KR101902317B1 - 주름개선용 효소처리 무궁화추출물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 아스퍼질러스(Aspergillus) 유래 효소 처리 무궁화 추출물(Enzyme-treated Mugunghwa mixture; ETHs)을 유효성분으로 함유하는 주름 개선용 조성물 및 상기 아스퍼질러스 유래 효소 처리 무궁화 추출물 제조방법에 관한 것으로서, 생물전환기술을 적용한 무궁화 추출물은 세포생존율의 변화를 나타내지 않음과 동시에 피부 광노화 방지 및 주름개선 효능이 우수한 것으로 확인되었다. 본 발명의 결과는 향후 무궁화를 이용한 기능성 식품 또는 화장품 원료 등의 개발을 위한 기초연구 자료로써 활용이 가능할 뿐만 아니라, 우리나라의 국화인 무궁화를 연구의 소재로 이용하여 다양한 생리활성을 검증할 수 있는 기반을 마련했다는 점에서 더욱 의미가 있다고 사료된다.

Description

주름개선용 효소처리 무궁화추출물{Enzyme treated Mugunghwa extracts for improving skin wrinkle}
본 발명은 아스퍼질러스(Aspergillus) 유래 효소를 응용한 효소처리 무궁화 추출물(Enzyme-treated Mugunghwa mixture; ETHs)을 유효성분으로 함유하는 주름 개선용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
우리나라의 국화인 무궁화(Mugunghwa; Hibiscus syriacus L.)는 국내에서만 약 200여종이 있는 것으로 알려져 있으며, 목근피(Hibisci cortex)는 무궁화의 뿌리 및 줄기 껍질부분으로 예로부터 한방에서 소염, 항균 등의 효능을 가진 약용식물로 이용되어 왔다. 하지만, 무궁화가 우리나라의 국화임에도 불구하고 현재까지 국내에서는 무궁화의 재비 및 육종에 대한 연구만 주로 이루어지고 있으며, 무궁화를 이용한 다양한 생리활성 연구가 미흡하고, 특히 생활 속에 적용 가능한 기능성 화장품 또는 식품 등의 원료로서 개발 가능한 연구 결과는 거의 없다.
최근 천연물에 생물전환기술을 적용하여 다양한 기능성 원료를 개발하기 위한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 이러한 생물전환 기술은 천연물의 기능성 증대 및 효능 물질을 다량 확보할 수 있다는 장점이 있다.
피부 주름은 피부 수분함량, 콜라겐 함량 및 외부 환경에 대한 면역력 등 여러 가지 요소들에 의해 영향을 받는 것으로 알려져 있으며, 이중 주름의 형성에 가장 큰 영향을 미치는 것은 콜라겐의 생성량 및 콜라겐 분해 효소인 콜라게네이즈의 발현과 활성이다. 콜라겐은 피부 진피층에 존재하는데, 피부 전체 건조 중량의 약 70 내지 80%를 차지하는 엘라스틴과 함께 피부에 탄력을 부여하는 주요 성분으로 알려져 있다. 콜라겐은 자연 노화에 따른 세포활성 저하와 같은 내부 요인에 의해 감소되고, 여러 유해 환경에서의 스트레스 증가나 태양 광선에 의한 활성 산소 종의 증가와 같은 외부 요인에 의하여 생합성이 감소되거나, 분해가 촉진되고 있다.
UVB 노출과 연관된 신호전달 체계는 MAPKs(mitogen activated protein kinases), ERK(extracellular signal-regulated kinase), p38 카이나아제, 및 JNK(c-Jun amino-terminal kinase) 등의 단백질과 관련되어 있는데, NF-ĸ및 AP-1 전사인자의 발현증가를 유도한다. 또한, AP-1 단백질은 MMP(matrix metalloproteinase) 유전자의 활성과 관련되어 있고, NF-ĸ단백질은 인터루킨과 같은 전염증 사이토카인(proinflammatory cytokines)의 발현에 영향을 미친다.
타입 I 콜라겐 단백질의 발현 수준을 조절하는 것은 피부 광노화를 예방하는데 있어서 가장 중요한 인자이다. UVB의 조사는 TGF-β/Smad 신호전달 체계의 억제를 통해 피부 섬유아세포에서 콜라겐 전구체인 프로콜라겐(procollagen)의 발현을 감소시키게 된다. 또한, TGF-β1 신호전달 체계는 인간 피부 섬유아세포에서 세포외 기질의 합성을 조절하는 중요한 인자의 하나이다. 따라서, AP-1 및 MAPKs 인자에 의해 조절되는 활성산소종(ROS)의 생성, 및 MMPs, ILs, TGF-β, 및 타입 I 프로콜라겐의 발현은 피부 광노화 연구에 있어서 유용한 마커로 작용한다.
이와 같이 콜라겐 감소를 저해하여 피부 주름개선에 효과가 있는 천연물질을 탐색하고자 하는 여러 다양한 시도가 있었다. 콜라겐의 주름개선 효과를 이용하기 위하여 화장품 또는 연고 등과 같은 피부외용제 조성물에 콜라겐을 배합한 제품들이 출시되었으나, 이들 제품들은 콜라겐 자체를 피부 표면에 도포하는 것으로 고분자 물질인 콜라겐의 경피 흡수가 어려워 본질적인 주름개선 효과를 나타낼 수 없었다. 따라서 종래 주름개선용 조성물보다 생체에 안전하고 주름개선 효과가 높은 새로운 주름개선 조성물의 개발이 절실히 요구되고 있다.
한국등록특허 제10-1564430호(2015.10.23 등록)
본 발명의 목적은 아스퍼질러스(Aspergillus) 유래 효소 처리 무궁화 추출물(Enzyme-treated Mugunghwa mixture; ETHs)을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물, 약학 조성물 또는 건강식품 조성물을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 아스퍼질러스(Aspergillus) 유래 효소 처리 무궁화 추출물 제조방법 및 상기 방법에 따라 제조된 아스퍼질러스(Aspergillus) 유래 효소 처리 무궁화 추출물을 제공하는데 있다.
본 발명은 아스퍼질러스(Aspergillus) 유래 효소 처리 무궁화 추출물(Enzyme-treated Mugunghwa mixture; ETHs)을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 아스퍼질러스(Aspergillus) 유래 효소 처리 무궁화 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 아스퍼질러스(Aspergillus) 유래 효소 처리 무궁화 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 아스퍼질러스(Aspergillus) 유래 효소 처리 무궁화 추출물 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 따라 제조된 아스퍼질러스(Aspergillus) 유래 효소 처리 무궁화 추출물을 제공한다.
본 발명은 아스퍼질러스(Aspergillus) 유래 효소 처리 무궁화 추출물(Enzyme-treated Mugunghwa mixture; ETHs)을 유효성분으로 함유하는 주름 개선용 조성물 및 상기 아스퍼질러스 유래 효소 처리 무궁화 추출물 제조방법에 관한 것으로서, 생물전환기술을 적용한 무궁화 추출물은 세포생존율의 변화를 나타내지 않음과 동시에 피부 광노화 방지 및 주름개선 효능이 우수한 것으로 확인되었다. 본 발명의 결과는 향후 무궁화를 이용한 기능성 식품 또는 화장품 원료 등의 개발을 위한 기초연구 자료로써 활용이 가능할 뿐만 아니라, 우리나라의 국화인 무궁화를 연구의 소재로 이용하여 다양한 생리활성을 검증할 수 있는 기반을 마련했다는 점에서 더욱 의미가 있다고 사료된다.
도 1은 본 발명의 단계별 실험 방법을 나타낸 흐름도이다. (A) 무궁화 추출물의 생물전환; (B) 피부 항노화 효능 검증, (C) 활성 물질 확인.
도 2는 아스퍼질러스(Aspergillus) 효소의 반응 속도(enzyme kinetic)을 나타낸다.
도 3은 무궁화 및 효소 처리 무궁화 추출물(Enzyme-treated Mugunghwa mixture; ETHs)(1-8)의 RP-HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 4는 무궁화 및 ETHs(1-8)의 자유 라디컬 소거 활성을 나타낸다.
도 5는 NHDF의 생존능에 있어 무궁화 및 ETHs(1-8)의 효과를 나타낸다. (A) UVB 미조사, (B) UVB 조사.
도 6은 MMP-1 분비에 있어 무궁화 및 ETHs(1-8)의 효과를 나타낸다. (A) UVB 미조사, (B) UVB 조사.
도 7은 MMP-3 분비에 있어 무궁화 및 ETHs(1-8)의 효과를 나타낸다. (A) UVB 미조사, (B) UVB 조사.
도 8은 IL-6 발현에 있어 무궁화 및 ETHs(3, 5 및 8)의 효과를 나타낸다. (A) UVB 미조사, (B) UVB 조사.
도 9는 타입 I 프로콜라겐 발현에 있어 무궁화 및 ETH8의 효과를 나타낸다. (A) UVB 미조사, (B) UVB 조사.
도 10은 MMP-1 및 타입 I 프로콜라겐 mRNA 발현에 있어 무궁화 및 ETH8의 효과를 나타낸다. (A) mRNA 젤 전기영동 밴드, (B) 농도 분석 결과.
도 11은 c-Fos 및 c-Jun 인산화에 있어 무궁화 및 ETH8의 효과를 나타낸다. (A) 단백질 전기영동 밴드, (B) 농도 분석 결과.
도 12는 MARKs 인산화에 있어 무궁화 및 ETH8의 효과를 나타낸다. (A) 단백질 전기영동 밴드, (B) 농도 분석 결과.
이에, 본 발명자들은 무궁화에 아스퍼질러스(Aspergillus) 유래 효소를 이용한 생물전환기술을 적용하여 효소처리 무궁화 추출물을 생산하였고, 이 추출물의 유효성분을 분석하고, 인간의 피부섬유아세포(Normal Human Dermal Fibroblasts; NHDF)에서 UVB에 의한 피부 광노화 억제 효과를 확인함으로써, 효소처리 무궁화의 기능성 식품/화장품 원료로서의 가능성을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 상기 아스퍼질러스(Aspergillus) 유래 효소 처리 무궁화 추출물(Enzyme-treated Mugunghwa mixture; ETHs)을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다. 상세하게는, 상기 피부 주름은 UVB 조사에 의해 유도될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 아스퍼질러스(Aspergillus)는 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 또는 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)는 KACC 40280, 41018, 42589, 43547, 44333, 45072, 45093, 45134, 45138, 45173, 46493, 46494, 46495, 46497일 수 있으며, 상기 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae)는 KACC 44823, 44969, 44988, 44990, 40232, 40233, 40234, 40242, 40244, 40247, 40250, 41730, 41735, 41736, 44246, 44966, 44967, 44968, 44971, 44989, 44991, 44992, 44993, 44994, 44995, 44997, 44999, 45001, 45002, 45004, 45006, 45107, 46455, 46458, 46459, 46474, 47488일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 아스퍼질러스(Aspergillus) 유래 효소는 아스퍼질러스(Aspergillus) 배양액을 원심분리하여 수집한 상등액으로서, 아스퍼질러스(Aspergillus) 유래 미정제(crude) 효소 추출물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 아스퍼질러스(Aspergillus) 유래 미정제(crude) 효소 추출물은 셀룰라아제(cellulase) 활성을 가질 수 있다.
피부 섬유아세포의 주된 기능으로 세포외기질 합성과 증식을 통한 손상된 피부 조직 재생 등을 들 수 있는데, 광노화와 같은 외인성 노화 요인 또는 유리 산소에 의한 손상 누적, 텔로미어 단절로 인한 세포 노화 등에 따른 내인성 노화 요인들은 진피층 내에 있는 피부섬유아세포의 생리 활성 기능을 저하시키게 된다. 피부 세포외기질 중 95% 이상을 차지하고, 세포의 부착분자(adhesion molecule) 및 세포 골격(cytoskeleton) 등과의 상호 작용과 신호 교류를 통해 섬유아세포의 생리 활성에 매우 주요한 부분을 담당하는 제I형 콜라겐의 합성이 저하될 경우, 피부 조직 내 콜라겐 양이 감소되고, 이에 따라 표면 장력이 감소되어 피부 탄력이 저하되고 피부 주름이 형성될 뿐만 아니라, 세포의 증식 및 재생 기능을 포함하는 생리 활성 기능이 감소하는 악순환의 원인이 된다.
따라서, 피부섬유아세포의 콜라겐은 피부 재생, 피부 탄력, 피부 주름 형성 및 피부 손상 시 조직의 수복 또는 재생과 직접적인 관련이 있다고 볼 수 있다.
즉, 피부 섬유아세포의 콜라겐 또는 프로콜라겐의 합성이 촉진되거나, 콜라겐을 분해하는 기질 단백질 분해효소(matrix metallo-proteinase, 이하 'MMP'라 함)의 합성이 저해되면, 피부 탄력 개선, 피부 재생, 피부 주름 개선, 상처 치유, 손상된 피부 조직의 수복 및 재생; 및 피부 노화 방지 등의 효과를 얻을 수 있다.
본 발명의 아스퍼질러스(Aspergillus) 유래 효소 처리 무궁화 추출물은 타입 I 프로콜라겐 단백질의 발현을 증가시키고, MMP-1 및 MMP-3 단백질의 발현을 억제할 수 있다.
본 발명의 조성물이 화장료 조성물인 경우, 상기 화장료 조성물은 유효성분인 아스퍼질러스(Aspergillus) 유래 효소 처리 무궁화 추출물(Enzyme-treated Mugunghwa mixture; ETHs) 외에 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 헤어토닉, 헤어컨디셔너, 헤어에센스, 헤어로션, 헤어영양로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 헤어크림, 헤어영양크림, 헤어모이스처크림, 헤어맛사지크림, 헤어왁스, 헤어 에어로졸, 헤어팩, 헤어영양팩, 헤어비누, 헤어클렌징폼, 머릿기름, 모발건조제, 모발보존처리제, 모발염색제, 모발용 웨이브제, 모발탈색제, 헤어겔, 헤어글레이즈, 헤어드레싱어, 헤어래커, 헤어모이스처라이저, 헤어무스 및 헤어스프레이 등으로 제형화 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
상기 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
상기 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
상기 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 아스퍼질러스(Aspergillus) 유래 효소 처리 무궁화 추출물(Enzyme-treated Mugunghwa mixture; ETHs)을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물이 약학 조성물인 경우, 약학 조성물은 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 및 카타플라스마제 등으로 제형화 될 수 있다. 한편, 상기 약학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있는데, 이러한 약제학적으로 허용되는 담체는 약품 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 약학적 조성물은 첨가제로서 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 증상 정도에 따라 투여 방법이 결정되는데, 통상적으로는 국소 투여 방식이 바람직하다. 또한, 상기 약학적 조성물 중 유효성분의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 환자의 나이, 성별, 체중 등에 따라 달라질 수 있으며, 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 아스퍼질러스(Aspergillus) 유래 효소 처리 무궁화 추출물(Enzyme-treated Mugunghwa mixture; ETHs)을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.
상기 건강식품 조성물은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽 또는 음료의 형태로 제공될 수 있으며, 상기 건강식품 조성물은 유효성분인 본 발명에 따른 아스퍼질러스(Aspergillus) 유래 효소 처리 무궁화 추출물(Enzyme-treated Mugunghwa mixture; ETHs) 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를 들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
상기 건강식품 조성물에 함유된 아스퍼질러스(Aspergillus) 유래 효소 처리 무궁화 추출물(Enzyme-treated Mugunghwa mixture; ETHs)의 유효용량은 상기 약학조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.
상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, "무궁화(Hibiscus syriacus L.; Mugunghwa) 추출물"은 무궁화의 천연, 잡종 또는 변종 식물로부터 추출될 수 있고, 식물 조직 배양물에서도 추출이 가능하며, 잎, 줄기, 뿌리, 꽃, 열매 등의 부위에서 추출한 추출물을 포함한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, "무궁화 추출물"은 무궁화의 뿌리 및 줄기 껍질부분을 의미하는 "목근피(Hibisci cortex)"를 열수 추출한 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, "추출물"은 식물의 추출 처리에 의하여 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다. 본 발명의 상기 추출물은 바람직하게 추출 후 건조 분말 형태로 제조되어 사용될 수 있다.
본 발명은 (1) 아스퍼질러스(Aspergillus)를 배양하는 단계; (2) 상기 배양액을 여과하는 단계; (3) 상기 여과액을 원심분리하고 상등액을 수집하여 아스퍼질러스(Aspergillus) 유래 미정제(crude) 효소를 추출하는 단계; 및 (4) 상기 아스퍼질러스(Aspergillus) 유래 미정제 효소 추출물을 무궁화 추출물에 처리하는 단계를 포함하는 아스퍼질러스(Aspergillus) 유래 효소 처리 무궁화 추출물(Enzyme-treated Mugunghwa mixture; ETHs) 제조방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 아스퍼질러스(Aspergillus)는 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 또는 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 (1) 단계는 미강을 함유하는 배지에서 배양할 수 있고, 상기 (4) 단계는 20 내지 60℃에서 pH 4.5 내지 8.0으로 12 내지 72시간 동안 처리하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 따라 제조된 아스퍼질러스(Aspergillus) 유래 효소 처리 무궁화 추출물(Enzyme-treated Mugunghwa mixture; ETHs)을 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
< 실험예 >
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. 무궁화 준비
한국에서 "목근피(Hibisci cortex)"는 무궁화(Hibiscus syriacus L.)의 뿌리 및 줄기 껍질부분을 뜻하는 명칭이다. 본 발명에서는 목근피(Hibisci cortex) 샘플을 "무궁화(Mugunghwa)"로 명명하였다.
무궁화(4kg ; BestHerb, Korea)는 80℃의 물로 4시간 동안 추출하였는데, 건조된 무궁화와 용매인 물의 비율은 1:10(w/v)이다. 상기 추출물은 여과에 의해 수집되었고, 용매는 진공 하에서 증발시켰다.
2. 누룩으로부터 아스퍼질러스 ( Aspergillus ) 균주의 분리
(1) 형태학적 특성
누룩 샘플은 대한민국의 여러 도시에서 수집되었다. 샘플 전처리를 위해, 샘플을 준비하고, 10ml 멸균 증류수로 현탁하였다. 그 후, 200rpm으로 10분 동안 회전시켰다. 무균상태에서 상기 스톡(stock)으로부터 멸균 증류수에 10-4-10-6으로 희석 배수를 달리하여 준비하였다. 연속적으로 희석된 샘플은 malt extract agar (Difco) 상에 접종하였다.
그 후, 페트리 플레이트를 30±1℃에서 3-4일 동안 배양하였다. 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 및 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) 콜로니들을 골라내 potato dextrose agar(PDA, Difco)로 옮겼다. 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)는 검은색 포자로 덮힌 녹색을 나타냈고, 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae)는 중심이 흰색이고 주변은 연두색을 나타냈다. 튜브(약 4.5-5.0 ml 배지)를 솜으로 막고, 121℃에서 15분 동안 멸균시켰다. 그 후, 상기 튜브들은 표면적을 증가시키기 위해 세워서 유지하였다. 페트리 플레이트로부터 소량의 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 및 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) 분생자(conidia)를 PDA slants에 접종하였고, 최대한의 포자발생을 위해 30℃에서 4-6일 동안 배양하였다. 배양물은 추후 연구를 위하여 4℃에 보관하였다.
(2) 분자 마커로서 ITS(Internal Transcribed Spacer 1 and 2) 서열 분석
게노믹 DNA의 추출은 상업적 게노믹 DNA 추출 키트(Solgent, 대한민국)를 사용하여 수행하였다. 증폭을 위하여, 기존에 알려진 2개의 올리고뉴클레오타이드 진균 프라이머를 사용하였다. 5.8S 유전자, ITS 1 및 ITS 2 비-코딩 영역을 증폭하기 위한, ITS 부위 프라이머(ITS 1, 5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3'; ITS 4, 5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT G-3')는 18S(ITS 1) 및 28S(ITS 4) rRNA 유전자의 보존 영역을 토대로 제작하였다. 정제된 PCR 산물은 Solgent Co. Ltd에서 서열분석하였다. 관련 분류군의 ITS rRNA 유전자 서열은 GenBank 데이터베이스 및 query-based BioloMICS 데이터베이스로부터 얻었다(www.fungalbarcoding.org).
3. 아스퍼질러스 ( Aspergillus ) 균주로부터 효소 추출
(1) 셀룰라아제(cellulase)-풍부한 미정제 효소(crude enzymes)를 위한 전처리 과정
리그노셀룰로오스성 바이오매스(lignocellulosic biomass)의 경우, 수산화나트륨(sodium hydroxide) 용액을 사용하여, 리그닌 층을 제거하고 셀룰로오스를 방출시키기 위한 전처리가 필요하다. NaOH 용액은 구조적 결합의 파괴, 셀룰로오스 결정의 감소 및 중합 감소를 유도한다. 5g 미강(rice bran)을 100ml의 2% NaOH 용액이 담긴 2개의 별도의 250ml 플라스크에 넣고, 80℃에서 3시간 동안 두었다.
(2) 효소 생산을 위한 배지 제조
250ml 플라스크에, 100ml yeast extracts agar(Difco)를 탄소원(미강) 40g 및 카복시-메틸셀룰로오스(carboxy-methylcellulose; CMC, 대조군) 20g에 각각 첨가하였다. 그 후, 배지의 pH는 5에 맞추었다. 배지는 121℃에서 15분 동안 멸균시켰다. 솜으로 단단히 막고, 진탕배양기로 30℃에서 5일 동안 150rpm으로 배양하였다.
(3) 효소 추출
배양액은 거즈를 사용하여 여과하였고, 여과액은 6000rpm에서 20분 동안 원심분리하였으며, 상등액은 세포 외 효소원으로 사용하였다. 정제를 위해, 활성 효소는 ion-exchange resin (QAE-sephadex® A50 및 Sp-sephadex® C50, Sigma, St Louis, USA) 상에 로딩하였고, NaCl buffer(Sigma, St Louis, USA)로 용출하였다.
(4) 효소/단백질 농도 측정
단백질의 농도는 bovine serum albumin (BSA)를 이용한 Bradford Coomassie brilliant blue assay에 따라 측정하였고, 컬럼 용출 분획 내 단백질은 595nm에서 관측하였다.
(5) 셀룰라아제 활성 분석
셀룰라아제 활성은 0.02 M 아세테이트 완충액(pH 5.2)에 녹인 셀룰로오스 분말(cellulose powder; CMC)을 기질(0.05%, w/v)로 하여 분석하였다. 환원당의 양은 3, 5-디니트로살리실산(3, 5-dinitrosalicylic acid; DNS) 방법으로 측정하였다.
4. 아스퍼질러스 ( Aspergillus ) 효소를 사용한 무궁화의 생물전환
50㎕ 아세테이트 완충액(20mM, pH 5.0)에 녹인 0.1g 무궁화 및 10-4 ㎍/mL 미정제(crude) 아스퍼질러스(Aspergillus) 효소를 혼합하여 반응 혼합물(10 ml)을 제조하였다(도 1). 그 후, 여러 시간 조건(24h, 48h 및 72h)에서 55℃로 반응시켰다.
HPLC 시스템(UltiMate 3000, Dionex)은 생물전환 전후의 무궁화를 분석하는데 사용되었다. 샘플은 Thermo, acclaim 120 column(C18, 4.6×250 mm, 5㎛)에 적용하였다. 이동상은 0.1% 포름산:물 및 0.1% 포름산:아세토니트릴을 사용하였다. 주입 부피는 10㎕, 유량은 1.0 mL/min 이었고, UV 흡광도는 203nm, 254nm, 280nm 및 320nm에서 관측하였다.
5. 항-산화 분석
자유-라디컬-소거능 활성을 2, 2-디페닐-1-피크릴히드라질(2, 2-diphenyl-1-picrylhdrazyl; DPPH) 분석을 통해 측정하였다. 증류수에 녹인 20㎕ 샘플을 96-웰 플레이트에 넣고, 메탄올에 녹인 180㎕ DPPH(0.2 mM)를 첨가하였다. 암소에서 30분 반응 후, 흡광도를 520nm에서 마이크로플레이트 리더로 기록하였다(MolecularDevices E09090; San Francisco, CA, USA). 무궁화, 효소 처리된 무궁화(Enzyme-treated Mugunghwa mixture; ETHs) 및 알부틴은 1, 10, 50, 100 및 250 ㎍/mL의 다양한 농도에서 개별적으로 실험하였다.
6. 세포 배양 및 MTT 분석
정상 인간 진피 섬유아세포(normal human dermal fibroblasts; NHDF)는 건강하고 젊은 남자 기증자의 피부 생검을 통해 얻었다(MCTT Core, Inc., Seoul, Korea). NHDF는 10% 열-불활화된 FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 dulbecco's modified eagle medium (DMEM)에서 37℃, 5% CO2 하에서 배양하였다. 세포들은 100-mm 배양 접시에서 배양하였고, 80% 이상 빽빽해지면(confluence) 35-mm 배양 접시에 접종하였다.
NHDF의 생존능에 있어 무궁화 및 ETHs의 효과를 시험하기 위해서, MTT 분석을 수행하였다. MTT 분석은 세포 생존능(cell viability; CV)을 측정할 수 있는 색도 분석이다. 570nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 웰 당 CV는 다음의 식으로 계산하였다. CV(%)=(처리한 웰의 OD 수치/미처리 웰의 OD 수치)×100.
7. UVB 조사 및 샘플 처리
NHDF가 70% 이상 빽빽해지면, 35 mm 배양 접시에서 서브-배양된 세포(1.0×105 세포)는 포스페이트 완충된 식염수(PBS)로 2번 헹궜다. 그 후, 세포들은 UVB 조사기(Bio-Link BLX-312; Vilber Lourmat GmbH, France)를 사용하여 UVB(150mJ/cm2)를 조사하였다. 모든 조사는 PBS 없이 수행하였다. UVB 조사 후, 세포들을 PBS로 3번 씻어냈고, 즉시 무혈청 배지에서 무궁화/ETHs 첨가 유무에 따라 48시간 더 처리하였다. UVB 미-조사된 세포는 UVB 조사 없이 동일한 배양 조건을 유지하였다.
8. ELISA
72시간 후, MMP-1, MMP-3, IL-6 및 타입 I 프로콜라겐 생산을 측정하기 위해 상등액을 수집하였다. 실험은 상업적으로 구할 수 있는 ELISA 키트를 사용하여 측정하였다. 각각의 샘플은 3번 반복하여 분석하였다.
9. RT- PCR
TRIZOL 시약(Invitrogen Life Technologies, CarIsbad, CA)을 사용하여, NHDF로부터 총 RNA는 수확하였다. 200 유닛의 역전사 효소 및 0.5 ㎍/μL oligo-(dT)15 primer(Bioneer Co., Korea)를 사용하여, 5㎍의 RNA를 역전사시켰다. 상기 반응은 42℃에서 60분 동안 수행하였고, 94℃에서 5분 동안 마무리하였다. 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction; PCR) 증폭은 PCR premix (Bioneer)를 이용하여 수행하였고, 반응에 사용한 프라이머는 다음과 같다. 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나아제(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; GAPDH), sense 5'-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3', antisense 5'-CCA CCA CCC TGT TGC TGT AG-3'; MMP-1, 5'-TGC GCA CAA ATC CCT TCT AC-3' 및 5'-TTC AAG CCC ATT TGG CAG TT-3'; 및 타입 I 프로콜라겐, forward 5'-CTC GAG GTG GAC ACC ACC CT-3', reverse 5'-CAG CTG GAT GGC CAC ATC GG-3'.
10. 웨스턴 블랏 분석
세포들을 4시간 추가로 배양하였다. 다음으로, Lysis buffer (50 mM Tris-Cl, pH 8.0, 0.1% SDS, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.02% 소듐 아지드, 0.5% 소듐 데옥시콜레이트, 100 ㎍/mL PMSF, 1 ㎍/mL 아프로티닌 및 포스파타아제 억제제)에서 세포들을 용해시켰고, 12,000g로 7분 동안 원심분리시켰다. 웨스턴 블랏 분석을 위해, 용해물은 균질화시킨 후 Bradford reagent(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 측정하였다. 동등한 양의 단백질을 10% 또는 15% 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 젤(SDS-PAGE) 상에서 분리시켰고, 니트로셀룰로오스 멤브레인(Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK)으로 옮겼다. 그 후, 1시간 동안 상온에서 TBST (50 mmol/L Tris-HCL, PH 7.5, 150 mmol/L NaCl 및 0.1% Tween 20)에 녹인 5% non-fat milk와 반응시켜 비-특이적 결합을 차단하였다. 멤브레인은 밤새도록 4℃에서 특정 1차 항체로 반응시켰다. 특정 1차 항체는 다음과 같다. mouse polyclonal antibodies against β-actin, p-c-Jun, p-c-Fos 및 rabbit polyclonal antibodies against pERK, p-JNK 및 p-p38. 그 후, 멤브레인은 TBST 완충액으로 3번 씻어냈고, 2차 항체(Santa Cruz Biotechnology Inc., CA, USA)로 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 최종적으로, 단백질 수준은 chemiluminescence detection ECL reagents (Fujifilm, LAS-4000, Tokyo, Japan) 및 ImageMasterTM 17 2D Elite software, version 3.1 (Amersham Pharmacia Biotech, NJ, USA).
< 실시예 1> 무궁화에 생물전환기술을 적용한 효소 처리된 무궁화 추출물(Enzyme-treated Mugunghwa mixture; ETHs ) 제조
1. 아스퍼질러스 균주의 ITS 유전자 서열 분석 및 선별
217 종 아스퍼질러스(Aspergillus) 균주의 rDNA ITS1-5.8S-ITS2 영역을 증폭하기 위해서, ITS1 및 ITS4의 범용 프라이머를 사용하여 대략 600 bp의 단편을 얻어냈다. 증폭된 단편의 염기서열 분석을 통해 균주를 동정하였다. 누룩 샘플로부터 분리된 우점종 진균은 아스퍼질러스(Aspergillus) sp. (주로, 아스퍼질러스 오리재), 피치아(Pichia) sp., 리조푸스(Rhizopus) sp., 뮤코(Mucor) sp. 및 사카로마이콥시스(Saccaromycopsis) sp.로 각각 36%, 25%, 15%, 5% 및 4%를 차지하였다. 분리된 모든 균주 중에서, 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) 및 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)에 속하는 8종의 아스퍼질러스(Aspergillus) 균주의 유사도를 표 1에 나타냈다. ITS 유전자 서열 유사성은 데이터베이스의 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) 및 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) ITS 서열과 약 99% 유사도를 나타냈다.
Figure 112016086695117-pat00001
2. 아스퍼질러스 균주 미정제 효소의 셀룰라아제 활성
누룩 샘플로부터 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) 및 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)에 속하는 8종의 아스퍼질러스(Aspergillus) 균주를 분리하였다. 세포 외 효소(extracellular enzyme)를 추출하기 위해서, 상기 아스퍼질러스(Aspergillus) 균주를 배양한 후, 미정제 세포 외 효소를 추출하였다. 효소 활성은 분당 1μmol의 환원당을 생산하는 효소량으로서, 추출물 밀리리터 당 국제 단위(International Units; IU)로 표시하였다. 미강을 기질로 하여 아스퍼질러스(Aspergillus) 균주를 배양하면, 상기 미정제 세포 외 효소는 풍부한 셀룰라아제 활성을 갖게 된다. 예상대로, 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) JU361T는 2.83 IU/mL로 가장 높은 셀룰라아제 활성을 나타냈으며, 그 뒤로 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) JU005T가 2.11 IU/mL를 나타냈다(표 1).
3. ETHs의 생물전환 공정의 최적화
효소 처리된 무궁화 추출물(Enzyme-treated Mugunghwa mixture; ETHs)을 제조하기 위하여, 무궁화 추출물의 생물전환 공정에 있어 다양한 인자들을 최적화하였다. 무궁화를 대신하여 카르복시-메틸 셀룰로오스(carboxy-methyl cellulose; CMC)를 대조군 기질로 사용하여 셀룰라아제가 풍부한 아스퍼질러스(Aspergillus) 효소의 생물전환 조건을 시험하였다. 생물전환 조건은 20-60℃ 및 pH 4.5-8.0의 범위에서 시험하였다. 도 2에서는 아스퍼질러스(Aspergillus) 효소에 의한 CMC에서 글루코스로의 생물전환율에 있어 온도 및 pH의 영향에 대해 나타냈다. 최대 생물전환 수율은 55℃ 및 pH 5.0에서 각각 80.4±0.03% 및 82.4±0.05%로 관측되었다. 상기 결과는 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) 및 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 유래 셀룰라아제 풍부한 효소가 약산성 환경하에서 더 안정성이 있다는 것을 나타낸다. 최대 생물전환은 최적 반응시간으로 24시간에서 가장 높은 글루코스 생산(80% 이상)을 나타냈다. 반응율에 있어 기질 농도에 따른 효과를 측정하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, CMC의 생물전환에 있어 최고 수율은 1.5㎍/mL이었다. 상기 결과를 종합하면, 최적 조건은 pH 5.0, 55℃, 1.5㎍/mL 기질 농도 및 24시간 반응시킨 경우인 것으로 나타났다(도 2).
4. 생물전환에 사용하기 위한 ETHs 제조 및 아스퍼질러스 효소
상기 균주들에서 세포 외 효소를 추출한 후, 생물전환은 pH 5.0, 55℃에서 24시간 배양하여 수행하였다. 무궁화는 8종류의 미정제 효소로 상기 최적화된 조건에서 처리하였고, 효소 처리된 무궁화 추출물(Enzyme-treated Mugunghwa mixture; ETHs)라고 명명하였다(표 1). 무궁화 및 ETHs(1-8)는 피부 항노화 활성 시험 및 추후 분석에 계속 사용되었다.
< 실시예 2> 무궁화 및 ETHs의 패턴 분석
무궁화 및 ETHs(1-8) 내 피부 노화 보호 효과를 나타내는 정확한 활성 화합물을 확인하기 위해서, HPLC 분석을 수행하였다. UV 검출기를 사용하여, 203, 254, 280 및 320 nm에 검출을 수행하였다(도 3). 280 및 320 nm에서 효과적으로 검출되었다. 모든 샘플 간 유의성 있는 차이점은 280 nm에서 명확하게 검출되었다.
< 실시예 3> 무궁화 및 ETHs의 항산화 활성
무궁화 및 ETHs(1-8)의 자유 라디컬 소거 활성은 DPPH 분석을 통해 측정하였다. 도 4에서 나타낸 바와 같이, 무궁화 및 ETHs(1-8)의 자유 라디컬 억제 활성은 용량-의존적 방식(1, 10, 50, 100 및 250㎍/mL)으로 증가하였다. 또한, 몇몇 ETHs(1, 3 및 6)의 자유 라디컬 소거 활성은 양성 대조군으로 사용한 알부틴(arbutin) 보다 더 높았다. 무궁화 및 ETHs(1-8)의 IC50 수치는 각각 35.94, 90.69, 38.05, 177.61, 259.20, 37.28, 95.91 및 72.42 ㎍/mL로 나타났다. 높은 항산화 활성을 가진, 무궁화 및 ETHs는 피부 광노화 예방을 위한 좋은 후보 물질이다.
< 실시예 4> NHDF에서 UVB -조사 피부 노화에 대한 무궁화 및 ETHs의 효과
1. 세포 생존능
무궁화 및 ETHs(1-8)이 세포 생존능에 영향을 미치는지 확인하기 위해서, 무궁화 및 ETHs(10, 100 및 250㎍/mL)로 24시간 동안 처리한 NHDF로 MTT 분석을 수행하였다. 도 5A에서 나타낸 바와 같이, 몇몇 ETHs(2, 4 및 5)는 농도가 증가할수록 세포 생존능이 향상되었다. 농도가 250㎍/mL 이상이면, 무궁화 및 ETHs는 NHDF에 세포독성을 나타냈다. 미-조사된 대조군 세포들은 100% 생존능을 나타냈다. 또한, 무궁화 및 ETHs(10-250㎍/mL)로 처리한 UVB-조사 및 미-조사된 세포들의 세포 보호 효과를 측정하였다. UVB 조사(144 mJ/cm2) 처리된 세포의 생존능은 미-조사된 세포에 비해 약 80% 정도였다. UVB 조사(144 mJ/cm2) 처리된 세포의 생존능을 UVB 조사(144 mJ/cm2)되고 무궁화 및 ETHs(10-250㎍/mL)로 처리된 세포의 생존능과 비교하였다. ETH5(모든 농도)로 처리된 UVB 조사 세포의 생존능이 UVB만 조사한 세포의 생존능 보다 높았다. 이는 UVB 노출 하에서 ETH5 처리시 NHDF의 생존능이 더 높다는 것을 나타낸다(도 5B).
2. MMP -1 분비
UVB 손상된 피부에서 무궁화/ETHs의 효과를 확인하기 위해서, MMP-1의 세포 수준 분비에 대해 연구하였다. UVB를 조사 없이, 무궁화 및 ETHs(ETH7만 제외)를 처리시 미처리 세포(정상세포)와 비교하면 MMP-1 분비는 감소하였다(도 6A). 무궁화 및 ETHs는 MMP-1 분비를 억제하여 피부 노화 예방 효과를 나타냈다. 무궁화 및 ETHs(2, 3, 5 및 6)는 용량-의존적 방식으로 MMP-1 분비를 억제하였다. 하지만, ETH7은 MMP-1을 과-분비시켰다.
도 6B에 나타낸 바와 같이, UVB 조사된 세포(144 mJ/cm2)의 생존능은 정상 세포의 약 80% 정도였지만, UVB-조사 세포(대조군)는 UVB-미조사 세포보다 거의 4배 높게 MMP-1를 분비하였다. UVB 조사 후, 무궁화 및 ETHs(3, 5 및 8)를 250㎍/mL 처리하면, UVB만 조사된 세포보다 MMP-1 분비가 상당히 낮아졌는데, MMP-1의 잔여량이 각각 61.9%, 32.4%, 58.6% 및 21.7%였다. 다른 샘플인 ETHs(1, 2, 4, 6 및 7)를 UVB 조사된 NHDF에 처리하면 MMP-1 분비 수준에 차이를 나타냈는데, 심지어 MMP-1 분비 수준이 대조군 세포에 비해 높게 나타나기도 했다. 무궁화 및 ETHs(3, 5 및 8)의 MMP-1 하향 조절은 UVB 유도된 피부 노화에 있어 다른 신호전달 기작에 영향을 줄 수도 있다고 판단된다.
3. MMP -3 분비
진피 섬유아세포에서 UVB 조사는 MMP-3 발현을 유도하는데, 이는 피부 매트릭스 단백질인 스트로멜리신(stromelysin)의 붕괴와 관련되어 있다. MMP-3 분비에 있어 무궁화 및 ETHs의 효과를 ELISA kit로 확인하였다. 도 7에서는 무궁화 및 ETHs 처리 유무에 따른, UVB-조사 및 미조사된 세포에서의 MMP-3 분비 수준에 대해 나타냈다. 비-조사 조건에서는, 무궁화 및 ETHs(3, 5 및 8) 처리된 NHDF에서 MMP-3 신호전달 기작을 통한 피부 노화 예방 효과가 명백하게 나타났다.
예상대로, UVB 조사는 NHDF에서 MMP-3 발현을 크게 증가시켰는데, 비조사 세포에 비해 3배 정도 높게 나타났다. 무궁화 및 ETHs 처리된 NHDF는 UVB 노출된 대조군 세포보다 낮은 MMP-3 분비 수준을 나타냈다. 하지만, ETH1 및 ETH2는 낮은 MMP-3 억제 활성을 보였다. ETH6 및 ETH7은 10 및 100 ㎍/mL 농도에서 높은 억제 활성을 나타냈다. ETH7-처리된 세포는 고농도(250 ㎍/mL)에서 세포독성을 보였기 때문에, 다른 샘플에 비해 높은 MMP-3 분비를 나타냈다. 대조군에 비해, 용량-의존적 방식으로 무궁화 및 ETHs(3, 5 및 8)는 MMP-3 발현을 51.3%, 42.1%, 53.3% 및 91.0% 하향 조절시켰다. 종합하면, 무궁화 및 ETHs(3, 5 및 8)은 MMP-1 및 MMP-3 분자 신호 전달에 있어 피부 노화에 예방 및 보호 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
4. IL-6 생산
MMP-1 및 MMP-3 분비와 관련된 분석을 토대로, 무궁화 및 ETHs(3, 5 및 8)의 IL-6 생산에 대해 조사하였다. UVB 미조사시, ETH8-처리된 NHDF는 정상 세포보다 낮은 IL-6 생산 수준을 나타냈다. 무궁화 및 ETH3 처리된 NHDF는 정상 세포보다 거의 2배 높게 분비하였다. 도 8에서, UVB 조사된 세포는 IL-6 생산 수준에 있어 정상세포보다 2.4배 증가하는 것으로 나타났다. 무궁화 및 ETH8 처리된 NHDF는 대조군 세포에 비해 용량 의존적 방식으로 IL-6 생산 수준이 감소되는 것을 확인하였다. 무궁화 및 ETHs(3, 5 및 8) 중, IL-6 생산 감소에 있어 ETH8이 가장 높은 효과(250 ㎍/mL에서 70.7% 감소)를 나타내는 것으로 밝혀졌다.
5. 타입 I 프로콜라겐 발현
UVB를 조사하면, 건강한 피부를 유지하게 하는 콜라겐의 전구체인 타입 I 프로콜라겐 발현을 감소시킨다는 것은 잘 알려져 있다. 타입 I 프로콜라겐 발현에 있어 무궁화 및 ETHs의 효과를 확인하기 위해서, 발현 수준을 ELISA 키트로 분석하였다.
예상대로, 타입 I 프로콜라겐 수준은 UVB 조사 후 상당히 감소하였다. 하지만, UVB 조사된 세포를 250 ㎍/mL로 무궁화-처리한 세포에서는 타입 I 프로콜라겐 발현이 약한 것으로 나타났다. 무궁화 및 ETH8을 100 및 250 ㎍/mL 처리하면, 타입 I 프로콜라겐 발현이 2.0% 및 3.6%, 23.2% 및 75.4%로 각각 점차 증가하였다(도 9).
< 실시예 5> MMP -1 및 타입 I 프로콜라겐 mRNA 발현에 있어 무궁화 및 ETH8의 효과
144 mJ/cm2의 UVB에 노출시켜, 100 및 250 ㎍/mL의 무궁화/ETH8 처리된 NHDF에서 MMP-1 및 타입 I 프로콜라겐 mRNA 발현을 측정하였다. MMP-1 및 타입 I 콜라겐 C-펩타이드에 있어 ETH8의 효과를 확인하기 위해서, GAPDH mRNA 발현을 측정하였다. GAPDH는 하우스키핑 유전자로서 대조군으로 사용하였다.
도 10에서 나타낸 바와 같이, GAPDH mRNA는 모든 샘플에서 유사한 수준으로 나타났다. NHDF를 144 mJ/cm2의 UVB에 노출시키고, 100 및 250 ㎍/mL의 무궁화/ETH8로 처리하였다. RT-PCR 결과, NHDF에서 MMP-1 mRNA의 발현은 약한 수준으로 나타났으며, UVB를 조사하고, 샘플은 처리하지 않은 대조군 샘플에서는 MMP-1 mRNA의 발현이 증가하는 것을 확인하였다.
증가된 MMP-1 mRNA의 발현은 무궁화/ETH8 처리에 의해 용량-의존적 방식으로 감소하였다. ETH8-처리 세포에서, MMP-1 mRNA의 발현은 UVB만 조사한 세포 및 무궁화-처리한 세포보다 훨씬 낮았다. 특히, MMP-1 mRNA의 발현은 100 ㎍/mL에서 ETH8 처리 세포에서 62%, 250 ㎍/mL 처리 세포에서 93% 감소하였다(도 10A).
또한, 대조군과 비교시 UVB를 조사하면 타입 I 프로콜라겐 mRNA 발현은 상당히 감소하였다. 무궁화/ETH8 처리시, UVB 조사 후 NHDF에서는 대조군 세포와 비교하면 타입 I 프로콜라겐 mRNA 발현이 증가하는 것으로 나타났다. 100 및 250 ㎍/mL 농도로 ETH8를 처리하면, UVB만 조사한 세포와 비교시 타입 I 프로콜라겐 mRNA 발현이 각각 34% 및 112% 증가하였다(도 10B).
250 ㎍/mL 무궁화 및 ETH8 처리시, 타입 I 프로콜라겐 mRNA 발현은 정상 세포보다 상당히 높아진 반면, MMP-1 mRNA 발현은 정상세포보다 낮아졌다. RT-PCR 결과는 단백질 수준을 확인하는 ELISA 결과와 큰 차이가 없었다. 무궁화 및 ETH8은 MMP-1 mRNA 및 단백질 발현을 억제하여 타입 I 콜라겐 mRNA 및 단백질 발현을 증가시킬 수 있다. UVB-조사된 세포에서, ETH8은 MMP-1 발현을 상당히 감소시켰고, 타입 I 프로콜라겐 발현을 상당히 증가시켰는데, UVB 조사에 있어 ETH8은 활성 단백질 1(activator protein 1; AP-1) 활성화을 억제하는데 잠재적인 역할을 할 것으로 예상된다.
< 실시예 6> 광노화 기작에 있어 무궁화 및 ETH8의 효과
1. AP-1 활성화에 있어 무궁화 및 ETH8의 효과
활성 단백질 1(activator protein 1; AP-1) 활성화에 있어 무궁화 및 ETH8의 효과를 알아보기 위해서, c-Fos 및 c-Jun의 인산화 발현을 조사하였다. β-액틴은 웨스턴 블랏 분석에 있어 로딩 대조군으로 사용되었다. UVB 노출시, ETH8-처리된 세포가 AP-1 활성화를 감소시킨다면, ETH8은 UVB 조사에 의한 피부 광노화에 대항하는 NHDF의 보호제로 고려될 수 있다.
도 11에서 나타낸 바와 같이, 유사한 수준의 β-액틴 하우스키핑 단백질 수준이 비-치명적 UVB 조사(144 mJ/cm2)에서 나타났다. 동일한 β-액틴 수준에 비해, 중간 수준의 p-c-Fos 및 매우 소량의 p-c-Jun이 정상세포에서 관측되었다. UVB를 조사하면, p-c-Fos 및 p-c-Jun의 단백질 수준은 크게 증가하였다. 250 ㎍/mL 무궁화 및 ETH8 처리된 세포는 UVB만 조사된 세포에 비해 p-c-Fos 및 p-c-Jun 수준을 크게 감소시켰다(도 11). 종합하면, ETH8은 MMP-1 및 타입 I 프로콜라겐 발현의 조절에 관여하여 역할을 수행하는데, 이는 피부 광노화에 있어 주름 억제제로서 크게 의미가 있다.
2. ERK , JNK 및 p38 활성화에 있어 무궁화 및 ETH8의 효과
MAPKs는 UVB-유도된 AP-1의 생성에 중요한 역할을 수행하므로, 분자 메카니즘을 통한 ETH8 샘플의 효과를 웨스턴 블랏팅을 사용하여 확인하였다. β-액틴은 웨스턴 블랏 분석에 있어서도 로딩 대조군으로 사용되었다.
p-JNK, p-ERK 및 p-p38와 같은 3 종류의 키나제 활성화는 정상 NHDF에서는 많이 관찰되지 않았다. UVB 조사 후, MARKs의 인산화는 ROS 발생에 따라 활성화될 수 있다. 도 12에서 나타낸 바와 같이, UVB-조사된 세포는 p-JNK, p-ERK 및 p-p38 수준이 증가하는 것을 확인할 수 있었는데, 100 및 250 ㎍/mL 농도로 처리한 무궁화 또는 ETH8는 p-JNK, p-ERK 및 p-p38의 활성화를 용량 의존적 방식으로 차단하였다. UVB 조사된 세포에서, ETH8은 MARKs의 활성화를 조절할 수 있고, UVB-유도된 타입 I 프로콜라겐 분해에 대항하여 잠재적인 보호 효과를 가져 올 수 있다.

Claims (14)

  1. 미강을 함유하는 배지에서 배양한 아스퍼질러스(Aspergillus) 배양액을 원심분리하여 수집한 상등액인, 셀룰라아제(cellulase) 활성을 갖는 아스퍼질러스(Aspergillus) 유래 미정제(crude) 효소 추출물로 처리한 무궁화 추출물(Enzyme-treated Mugunghwa mixture; ETHs)을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 아스퍼질러스(Aspergillus)는 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 또는 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae)인 것을 특징으로 하는 피부 주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 아스퍼질러스(Aspergillus) 유래 효소 처리 무궁화 추출물은 타입 I 프로콜라겐 단백질의 발현을 증가시키고, MMP-1 및 MMP-3 단백질의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 피부 주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 피부 주름은 UVB 조사에 의해 유도되는 것을 특징으로 하는 피부 주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
  7. 미강을 함유하는 배지에서 배양한 아스퍼질러스(Aspergillus) 배양액을 원심분리하여 수집한 상등액인, 셀룰라아제(cellulase) 활성을 갖는 아스퍼질러스(Aspergillus) 유래 미정제(crude) 효소 추출물로 처리한 무궁화 추출물(Enzyme-treated Mugunghwa mixture; ETHs)을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 예방 또는 개선용 약학 조성물.
  8. 미강을 함유하는 배지에서 배양한 아스퍼질러스(Aspergillus) 배양액을 원심분리하여 수집한 상등액인, 셀룰라아제(cellulase) 활성을 갖는 아스퍼질러스(Aspergillus) 유래 미정제(crude) 효소 추출물로 처리한 무궁화 추출물(Enzyme-treated Mugunghwa mixture; ETHs)을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 예방 또는 개선용 건강식품 조성물.
  9. (1) 미강을 함유하는 배지에서 아스퍼질러스(Aspergillus)를 배양하는 단계;
    (2) 상기 배양액을 여과하는 단계;
    (3) 상기 여과액을 원심분리하고 상등액을 수집하여 셀룰라아제(cellulase) 활성을 갖는 아스퍼질러스(Aspergillus) 유래 미정제(crude) 효소를 추출하는 단계; 및
    (4) 상기 아스퍼질러스(Aspergillus) 유래 미정제 효소 추출물을 무궁화 추출물에 처리하는 단계를 포함하는 아스퍼질러스(Aspergillus) 유래 효소 처리 무궁화 추출물(Enzyme-treated Mugunghwa mixture; ETHs) 제조방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 아스퍼질러스(Aspergillus)는 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 또는 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae)인 것을 특징으로 하는 아스퍼질러스(Aspergillus) 유래 효소 처리 무궁화 추출물 제조방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 무궁화 추출물은 목근피를 열수 추출한 것을 특징으로 하는 아스퍼질러스(Aspergillus) 유래 효소 처리 무궁화 추출물 제조방법.
  12. 삭제
  13. 제9항에 있어서, 상기 (4) 단계는 20 내지 60℃에서 pH 4.5 내지 8.0으로 12 내지 72시간 동안 처리하는 것을 특징으로 하는 아스퍼질러스(Aspergillus) 유래 효소 처리 무궁화 추출물 제조방법.
  14. 제9항의 방법에 따라 제조된 아스퍼질러스(Aspergillus) 유래 효소 처리된 무궁화 추출물(Enzyme-treated Mugunghwa mixture; ETHs).
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102126840B1 (ko) 2018-07-09 2020-06-25 대한민국 무궁화 꽃잎 추출물의 제조방법, 무궁화 꽃잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물 및 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 예방 또는 개선용 약학조성물
KR102432834B1 (ko) * 2019-11-28 2022-08-17 숙명여자대학교산학협력단 식품소재용 무궁화 조성물 및 이의 제조방법

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003104835A (ja) 2001-09-28 2003-04-09 Ichimaru Pharcos Co Ltd 化粧料組成物
JP2014088360A (ja) 2012-10-02 2014-05-15 Ito:Kk 外用組成物

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100449170B1 (ko) * 2002-01-21 2004-09-16 학교법인고려중앙학원 셀룰라아제(Cellulase)와 자일란아제(xylanase)를 생산하는 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) KK2 균주와 이에 의해 제조된 효소 및 고체 배양물
KR101684673B1 (ko) * 2013-11-07 2016-12-08 (주)아모레퍼시픽 효소처리 유채 추출물을 포함하는 조성물

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003104835A (ja) 2001-09-28 2003-04-09 Ichimaru Pharcos Co Ltd 化粧料組成物
JP2014088360A (ja) 2012-10-02 2014-05-15 Ito:Kk 外用組成物

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Biomolecules & Therapeutics,제18권,3호,300-307면(2010.07.31.)*
Food & Function,제5권,2호,265-274면(2013.10.31.)*

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20240023246A (ko) 2022-08-10 2024-02-21 대한민국(산림청 국립산림과학원장) 무궁화 추출물을 포함하는 면역 증진용 조성물

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