7일간 배양한 후 0.1% Tween 80 용액을 첨가하여 포자를 현탁시키는 것이 좋다. 1.0 mL 당 2∼5 × 10⁷포자를 갖는 포자현탁액 5∼15 mL을 80∼100 mL의 맥아추출물(malt extract)이 들어있는 250 mL의 삼각플라스크에 접종한 후 28℃ 진탕배양기에서 200 알피엠(rpm)으로 48시간 종균 배양(seed culture)하는 것이 좋다. 바람직하게는 3.5×10⁷의 포자를 가지고 있는 포자현탁액을 90 mL의 맥아추출물이 있는 종균배지에 접종하는 것이 좋다.

본 배양 배지가 45∼50 mL 들어 있는 250 mL의 삼각플라스크를 121℃, 1.5 기압에서 20분간 멸균한 후 종균배양액 2.0∼3.0 mL을 접종하여 28℃ 진탕배양기에서 200 알피엠(rpm)으로 5일간 배양하는 것이 좋다. 바람직하게는 47.5 mL의 본 배양 배지를 사용하고 2.5 mL의 종균배양액을 사용하는 것이 좋다. 본 배양배지의 조성은 표 1과 같다.

성 분	조 성 (%)
볏짚 (rice straw, 0.3 ㎜ 이하 크기)	2∼3
밀기울 (wheat bran, 0.4 ㎜ 이하 크기)	1∼1.5
옥수수 농침액 (corn steep liquor)	3∼6
산업용 효모추출물 (industrial yeast extract)	0.1∼0.15
일염기 인산칼륨	0.5∼0.8
황산동 5수화물	0.05
	0.01
5 N 수산화나트륨으로 pH = 7.0으로 조정

상기 본 배양 배지의 조성에 있어 바람직하게는 2.5%의 볏짚, 1.25%의 밀기울, 4.5%의 옥수수 농침액, 0.125%의 산업용 효모추출물, 0.65%의 일염기 인산칼륨을 사용하는 것이 좋다

본 배양 (main culture)이 끝난 배양액을 3,000 알피엠(rpm)으로 10분간 원심분리한 후 상등액을 취하여 효소를 회수하는 것이 좋다.

볏짚을 이용한 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) KK2 의 고체배양에 관한 상세한 설명은 하기와 같다.

아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) KK2 균주를 PDA(potato dextrose agar) 사면배지에 접종하여 28℃에서 7일간 배양한 후 0.1% Tween 80 용액을 첨가하여 포자를 현탁시키는 것이 좋다. 헤모사이토미터(haemocytometer)를 이용하여 현미경 하에서 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) KK2 포자현탁액의 포자수 (spore number)를 측정하여 볏짚 그램(gram) 당 5×10⁵포자가 되도록 고체배양용 배지에 접종하는 것이 좋다. 배지는 고체배양용 영양배지를 5.0 그램(gram)의 볏짚 (rice straw)에 첨가함으로써 조성되고 물을 첨가하여 초기수분함량을 50∼80%로맞추는 것이 좋다. 바람직하게는 초기수분함량을 65%로 맞추는 것이 좋다. 상기 배지를 21℃, 1.5 기압에서 20분 간 멸균하는 것이 좋다.

고체배양용 영양배지

성 분	볏짚 100g에 들어가는 조성
옥수수 농침액 (corn steep liquor)	40∼60 mL
산업용 효모추출물(industrial yeast extract)	0.4∼0.6 g
일염기 인산칼륨	4.0∼6.0 g
황산동 5수화물	0.4∼0.6 g
황산코발트 7수화물	0.05∼0.15 g
5 N 수산화나트륨으로 pH = 6.5∼7.5으로 조정

상기 배지성분들 중에 바람직하게는 50 mL의 옥수수 농침액, 0.5 g의 산업용 효모추출물, 5.0 g의 일염기 인산칼륨, 0.5 g의 황산동 5수화물, 0.1 g의 황산코발트 7수화물을 사용하며, 배지의 pH는 바람직하게 7.0으로 조정하는 것이 좋다.

접종된 포자가 배지에 골고루 분산되도록 잘 섞은 후 28℃ 배양기에서 7일간 배양하는 것이 좋다. 배양이 완료된 고체배양물에 0.1% Tween 80 용액을 첨가하여 균질기(homogenizer)로 12,000 알피엠(rpm), 5분간 균질화 시킨 후 3,000 알피엠(rpm)으로 10분간 원심분리하여 상등액을 취하여 효소를 회수하는 것이 좋다.

밀기울을 이용한 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) KK2의 고체배양에 관한 상세한 설명은 하기와 같다.

상기 표 2의 고체배양용 영양배지를 5.0g의 밀기울(wheat bran)에 첨가하고물을 첨가하여 초기수분함량을 50∼80%로 조정하는 것이 좋다. 바람직하게는 초기수분함량을 65%로 하는 것이 좋다. 이 배지를 121℃, 1.5 기압에서 20분간 멸균하는 것이 좋다. 이후의 고체배양은 상기의 볏짚을 이용한 고체배양과 동일하나 발효는 5일간 진행하는 것이 좋다.

볏짚과 밀기울을 혼합하여 이용한 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) KK2 균주의 고체배양에 관한 상세한 설명은 하기와 같다.

상기 표 2의 고체배양용 영양배지를 볏짚과 밀기울의 비가 4 대 1, 3 대 2, 2 대 3, 1 대 4인 5.0g의 볏짚과 밀기울 혼합배지에 첨가하는 것이 좋다. 물을 첨가하여 초기수분함량을 50∼80%로 조정하는 것이 좋다. 바람직하게는 초기수분함량을 65%로 하는 것이 좋다. 이 배지를 121℃, 1.5 기압에서 20분간 멸균하는 것이 좋다. 이후의 고체배양은 상기의 볏짚을 이용한 고체배양과 동일하나 발효는 5일간 진행하는 것이 좋다.

이하, 본 발명의 구체적인 구성과 작용을 실시예를 들어 상세히 설명한다.

실시예 1: 아스퍼질러스 나이거 ( Aspergillus niger ) KK2 선별

토양으로부터 분리된 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) KKS 모균주를 PDA(potato dextrose agar)사면배지에 접종하여 28℃에서 7일간 배양한 후 0.1% Tween 80 용액 10mL을 첨가하여 포자를 현탁시켰다. 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) KKS 포자현탁액을 멸균된 페트리 디시(petri dish)로 옮긴 후 50㎝ 높이에 있는 30W 자외선등으로 25초간 조사하였다. 자외선이 조사된아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) KKS 포자현탁액을 pH 7로 조정된 선별배지 [1.0%의 자작나무 자일란(birchwood xylan), 0.5%의 프로테오스 펩톤(proteose peptone), 0.05%의 효모추출물(yeast extract), 0.5%의 일염기 인산칼륨, 0.05%의 황산동 5수화물, 0.01%의 황산코발트 7수화물, 0.1%의 트리톤(triton) X-100, 1.8%의 한천(agar)]에 도말한 후, 28℃ 배양기에서 6일간 배양하여 콜로니 크기와 자작나무 자일란이 분해되어 생긴 투명환(clear zone) 크기의 비가 0.7 이하인 균주들을 선별하였다.

동일한 방법으로 반복적으로 실험하여 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) KK1 균주가 선별되었다. 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) KK1 균주를 상기와 같은 방법으로 포자현탁액을 만들어 뚜껑이 달린 실험관(cap tube)에 주입한 후 방사선 돌연변이원인 [⁶⁰Co]로부터 방사되는 감마선(γ-ray)을 1.25 KGy로 조사하였다. 감마선이 조사된 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) KK1 포자현탁액을 상기의 선별배지에 도말하였다. 28℃의 배양기에서 6일간 배양한 후 콜로니 크기와 자작나무 자일란이 분해되어 생긴 투명환(clear zone) 크기의 비가 0.5 이하인 균주들을 선별하였고, 최종적으로 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) KK2를 선별하여 2001년 11월 14일 한국미생물보존센타(기탁번호 : KFCC-11285)에 기탁하였다.

실시예 2: 아스퍼질러스 나이거 ( Aspergillus niger ) KK2 균의 액체배양

아스퍼질러스 나이거 KK2 균주를 PDA(potato dextrose agar) 사면배지에 접종하여 28℃에서 7일간 배양한 후 0.1% Tween 80 용액을 첨가하여 포자를 현탁시켰다. 포자현탁액(1.0 mL 당 3.5 × 10⁷포자) 10 mL를 90 mL의 맥아추출물(malt extract)이 들어있는 250 mL의 삼각플라스크에 접종한 후 28℃의 진탕배양기에서 200 알피엠(rpm)으로 48시간 종균 배양(seed culture) 하였다. 본 배양 배지 47.5 mL가 들어있는 250 mL의 삼각플라스크를 121℃, 1.5 기압에서 20분간 멸균한 후 종균배양액 2.5 mL을 접종하여 28℃의 진탕배양기에서 200 알피엠(rpm)으로 5일 간 배양하였다. 본 배양배지는 2.5%의 볏짚(rice straw, 0.3 mm 이하 크기), 1.25%의 밀기울(wheat bran, 0.4 mm 이하 크기), 4.5%의 옥수수 농침액(corn steep liquor), 0.125%의 산업용 효모추출액(industrial yeast extract), 0.65%의 일염기 인산칼륨, 0.05%의 황산동 5수화물, 0.01%의 황산코발트 7수화물로 구성하였으며 5N 수산화나트륨으로 pH를 7.0으로 조정하였다.

본 배양(main culture)이 끝난 배양액을 3,000 알피엠(rpm)으로 10분간 원심분리한 후 상등액을 취하여 효소활성을 측정하였다. 종균 및 본 배양은 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) KK2의 형태학적 특성에 따라 유변학적 거동이 다르게 나타났으며 이는 효소 생산에 영향을 주고 있는 것으로 나타났다.

여러 번 반복실험에서 베타-글루코시다아제(β-glucosidase), 베타-자일로시다아제(β-xylosidase) 그리고 자일란아제(xylanase) 활성의 평균 범위가 각각 본배양액 1.0 mL 당 8.5∼10.8 IU, 14.1∼15.8 IU, 380∼613 IU이었다. 베타-글루코시다아제(β-glucosidase), 베타-자일로시다아제(β-xylosidase) 그리고 자일란아제(β-xylanase)의 최대활성은 각각 본 배양액 1.0 mL 당 11.8 IU, 16.5 IU, 665 IU이었다.

실시예 3: 볏짚을 이용한 아스퍼질러스 나이거( Aspergillus niger ) KK2의 고체배양

아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) KK2 균주를 PDA(potato dextrose agar) 사면배지에 접종하여 28℃에서 7일간 배양한 후 0.1% Tween 80 용액을 첨가하여 포자를 현탁시켰다. 헤모사이토미터(haemocytometer)를 이용하여 현미경하에서 아스퍼질러스 나이거 KK2 포자현탁액의 포자수(spore number)를 측정하여 볏짚 그램(gram) 당 5×10⁵포자가 되도록 배지에 접종하였다. 배지는 고체배양용 영양배지를 5.0 그램(gram)의 볏짚(rice straw)에 첨가하여 구성하였고 초기수분함량을 65%로 맞추기 위하여 물을 첨가한 후 121℃, 1.5 기압에서 20분 간 멸균하였다. 고체배양용 영양배지는 볏짚 100g 당 50 mL의 옥수수 농침액(corn steep liquor), 0.5g의 산업용 효모추출액(industrial yeast extract), 5.0g의 일염기 인산칼륨, 0.5g의 황산동 5수화물, 0.1g의 황산코발트 7수화물을 첨가하여 구성하였고, 5N 수산화나트륨으로 pH를 7.0으로 조정하였다. 접종된 포자가 볏짚에 골고루 분산되도록 잘 섞은 후 28℃의 배양기에서 7일 간 배양하였다.

배양이 완료된 고체배양물에 0.1%의 Tween 80 용액을 첨가하여 12,000 알피엠(rpm)의 균질기(homogenizer)로 5분간 균질화 시킨 후 3,000 알피엠(rpm)으로 10분간 원심분리하여 상등액을 취하였다. 상등액을 적절히 희석하여 효소 역가를 측정하였다. 자일란아제(xylanase)의 최대활성은 5일 동안의 고체배양 후 고체배양물 1.0g 당 5,071 IU이었으며, 이때의 생산성(productivity)은 14,790 IU/l·h이었다.(도 1) 엑소-β-1,4-글루칸아제(exo-β-1,4-glucanase)인 에프파아제(FPase)의 최대활성은 고체배양 4일에 고체배양물 1.0g 당 19.5 IU이었다. 또한 엔도-β-1,4-글루칸아제(endo-β-1,4-glucanase)인 CMCase(씨엠씨아제), 베타-글루코시다아제(β-glucosidase) 그리고 베타-자일로시다아제(β-xylosidase)의 최대활성은 6일 동안의 고체배양에 고체배양물 1.0g 당 각각 130 IU, 101 IU, 193 IU이었다.(도 2)

실시예 4: 밀기울을 이용한 아스퍼질러스 나이거( Aspergillus niger ) KK2의 고체배양

볏짚 100g 당 50 mL의 옥수수 농침액(corn steep liquor), 0.5g의 산업용 효모추출액(industrial yeast extract), 5.0g의 일염기 인산칼륨 , 0.5g의 황산동 5수화물 , 0.1g의 황산코발트 7수화물의 비로 이들을 첨가한 후, 5N 수산화나트륨을 첨가하여 pH가 7.0으로 조정된 고체배양용 영양배지를 5.0g의 밀기울(wheat bran)에 첨가하고 초기수분함량을 65%로 맞추기 위하여 물을 첨가한 후 121℃, 1.5 기압에서 20분 간 멸균하였다. 이후 고체배양 방법은 상기의 실시예 4와 동일하나배양기간은 5일 간 하였다. 엑소-β-1,4-글루칸아제(exo-β-1,4-glucanase)인 에프파아제(FPase), 엔도-β-1,4-글루칸아제(endo-β-1,4-glucanase)인 CMCase(씨엠씨아제), 베타-글루코시다아제(β-glucosidase), 자일란아제(xylanase) 그리고 베타-자일로시다아제(β-xylosidase)의 활성이 각각 고체배양물 1.0g 당 8.8 IU, 118 IU, 96 IU, 1,470 IU, 199 IU이었다.

실시예 5: 볏짚과 밀기울을 이용한 아스퍼질러스 나이거( Aspergillus niger ) KK2의 고체배양

볏짚 100g 당 50 mL의 옥수수 농침액(corn steep liquor), 0.5g의 산업용 효모추출액(industrial yeast extract), 5.0g의 일염기 인산칼륨 , 0.5g의 황산동 5수화물 , 0.1g의 황산코발트 7수화물의 비로 이들을 첨가한 후, 5N 수산화나트륨을 첨가하여 pH가 7.0으로 조정된 고체배양용 영양배지를 볏짚과 밀기울의 비가 각각 4 대 1, 3 대 2, 2 대 3, 1 대 4인 5.0g의 볏짚과 밀기울 혼합배지에 첨가하고 초기수분함량을 65%로 맞추기 위하여 물을 첨가한 후 121℃, 1.5 기압에서 20분간 멸균하였다. 이후 고체배양 방법은 상기의 실시예 4와 동일하나 발효기간은 5일 간 하였다.

도 3과 도 4에 나타난 바와 같이 볏짚과 밀기울을 일정한 비로 혼합하여 고체배양했을 때 엑소-β-1,4-글루칸아제(exo-β-1,4-glucanase)인 FPase, 엔도-β-1,4-글루칸아제(endo-β-1,4-glucanase)인 씨엠씨아제(CMCase), 베타-글루코시다아제(β-glucosidase), 자일란아제(xylanase) 그리고 베타-자일로시다아제(β-xylosidase)의 활성 범위가 각각 고체배양물 1.0g 당 10.4∼11.9 IU, 118∼130 IU, 95∼107 IU, 1,884∼4,940 IU, 211∼239 IU이었다.

효소의 최대활성이 나타난 볏짚과 밀기울 비는 각각 다음과 같다. 엑소-β-1,4-글루칸아제(exo-β-1,4-glucanase)인 에프파아제(FPase)와 엔도-β-1,4-글루칸아제(endo-β-1,4-glucanase)인 씨엠씨아제(CMCase)의 최대활성은, 볏짚과 밀기울 비가 4 대 1일 때 고체배양물 1.0g 당 11.9 IU, 볏짚과 밀기울 비가 3 대 2일 때 고체배양물 1.0g 당 130 IU이었으며, 베타-글루코시다아제(β-glucosidase)는 볏짚과 밀기울 비가 변화되어도 효소활성은 고체배양물 1.0g 당 95∼107 IU로 비슷하였다. 한편 자일란아제(xylanase)와 베타-자일로시다아제(β-xylosidase)의 최대활성은 각각 볏짚과 밀기울의 비가 4 대 1일 때 고체배양물 1.0g 당 4,940 IU, 볏짚과 밀기울 비가 1 대 4일 때 고체배양물 1.0g 당 239 IU이었다.

이상, 상기 실시예를 통하여 설명한 바와 같이 본 발명은 셀룰라아제(cellulase)와 자일란아제(xylanase)의 생산에 있어서, 고 농도와 고 활성을 가진 효소를 저가의 배지에서 생산하기 위해 자외선 조사에 의해 신규의 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) KK2를 선별한 효과가 있고, 이를 사용하여 볏짚 및 밀기울이 단독 또는 병합된 값싼 배지에서 배양함으로, 생산단가가 낮은 배지에서 고 농도와 고 활성을 가진 효소들과 그 고체배양물을 제공할 수 있는 효과가 있으므로 미생물산업 및 효소제조산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

셀룰라아제와 자일란아제를 생산하는 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) KK2 (KFCC-11285)
제 1항의 균주를 종균 배양하는 단계; 상기의 종균배양액을 본 배양배지가 들어있는 배양기에서 액체 또는 고체배양한 후 상기의 본 배양액을 회수하는 단계에 의하여 효소를 제조하는 것을 특징으로 하는 효소 제조방법
제 2항에 있어서, 상기 효소가 에프파아제, 씨엠씨아제, 베타-글루코시다아제, 베타-자일로시다아제 및 베타-자일란아제 중 어느 하나를 선택함을 특징으로 하는 효소 제조방법
제 2항에 있어서, 상기 액체배양의 배지는 볏짚과 밀기울을 병합하여 포함하는 것과, 상기 고체배양의 배지는 볏짚 과 밀기울을 단독 또는 병합하여 포함하는 것을 특징으로 하는 효소 제조방법
제 2항에 있어서, 상기 배양의 배지는 수수 농침액, 산업용 효모추출물, 일염기 인산칼륨, 황산동 5수화물, 황산코발트 7수화물을 포함하는 것을 특징으로 하는 효소의 제조방법
제 2항에 있어서, 상기 고체배양의 배지는 그 수분함량이 50∼80% 인 것을 특징으로 하는 효소의 제조 방법
제 4항에 있어서, 상기 고체배양의 배지 중 볏짚과 밀기울 병합하여 포함하는 경우는 볏짚과 밀기울의 혼합비가 4 대 1, 3 대 2, 2 대 3, 1 대 4 인 것 중 어느 하나를 선택함을 특징으로 하는 효소의 제조방법
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