KR102366932B1 - 무궁화 연화 꽃잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염증, 보습, 피부 주름 개선 및 피부 상처 재생용 조성물 - Google Patents

무궁화 연화 꽃잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염증, 보습, 피부 주름 개선 및 피부 상처 재생용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 삼천리, 자명, 및 태원순자 품종으로 이루어진 3종 품종의 무궁화 연화 꽃잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염증, 보습, 피부 주름 개선 및 피부 상처 재생용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 세포독성이 없고, 우수한 항산화 활성을 나타내며, 산화질소 생성을 억제하여 우수한 항염증 활성을 나타내고, 피부 보습과 피부 주름 개선에 우수한 효과가 있으며, 피부 상처 재생 촉진에 매우 효과적이므로, 항염증, 피부 보습, 피부 주름 개선, 및 피부 재생 촉진을 위한 화장료, 및 식품 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

무궁화 연화 꽃잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염증, 보습, 피부 주름 개선 및 피부 상처 재생용 조성물{Composition with Antioxidant, Anti-Inflammation, Skin Moisturizing, Anti-Wrinkle, and Skin Regeneration Property Comprising Complex Extract of Hibiscus Syriacus Softened Petal as Active Ingredient}
본 발명은 무궁화 연화 꽃잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염증, 보습, 피부 주름 개선 및 피부 상처 재생용 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 삼천리, 자명, 및 태원순자 품종으로 이루어진 3종 품종의 무궁화 연화 꽃잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염증, 보습, 피부 주름 개선 및 피부 상처 재생용 조성물에 관한 것이다.
생물체의 항상성(homeostasis)을 유지하는 과정에서 중요한 역할을 담당하고 있는 물질 중 일부가 각종 생물체 유래의 생리 활성 물질이다. 지금까지 수많은 생리 활성 물질에 관해 많은 연구가 진행되고 있으며, 그 중, 미생물, 식물, 또는 동물체 등에서 분리된 생리 활성을 갖는 물질에 관한 연구는 생명과학 및 의학 분야에서 매우 중요한 영역이다.
활성산소종(reactive oxygen species, ROS)의 과생산은 UVB 노출 환경에서 보고된 바 있고, UVB 노출과 연관된 신호전달 체계는 MAPKs(mitogen activated protein kinases), ERK(extracellular signal-regulated kinase), p38 카이나아제, 및 JNK(c-Jun amino-terminal kinase) 등의 단백질과 관련되어 있는데, NF-ĸB 및 AP-1 전사인자의 발현증가를 유도한다. 또한, AP-1 단백질은 MMP(matrix metalloproteinase) 유전자의 활성과 관련되어 있고, NF-ĸB 단백질은 인터루킨과 같은 전염증 사이토카인(proinflammatory cytokines)의 발현에 영향을 미친다.
한편, 염증 반응은 세포 또는 조직의 손상이나 박테리아, 곰팡이, 바이러스, 다양한 종류의 알레르기 유발물질 등의 외부감염원에 감염되었을 때 국소 혈관과 체액 중 각종 염증 매개 인자 및 면역세포가 관련되어, 효소 활성화, 염증 매개 물질 분비, 체액 침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등 일련의 복합적인 생리적 반응과 홍반, 부종, 발열, 통증 등 외적 증상을 나타낸다. 평상시의 염증 반응은 외부감염원을 제거하고 손상된 조직을 재생하여 생명체 기능 회복 작용을 하지만, 항원이 제거되지 않거나 내부물질이 원인이 되어 염증 반응이 과도하거나 지속해서 일어나면 오히려 점막 손상을 촉진하고, 그 결과 일부에서는 암 발생 등의 질환을 이끈다.
염증의 발생 원인으로서는 다양한 생화학적인 현상이 관여하고 있는 것으로 알려져 있는데, 특히 일산화질소(Nitric Oxide; NO)를 발생시키는 효소인 산화질소 합성 효소(Nitric Oxide Synthase; NOS)와 프로스타글란딘의 생합성과 관련된 효소들이 염증 반응을 매개하는 데 있어서 가장 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서 L-아르기닌으로부터 일산화질소를 생성시키는 효소인 산화질소 합성효소(NOS)나, 아라키돈산으로부터 프로스타글란딘 등을 합성하는데 관련된 효소인 사이클로옥시게나아제(COX)의 활성 저해를 통해 염증을 차단하는 것이 염증 치료제 개발에 목표가 되고 있다.
또한, 일반적으로 피부에 사용되는 보습용 화장료 조성물은 사람의 모발이나 피부 등에 수분을 일정량 유지함으로써 부드럽고 생기있게 하며, 갈라짐, 건조함 등의 손상을 방지해주는 역할을 한다. 즉, 피부 보습용 화장료 조성물은 피부나 모발에 일정량 이상의 수분을 공급하거나 수분이 유지함으로써 피부나 모발을 미화하고, 건강하게 유지하기 위한 목적으로 사용된다. 피부는 수분 유지에 필수적인 기능을 하는 기관으로, 수분 조절에 대략 2/3 정도의 비중을 담당하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 식품, 화장품 분야에서는 수분의 공급, 유지, 즉 보습과 관련된 기능성 연구가 활발하게 진행되고 있다. 또한, 최근에는 천연물 등으로부터 얻은 생리 활성 물질을 화장료에 도입하여 피부 자체의 고유 방어 기능을 더욱 강화함으로써 피부의 보습력을 증가시키는 화장품의 개발이 활발하게 진행되는 추세이다.
또한, 피부 주름은 피부 수분함량, 콜라겐 함량 및 외부 환경에 대한 면역력 등 여러 가지 요소들에 의해 영향을 받는 것으로 알려져 있으며, 이중 주름의 형성에 가장 큰 영향을 미치는 것은 콜라겐의 생성량 및 콜라겐 분해 효소인 콜라게네이즈의 발현과 활성이다.
콜라겐은 피부 진피층에 존재하는데, 피부 전체 건조 중량의 약 70 내지 80%를 차지하는 엘라스틴과 함께 피부에 탄력을 부여하는 주요 성분으로 알려져 있다. 콜라겐은 자연 노화에 따른 세포활성 저하와 같은 내부 요인에 의해 감소되고, 여러 유해 환경에서의 스트레스 증가나 태양 광선에 의한 활성 산소 종의 증가와 같은 외부 요인에 의하여 생합성이 감소되거나, 분해가 촉진되고 있다.
노화된 피부에서 콜라겐 및 엘라스틴의 붕괴는 주로 MMP 단백질과 같은 그 분해 효소의 증가된 발현에 의해 야기된다. 또한, 전염증 사이토카인은 콜라겐의 합성을 방해하고, 콜라겐의 붕괴를 촉진시킨다. 타입 I 콜라겐은 연결 조직의 세포외 기질에서 가장 풍부한 단백질이다. 세포외 기질에는 타입 III, V, 및 VII 콜라겐, 엘라스틴, 프로테오글라이칸, 파이브로넥틴과 같은 다른 유형의 단백질을 포함한다.
타입 I 콜라겐 단백질의 발현 수준을 조절하는 것은 피부 광노화를 예방하는데 있어서 가장 중요한 인자이다. UVB의 조사는 TGF-β/Smad 신호전달 체계의 억제를 통해 피부 섬유아세포에서 콜라겐 전구체인 프로콜라겐(procollagen)의 발현을 감소시키게 된다. 또한, TGF-β1 신호전달 체계는 인간 피부 섬유아세포에서 세포외 기질의 합성을 조절하는 중요한 인자의 하나이다. AP-1 및 MAPKs 인자에 의해 조절되는 활성산소종(ROS)의 생성 및 MMP 단백질의 발현은 피부 광노화 연구에 있어서 유용한 마커로 작용한다.
따라서, 생체에 안전하고, 유효성분이 안정하며, 무엇보다도 기존의 염증 개선, 보습, 피부 주름 개선 및 피부 재생 효과가 있는 것으로 알려진 천연물질과 비교하여 효과가 더욱 우수한 소재의 개발이 절실히 요망되고 있다.
한편, 화장품 소재는 안전성, 효능, 물성 등이 균형을 이루어야 한다. 또한, 경제성 확보도 중요한 요인으로서 화장품용 소재는 다양한 개발 방법을 이용하여 피부 투과, 노화 억제, 생리활성, 안전성 및 물성을 최적화하여 개발하게 된다. 화장품과 식품 및 의약품의 경계가 무너지면서 화장품의 안정성과 의약품, 건강기능식품 등의 효과성을 겸비한 복합 기능성 원료 및 바이오 소재를 통해 다양한 코스메슈티컬 제품들이 높은 성장세를 이어가고 있다.
이러한 배경 아래에서, 본 발명자들은 피부 상태 개선에 대한 우수한 효과를 나타내는 천연소재들의 조합에 관하여 연구를 수행하였으며, 종래 항염증, 보습, 피부 주름 개선, 및 피부 상처 재생에 효과가 있는 것으로 알려진 무궁화의 효과를 더욱 개선시키기 위해 예의 연구노력한 결과, 무궁화의 꽃잎을 연화시키는 방식과, 삼천리, 자명, 태원순자의 3종 품종을 혼합하는 방식을 동시에 적용하는 경우, 무궁화 추출물의 항염증, 피부 보습, 피부 주름 개선, 및 피부 상처 재생 촉진 활성이 현저하게 개선되었음을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.
KR 10-1977954 B1, 무궁화 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 조성물 KR 10-1967922 B1, 무궁화 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 보습용 화장료 조성물 KR 10-2019-0088664 A, 식물 복합추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 탄력 및 주름 개선용 화장료 조성물
따라서, 본 발명의 주된 목적은 항염증, 피부 보습, 피부 주름 개선, 및 피부 상처 재생에 우수한 효과를 나타내는 무궁화 3종 품종의 연화 꽃잎 추출물을 유효성분으로 하는 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 삼천리, 자명, 및 태원순자 품종으로 이루어진 3종 품종의 무궁화 연화 꽃잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염증, 보습, 피부 주름 개선 및 피부 상처 재생용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 종래 피부상태 개선의 효과가 알려진 식물 추출물의 활성을 더욱 개선시키는 연구를 수행하였으며, 종래 항산화, 항염증, 보습 및 피부 주름 개선 활성이 알려진 무궁화 추출물을 대상으로 그 효과를 더욱 개선하기 위해 연화 공정을 개선하여 항산화 항염증 및 보습 활성이 더욱 개선되는 것을 확인하였으며, 무궁화 품종별 효과를 확인하는 과정에서 삼천리, 자명, 및 태원순자 품종을 조합하여 추출하는 경우 이들 3개 품종의 조합에 따른 시너지 효과를 나타내는 것을 확인하였고, 이를 통해 삼천리, 자명, 및 태원순자 품종으로 이루어진 3종 품종의 무궁화 연화 꽃잎 추출물이 피부 상태 개선의 목적으로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 "무궁화(Hibiscus syriacus)"는 한반도 전역에서 자생하는 쌍떡잎식물 아욱목 아욱과의 낙엽관목을 의미한다. 본 발명의 상기 무궁화는 천연, 잡종 또는 변종 식물의 꽃으로부터 추출될 수 있다.
본 발명의 상기 무궁화 품종은 삼천리, 자명, 및 태원순자 품종을 조합하여 사용하는 것을 특징으로 하는데, 상기 삼천리 품종은 품종보호권 등록번호 제1481호로 2006년 3월 8일 등록되어 현재 소멸된 무궁화 품종이고, 상기 자명 품종은 품종보호권 등록번호 제5778호로 2015년 11월 23일 등록되어 현재 ㈜에스디생명공학이 품종보호권을 보유하고 있는 품종이며, 상기 태원순자 품종은 품종보호권 등록번호 제4117호로 2012년 8월 27일 등록되어 현재 ㈜에스디생명공학이 품종보호권을 보유하고 있는 품종이다.
상기 용어 "무궁화 연화 꽃잎"은 무궁화 꽃잎을 구연산 수용액에 혼합한 후, 70∼90℃로 가열하는 연화 공정을 거쳐 제조한 꽃잎을 말한다.
본 발명의 상기 무궁화 연화 꽃잎의 연화에 있어서, 상기 무궁화 연화 꽃잎은 무궁화 꽃잎을 1~2%(v/v) 구연산(citric acid) 용액에 첨가한 후, 60~80℃에서 1~3시간 동안 가온하면서 꽃잎 조직을 연화하는 것이 항산화, 항염증, 보습, 피부 주름 개선 및 피부 상처 재생의 활성을 증진시키는데 있어서 바람직하다.
본 발명에서 용어 "염증"은 생체 조직이 손상되었을 때에 체내에서 일어나는 방어적 반응을 총칭하는 의미로 사용되며, 구체적으로 외상이나 화상, 세균 침입 따위에 대하여 몸의 일부에 충혈, 부종, 발열, 통증을 일으키는 증상을 의미한다. 또한, 본 발명에서 "염증성 질환"은 염증을 주병변으로 하는 질병을 총칭하는 의미로서, 본 발명에서 상기 염증성 질환은 산화질소(NO) 매개 염증성 질환인 것을 특징으로 한다.
또한, 용어 "피부 보습"은 피부에 수분감을 증가시켜주고, 촉촉한 상태를 유지시키는 것을 의미한다.
또한, 용어 "피부 주름"이란, 피부가 쇠하여 생긴 잔줄을 의미하는데, 유전자에 의한 원인, 피부 진피에 존재하는 콜라겐의 감소, 외부 환경 등에 의해 유발될 수 있다. 본 발명에서 "피부 주름 예방 또는 개선"이란, 피부에 주름이 생성되는 것을 억제 또는 저해하거나, 이미 생성된 주름을 완화하는 것을 말한다.
또한, 본 명세서에서 "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나, 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "추출물"은 식물의 추출 처리에 따라 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다. 본 발명의 상기 추출물은 바람직하게 추출 후 건조 분말 형태로 제조되어 사용될 수 있다.
본 발명의 상기 무궁화 연화 꽃잎의 추출에 있어서, 추출하는 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다. 상기 추출방법의 비제한적인 예로는, 열수 추출법, 초음파 추출법, 여과법, 환류 추출법 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 수행되거나 2종 이상의 추출방법을 병용하여 수행될 수 있다.
본 발명에서 상기 무궁화 연화 꽃잎을 추출하는데 사용되는 추출 용매의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 추출 용매의 비제한적인 예로는 물(정제수); 메탄올, 에탄올, 프로필알코올, 부틸알코올 등의 C1 내지 C4의 저급 알코올; 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 등의 다가 알코올; 및 메틸아세테이트, 에틸아세테이트, 아세톤, 벤젠, 헥산, 디에틸에테르, 디클로로메탄 등의 탄화수소계 용매; 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 바람직하게, 물, 저급알코올, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸아세테이트를 단독으로 사용하거나 2종 이상 혼합하여 사용할 수 있다.
본 발명에서 열수 추출 또는 냉침 추출한 추출물은 부유하는 고체 입자를 제거하기 위해 여과, 예를 들어 나일론 등을 이용해 입자를 걸러내거나 냉동여과법 등을 이용해 여과한 후, 그대로 사용하거나 이를 동결건조, 열풍건조, 분무건조 등을 이용해 건조하여 사용할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물에서, 상기 삼천리, 자명, 및 태원순자의 3종 품종은 3:0.5-2:0.5-2의 중량비로 혼합되는 것이 바람직하며, 3:1:1의 중량비로 배합되는 것이 더욱 바람직하다. 본 발명자들은 상기 삼천리, 자명, 및 태원순자의 3종 무궁화 품종의 꽃잎을 다양한 비율로 혼합하여 무궁화 연화 추출물을 제조하였으며, 3종 품종의 조합이 전반적으로 우수한 항산화, 항염증, 보습, 피부 주름 개선 및 피부 상처 재생 활성을 나타내는 것을 확인하였다.
본 발명의 화장료 조성물에서, 상기 3종 품종의 무궁화 연화 꽃잎 추출물은 염증 개선에 우수한 효과가 있는데, 구체적으로 일산화질소(NO) 생성 억제를 통해 항염증 활성을 나타내는 것을 특징으로 한다(도 8 참조).
본 발명의 상기 3종 품종의 무궁화 연화 꽃잎 추출물은 피부 보습에 우수한 효과가 있는데, 구체적으로 히알루론산 합성을 촉진하여 피부 보습 활성을 나타내는 것을 특징으로 한다(도 9 및 도 10 참조).
본 발명의 상기 3종 품종의 무궁화 연화 꽃잎 추출물은 MMP-1((matrix metallo-proteinase 1) 유전자의 발현을 억제하여 피부 주름 개선 활성을 나타내는 것을 특징으로 한다(도 11 참조).
또한, 본 발명의 상기 3종 품종의 무궁화 연화 꽃잎 추출물은 피부 상처 재생 촉진 활성을 나타내는 것을 특징으로 한다(도 12 및 도 13 참조).
본 발명의 화장료은 용액, 외용연고, 크림, 폼, 영양화장수, 유연화장수, 마스크 팩, 유연수, 유액, 메이크업베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린크림, 선오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패치 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체는 제형에 따라 다양하다.
본 발명의 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는, 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되며, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일이 이용될 수 있으며, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 비누인 경우에는 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알콜, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 삼천리, 자명, 및 태원순자 품종으로 이루어진 3종 품종의 무궁화 연화 꽃잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염증, 보습, 피부 주름 개선 및 피부 상처 재생용 식품 조성물을 제공한다. 상기 무궁화 연화 꽃잎 추출물과 염증, 피부 보습, 피부 주름 개선, 및 피부재생 촉진은 상기 화장료 조성물에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 식품 조성물은 염증 반응의 직접적인 매개 인자인 일산화질소(NO)의 생성을 억제하고, 피부 보습인자인 히알루론산의 생성을 효과적으로 촉진하며, MMP-1((matrix metallo-proteinase 1) 유전자의 발현을 억제하여 피부 주름 개선 활성을 나타내고, 피부 상처 재생에 우수한 효과가 있으므로 항염증, 피부 보습, 피부 주름 개선, 및 피부재생 촉진용 식품 조성물로 유용하게 사용될 수 있다. 상기 식품 조성물은 건강기능식품의 형태로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 식품 조성물은 3종 품종의 무궁화 연화 꽃잎 추출물의 분획물 또는 이의 가공물의 형태로 포함될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 유효성분 이외에 식품학적으로 허용 가능한 식품보조첨가제를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, "식품보조첨가제"란 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제형의 건강기능식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 식품보조첨가제의 예로는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 본 발명의 식품보조첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 식품 조성물에는 건강기능식품이 포함될 수 있다. 본 발명에 있어서, "건강기능식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법으로 제조 가능하며, 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다.
또한, 상기 건강기능식품의 제형 또한 건강기능식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 항염증, 피부 보습, 피부 주름 개선, 및 피부재생 촉진 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
본 발명의 건강기능식품이 취할 수 있는 형태에는 제한이 없으며, 통상적인 의미의 식품을 모두 포함할 수 있고, 기능성 식품 등 당업계에 알려진 용어와 혼용이 가능하다. 아울러 본 발명의 건강기능식품은 당업자의 선택에 따라 식품에 포함될 수 있는 적절한 기타 보조 성분과 공지의 첨가제를 혼합하여 제조할 수 있다. 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 본 발명에 따른 3종 품종의 무궁화 연화 꽃잎 추출물을 주성분으로 하여 제조한 즙, 차, 젤리 및 주스 등에 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 동물을 위한 사료로 이용되는 식품도 포함된다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 삼천리, 자명, 및 태원순자 품종으로 이루어진 3종 품종의 무궁화 연화 꽃잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염증, 보습, 피부 주름 개선 및 피부 상처 재생용 조성물을 제공한다.
(b) 본 발명의 조성물은 세포독성이 없고, 우수한 항산화 활성을 나타내며, 산화질소 생성을 억제하여 우수한 항염증 활성을 나타내고, 피부 보습과 피부 주름 개선에 우수한 효과가 있으며, 피부 상처 재생 촉진에 매우 효과적이므로, 항염증, 피부 보습, 피부 주름 개선, 및 피부 상처의 재생 촉진을 위한 화장료, 및 식품 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 삼천리 품종 무궁화 꽃잎 추출물과 무궁화 연화 꽃잎 추출물을 각각 농도별로 처리한 후, DPPH 라디칼 소거 활성을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 삼천리 품종 무궁화 꽃잎 추출물과 무궁화 연화 꽃잎 추출물을 각각 농도별로 처리한 후, ABTS 라디칼 소거 활성을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 3은 연화처리된 무궁화 품종별 연화 꽃잎 추출물(실시예 1-2, 1-4, 및 1-6)과, 이들 품종의 복합 연화 꽃잎 추출물(실시예 1-7)을 각각 농도별로 처리한 후, DPPH 라디칼 소거 활성을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 연화처리된 무궁화 품종별 연화 꽃잎 추출물(실시예 1-2, 1-4, 및 1-6)과, 이들 품종의 복합 연화 꽃잎 추출물(실시예 1-7)을 각각 농도별로 처리한 후, ABTS 라디칼 소거 활성을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 5는 삼천리 품종 무궁화 꽃잎 추출물과 무궁화 연화 꽃잎 추출물을 각각 농도별로 처리한 후, 활성산소종(ROS, Reactive Oxygen Species) 생성량을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 6은 연화처리된 무궁화 품종별 연화 꽃잎 추출물(실시예 1-2, 1-4, 및 1-6)과, 이들 품종의 복합 연화 꽃잎 추출물(실시예 1-7)을 각각 농도별로 처리한 후, 활성산소종(ROS, Reactive Oxygen Species) 생성량을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 7은 연화처리된 무궁화 품종별 연화 꽃잎 추출물(실시예 1-2, 1-4, 및 1-6)과, 이들 품종의 복합 연화 꽃잎 추출물(실시예 1-7)을 각각 농도별로 처리한 후, RAW 264.7 세포의 생존율을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 8은 연화처리된 무궁화 품종별 연화 꽃잎 추출물(실시예 1-2, 1-4, 및 1-6)과, 이들 품종의 복합 연화 꽃잎 추출물(실시예 1-7)을 각각 농도별로 처리한 후, 산화질소 생성량 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 9는 삼천리 품종 무궁화 꽃잎 추출물과 무궁화 연화 꽃잎 추출물을 각각 농도별로 처리한 후, 히알루론산 생성량 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 10은 연화처리된 무궁화 품종별 연화 꽃잎 추출물(실시예 1-2, 1-4, 및 1-6)과, 이들 품종의 복합 연화 꽃잎 추출물(실시예 1-7)을 각각 농도별로 처리한 후, 히알루론산 생성량 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 11은 연화처리된 무궁화 품종별 연화 꽃잎 추출물(실시예 1-2, 1-4, 및 1-6)과, 이들 품종의 복합 연화 꽃잎 추출물(실시예 1-7)을 각각 농도별로 처리한 후, MMP-1 단백질 생성량 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 12는 연화처리된 무궁화 품종별 연화 꽃잎 추출물(실시예 1-2, 1-4, 및 1-6)과, 이들 품종의 복합 연화 꽃잎 추출물(실시예 1-7)을 각각 농도별로 처리한 후, 피부 상처 재생률을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 13은 연화처리된 무궁화 품종별 연화 꽃잎 추출물(실시예 1-2, 1-4, 및 1-6)과, 이들 품종의 복합 연화 꽃잎 추출물(실시예 1-7)을 각각 농도별로 처리한 후, 재생된 피부세포의 형태적인 모양을 촬영한 사진이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1. 무궁화 꽃잎 추출물 및 무궁화 연화 꽃잎 추출물의 제조
1-1. 삼천리 품종의 꽃잎 추출물 제조
무궁화 품종 중 삼천리 품종의 꽃을 채취하여 꽃잎만을 분리 작업하였다.
분리된 꽃잎에 70% 에탄올 10배수를 넣어 50~60℃, 3~24시간 조건에서 열수 추출하고, syringe filter 사용하여 감압 여과하여 농축하였다. 농축된 추출물을 70% 에탄올에 재용해한 후, 침전물을 제거하기 위해 감압 여과를 진행하고 재농축하여 삼천리 품종의 꽃잎 추출물을 제조하였다.
1-2. 삼천리 품종의 연화 꽃잎 추출물 제조
무궁화 품종 중 삼천리 품종의 꽃을 채취하여 꽃잎만을 분리 작업하였다.
분리된 꽃잎을 평균 2mm 크기로 절단하였고, 1~2%(v/v) 구연산(citric acid) 용액을 첨가한 후, 60~80℃에서 1~3시간 동안 가온하면서 꽃잎 조직을 연화시켰다. 연화된 꽃잎을 거름망을 이용하여 회수하고, 별도의 정제수를 이용하여 1회 내지 2회 세척하여 연화된 꽃잎을 준비하였다.
상기 연화된 삼천리 품종의 꽃잎에 70% 에탄올 10배수를 넣어 50~60℃, 3~24시간 조건에서 열수 추출하고, syringe filter 사용하여 감압 여과한 후, 농축하였다. 농축된 추출물을 70% 에탄올에 재용해한 후, 침전물을 제거하기 위해 감압 여과를 진행한 후, 재농축하여 삼천리 품종의 연화 꽃잎 추출물을 제조하였다.
1-3. 자명 품종의 꽃잎 추출물 제조
무궁화 품종 중 삼천리 품종의 꽃을 자명 품종의 꽃잎으로 대체한 것을 제외하고, 실시예 1-1과 동일한 방법을 사용하여 자명 품종의 꽃잎 추출물을 제조하였다.
1-4. 자명 품종의 연화 꽃잎 추출물 제조
무궁화 품종 중 삼천리 품종의 꽃을 자명 품종의 꽃잎으로 대체한 것을 제외하고 실시예 1-2와 동일한 방법을 사용하여 자명 품종의 연화 꽃잎 추출물을 제조하였다.
1-5. 태원순자 품종의 꽃잎 추출물 제조
무궁화 품종 중 삼천리 품종의 꽃을 태원순자 품종의 꽃잎으로 대체한 것을 제외하고, 실시예 1-1와 동일한 방법을 사용하여 태원순자 품종의 꽃잎 추출물을 제조하였다.
1-6. 태원순자 품종의 연화 꽃잎 추출물 제조
무궁화 품종 중 삼천리 품종의 꽃을 태원순자 품종의 꽃잎으로 대체한 것을 제외하고, 실시예 1-2와 동일한 방법을 사용하여 태원순자 품종의 연화 꽃잎 추출물을 제조하였다.
1-7. 무궁화 3종 품종의 연화 꽃잎 추출물 제조
무궁화 품종 중 삼천리 품종의 꽃을 삼천리, 자명, 및 태원순자 품종의 3종 꽃잎을 3:1:1의 중량비로 혼합하여 대체한 것을 제외하고, 실시예 1-2와 동일한 방법을 사용하여 태원순자 품종의 연화 꽃잎 추출물을 제조하였다.
실시예 2. 항산화 활성 분석
2-1. 연화처리에 따른 항산화 활성 변화
무궁화 꽃잎의 연화처리에 따른 항산화 활성 변화를 알아보기 위해 실시예 1-1의 삼천리 품종 무궁화 꽃잎과 실시예 1-2의 삼천리 품종 무궁화 연화 꽃잎의 항산화 활성을 비교하여 분석하였다.
항산화 활성은 DPPH 라디칼 소거 효능과 ABTS 라디칼 소거 효능을 평가하였다.
먼저, 실시예 1-1 및 실시예 1-2 시료의 DPPH 라디칼 소거 활성을 알아보기 위하여 각각의 시료를 100 및 250μg/mL의 농도로 96 well plate에 분주하였다. 분주된 시료에 0.2mM DPPH 용액과 혼합하여 빛을 차단시키고, 37℃에서 30분간 반응시킨 후, Microplate reader(Molecular Devices FilterMax F5; San Francisco, CA, USA) 기기를 사용하여 520nm에서 흡광도를 측정하였다. 비교 분석을 위하여 알부틴(Arbutin)을 양성대조군으로 사용하였다.
분석결과, 도 1을 참조하면, 실시예 1-1의 삼천리 품종 무궁화 꽃잎 추출물은 100 및 250μg/mL의 농도에서 각각 무처리 음성대조군 대비 5.4% 및 24.4% 개선된 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타내었고, 실시예 1-2의 삼천리 품종 무궁화 연화 꽃잎 추출물은 10.75% 및 36.26% 개선된 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타내었다. 이러한 결과를 통해, 무궁화 꽃잎의 연화 처리를 통해 농도 의존적으로 항산화 활성이 더욱 개선되는 양상을 확인할 수 있었다.
또한, 실시예 1-1 및 실시예 1-2 시료의 ABTS 라디칼 소거 활성을 알아보기 위하여 각각의 시료를 100 및 250μg/mL의 농도로 96 well plate에 분주하였다. 분주된 시료에 14mM ABTS 및 4.9mM potassium persulfate를 1:1로 혼합한 용액을 첨가한 후, 빛을 차단시키고 상온에서 6분간 반응시켰다. 반응이 종료된 후, Microplate reader(Molecular Devices FilterMax F5; San Francisco, CA, USA)를 사용하여 620nm에서 흡광도를 측정하였다. 비교 분석을 위하여 알부틴(Arbutin)을 양성대조군으로 사용하였다.
분석결과, 도 2를 참조하면, 실시예 1-1의 삼천리 품종 무궁화 꽃잎 추출물은 100 및 250μg/mL의 농도에서 각각 무처리 음성대조군 대비 8.12% 및 17.67% 개선된 ABTS 라디칼 소거 활성을 나타내었고, 실시예 1-2의 삼천리 품종 무궁화 연화 꽃잎 추출물은 100 및 250μg/mL의 농도에서 10.08% 및 26.34% 개선된 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타내었다. 이러한 결과를 통해, 무궁화 꽃잎의 연화 처리를 통해 농도 의존적으로 항산화 활성이 개선되는 양상을 확인할 수 있었다.
2-2. 무궁화 품종별 연화 처리에 따른 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거 활성 분석
실시예 2-1의 결과를 통해 무궁화 꽃잎의 연화 처리를 통해 항산화 활성이 더욱 개선되는 것을 확인함에 따라, 무궁화 품종별 연화 처리에 따른 항산화 활성 변화를 추가적으로 실험하였다.
실험은 연화처리된 무궁화 품종별 연화 꽃잎 추출물(실시예 1-2, 1-4, 및 1-6)과, 이들 품종의 복합 연화 꽃잎 추출물(실시예 1-7)을 대상으로 수행하였으며, 실험 방법은 실시예 2-1에서 분석한 DPPH 라디칼 소거 효능과 ABTS 라디칼 소거 활성 분석 방법과 동일한 방법을 사용하였다.
도 3을 참조하면, 무처리 음성대조군 대비 실시예 1-2의 삼천리 품종 무궁화 연화 꽃잎 추출물은 11.63%(100μg/mL) 및 35.28%(250μg/mL), 실시예 1-4의 자명 품종 무궁화 연화 꽃잎 추출물은 14.18%(100μg/mL) 및 20.22%(250μg/mL), 실시예 1-6의 삼천리 품종 태원순자 연화 꽃잎 추출물은 13.52%(100μg/mL) 및 28.04%(250μg/mL) 개선된 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타내었다.
즉, 무궁화 품종의 DPPH 라디칼 소거 활성은 100μg/mL 농도에서는 자명 연화 꽃잎 추출물이 가장 높은 것으로 확인되었고, 250μg/mL 농도에서는 삼천리 연화 꽃잎 추출물이 가장 높은 것으로 확인되었다.
또한, 이들 3종 무궁화 품종을 혼합하여 연화 추출한 실시예 1-7의 무궁화 연화 꽃잎 추출물은 무처리 음성대조군 대비 35.83%(100μg/mL) 및 62.51%(250μg/mL)의 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타내었다.
이러한 무궁화 3종 품종의 혼합 연화 꽃잎 추출물은 알부틴 양성대조군의 DPPH 라디칼 소거 활성 73.89%(100μg/mL) 및 78.52%(250μg/mL)에 근접하는 수치였으며, 이러한 결과를 통해, 무궁화 3종 품종을 혼합한 꽃잎 추출물을 사용하고, 꽃잎의 연화 처리를 동시에 수행하면, 항산화 활성이 현저하게 개선되는 시너지 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
마찬가지로, 도 4를 참조하면, 무처리 음성대조군 대비 실시예 1-2의 삼천리 품종 무궁화 연화 꽃잎 추출물은 8.08%(100μg/mL) 및 22.13%(250μg/mL)로, 실시예 1-4의 자명 품종 무궁화 연화 꽃잎 추출물은 10.96%(100μg/mL) 및 29.40%(250μg/mL)로, 실시예 1-6의 삼천리 품종 태원순자 연화 꽃잎 추출물은 7.56%(100μg/mL) 및 22.39%(250μg/mL) 개선된 ABTS 라디칼 소거 활성을 나타내었다.
단일 품종의 ABTS 라디칼 소거 활성은 100μg/mL 및 250μg/mL 농도에서 자명 연화 꽃잎 추출물이 가장 높은 것으로 확인되었다.
또한, 이들 3종 무궁화 품종을 혼합하여 연화 추출한 실시예 1-7의 무궁화 연화 꽃잎 추출물의 ABTS 라디칼 소거 활성은 무처리 음성대조군 대비 46.14%(100μg/mL) 및 61.26%(250μg/mL) 개선된 것으로 나타났으며, 알부틴 양성대조군의 69.94%(100μg/mL) 및 73.01%(250μg/mL)에 근접하는 수치로 나타났다.
상기와 같은 결과를 통해, 무궁화 3종 품종의 혼합 및 꽃잎의 연화 처리를 동시에 수행하는 경우, 항산화 활성이 현저하게 개선되는 시너지 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
2-3. 활성산소종 생성 억제 활성
무궁화 품종별 연화 처리에 따른 라디칼 소거 활성을 세포 실험을 통해 분석하였다.
활성산소종(ROS, Reactive Oxygen Species) 생성 억제 효과는 인간 섬유아세포를 96 well 배양접시에 배양 후, cell confluence가 80%에 도달하였을 때 실험을 진행하였다. DCFDA dye를 PBS에 희석하여 각 well에 처리한 후 37℃, 5% CO2 incubator에서 30분간 배양하였다.
PBS 제거 후 UVB를 225mJ/cm2 조건으로 조사하여 자극을 유발한 뒤 무궁화 꽃잎 추출물을 포함한 serum free 배지 100μl를 처리하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 1시간 동안 배양하였다.
[Excitation/Emission] = 485/535nm 파장에서 활성산소종(ROS, Reactive Oxygen Species) 생성량을 측정하였으며, 덱사메타손(dexamethasone)(1μg/mL)이 양성대조군으로 사용되었다.
실험 결과, 도 5를 참조하면, UVB 조사로 세포 내 활성산소종의 생성이 1.5배 이상 증가하였으며, 삼천리 품종의 무궁화 꽃잎 추출물의 처리로 활성산소종이 농도 의존적으로 감소하는 현상이 관찰되었는데, UVB 조사 음성대조군 대비 실시예 1-1의 연화처리하지 않은 꽃잎 추출물을 처리한 시험군은 활성산소종의 생성이 26.99%(100㎍/mL) 및 50.43%(250㎍/mL) 감소하였고, 연화처리한 실시예 1-2의 꽃잎 추출물을 처리한 시험군은 활성산소종의 생성이 48.83%(100㎍/mL) 및 69.95%(250㎍/mL) 감소하여, 연화처리를 통해 세포 내 활성산소종의 생성을 매우 효과적으로 억제하는 현상이 관찰되었다. 또한, 250㎍/mL 농도로 처리한 삼천리 품종의 무궁화 연화 꽃잎 추출물은 덱사메타손(dexamethasone) 처리 양성대조군의 55.56% 활성산소종 생성 억제 효과 대비 더욱 우수한 효과를 나타내는 것이 관찰되었다.
추가적으로 삼천리, 자명, 및 태원순자의 3품종에 대한 무궁화 꽃잎 연화 추출물(실시예 1-2, 1-4, 및 1-6)과 이들의 3종 복합 품종으로 구성된 무궁화 꽃잎 연화 추출물(실시예 1-7)의 활성산소종 생성 억제 활성을 비교 분석하였다.
도 6을 참조하면, UVB 조사 음성대조군 대비 실시예 1-2의 삼천리 품종의 무궁화 연화 꽃잎 추출물을 처리한 시험군은 UVB 조사 음성대조군 대비 활성산소종의 생성이 41.02%(100㎍/mL) 및 66.68%(250㎍/mL) 감소였고, 실시예 1-4의 자명 품종의 무궁화 연화 꽃잎 추출물을 처리한 시험군은 UVB 조사 음성대조군 대비 활성산소종의 생성이 25.59%(100㎍/mL) 및 32.69%(250㎍/mL) 감소였으며, 실시예 1-6의 태원순자 품종의 무궁화 연화 꽃잎 추출물을 처리한 시험군은 UVB 조사 음성대조군 대비 활성산소종의 생성이 30.78%(100㎍/mL) 및 56.77%(250㎍/mL) 감소한 것으로 나타났다. 단일 추출물 중에서는 삼천리 품종의 무궁화 연화 꽃잎 추출물의 활성산소종 생성 억제 활성이 가장 우수한 것으로 나타났다.
또한, 3종 복합 품종의 무궁화 꽃잎 연화 추출물(실시예 1-7)을 처리한 시험군은 이들의 단일 추출물을 처리한 시험군 대비 더욱 우수한 활성산소종 생성 억제 활성이 관찰되었는데, UVB 조사 음성대조군 대비 활성산소종 생성이 각각 74.39%(100㎍/mL) 및 75.83%(250㎍/mL) 감소하여 단일 추출물 대비 현저한 효과가 있는 것으로 나타났으며, 덱사메타손(dexamethasone) 처리 양성대조군(51.21%) 대비 1.5배 정도 개선된 더욱 우수한 활성산소종 생성 억제 효과를 나타내는 것으로 관찰되었다.
실시예 3. 세포 독성 및 항염증 활성 분석
3-1. 세포 독성
삼천리, 자명, 및 태원순자의 3품종에 대한 무궁화 꽃잎 연화 추출물(실시예 1-2, 1-4, 및 1-6)과 이들의 3종 복합 품종으로 구성된 무궁화 꽃잎 연화 추출물(실시예 1-7)이 대식세포주인 Raw 264.7 세포의 생장에 미치는 효과를 아래와 같은 방법으로 확인하였다.
대식세포주인 RAW 264.7 세포를 한국세포주은행(KTCC, Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였고, 10% FBS(Fetal bovine serum)를 함유한 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)에 10% FBS, 100㎍/mL 페니실린 및 100㎍/mL 스트렙토마이신을 첨가한 배지에 상기 세포를 접종하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
상기 RAW 264.7 세포를 1×105 cells/mL의 농도(in DMEM)로 96웰 플레이트에 접종하고 24시간 배양 후, 실시예 1에서 제조된 무궁화 꽃잎 연화 추출물(실시예 1-2, 1-4, 및 1-6) 또는 이들의 복합 추출물(실시예 1-7)을 각각 100㎍/mL 및 250㎍/mL 농도로 희석한 시료와 내독소로 알려진 LPS(1μg/mL)를 함유한 새로운 배지를 동시에 처리하여 24시간 배양하였다. 이후, 0.1mg/mL의 MTT 시약을 처리하고 2시간 후, 세포에 MTT 처리로 인해 생성된 포마잔(formazan)을 DMSO로 녹여 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 비교실험을 위해 덱사메타손(Dex, Dexamethasone) 1(μM)을 양성대조군으로 처리하여 사용하였다.
실험 결과, 도 7을 참조하면, 무궁화 꽃잎 연화 추출물(실시예 1-2, 1-4, 및 1-6)과 이들의 복합 추출물(실시예 1-7)은 고농도인 100㎍/mL 및 250㎍/mL 농도에서 대식세포주인 RAW 264.7 세포의 생존율에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났으며, 이를 통해 세포독성이 없는 것으로 분석되었다.
2-2. 산화질소 생성 억제능
무궁화 꽃잎 연화 추출물(실시예 1-2, 1-4, 및 1-6) 또는 이들의 복합 추출물(실시예 1-7)의 항염증 효과를 확인하기 위해, 염증 유발에 관여하는 대표적인 세포 독성물질인 일산화질소(nitric oxide, NO)의 생성 억제율을 측정하였다.
먼저, 대식세포주인 RAW 264.7 세포를 한국세포주은행(KTCC, Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였고, 10% FBS(Fetal bovine serum)를 함유한 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)에 10% FBS, 100㎍/㎖ 페니실린 및 100㎍/㎖ 스트렙토마이신을 첨가한 배지에 상기 세포를 접종하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
구체적으로, 상기 RAW 264.7 세포를 1×105 cells/mL의 농도(in DMEM)로 96 웰 플레이트에 접종하고 24시간 배양 후, 실시예 1에서 제조된 무궁화 꽃잎 연화 추출물(실시예 1-2, 1-4, 및 1-6)과 이들의 복합 추출물(실시예 1-7)을 각각 100㎍/mL 및 250㎍/mL 농도로 희석한 시료와 내독소로 알려진 LPS(1μg/ml)를 함유한 새로운 배지를 동시에 처리하여 24시간 배양하였다. 그 후, 세포 배양 상등액 100㎕와 Griess reagent[1%(w/v) sulfanilamide, 0.1%(w/v) naphtylethylenediamine in 2.5%(v/v) phosphoric acid] 100㎕를 혼합하여 96 웰 플레이트에서 10분 동안 반응시키고, ELISA 리더를 사용하여 540nm에서 흡광도를 측정하여 생성된 산화질소의 양을 측정하였다.
생성된 아질산염(nitrite)의 농도는 아질산나트륨(sodium nitrite)을 DMEM 배지에 용해한 표준 곡선을 이용하여 계산하였다. LPS를 처리한 대조군과 LPS를 처리하지 않은 대조군에서 생성된 아질산염의 생성량 차이를 기준으로 각 시료의 일산화질소 생성 저해 활성을 확인하였다. 비교실험을 위해 덱사메타손(Dex, Dexamethasone) 1(μM)을 양성대조군으로 처리하여 사용하였다.
실험 결과, 도 8을 참조하면, 무궁화 연화 꽃잎의 단일 추출물에 비해 이들의 복합추출물의 산화질소 생성 억제 효과가 더 우수한 것을 확인할 수 있었다.
구체적으로, LPS만을 처리한 음성대조군 대비 실시예 1-2의 삼천리 연화 꽃잎 추출물을 처리한 군에서는 산화질소 생성량이 1.88%(100㎍/mL) 및 12.10%(250㎍/mL) 감소하였고, 실시예 1-4의 자명 연화 꽃잎 추출물을 처리한 군에서는 산화질소 생성량이 4.32%(100㎍/mL) 및 7.78%(250㎍/mL) 감소하였으며, 실시예 1-6의 태원순자 연화 꽃잎 추출물을 처리한 군에서는 산화질소 생성량이 5.35%(100㎍/mL) 및 12.31%(250㎍/mL) 감소하여, 무궁화 단일 품종의 꽃잎 추출물을 처리한 시험군에서는 산화질소 생성 억제 효과가 크지 않은 것으로 나타났다.
이에 반해 실시예 1-7의 무궁화 3종 품종의 연화 추출물을 처리한 군에서는 LPS만을 처리한 음성대조군 대비 산화질소 생성량이 6.23%(100㎍/mL) 및 27.02%(250㎍/mL) 감소하였으며, 이들의 단일 추출물에 비해 복합추출물이 산화질소 생성 억제에 시너지 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4. 보습 활성 분석
본 발명의 삼천리, 자명, 및 태원순자 품종으로 이루어진 3종 품종의 무궁화 연화 꽃잎 추출물이 갖는 피부 보습 효과를 검증하기 위해 히알루론산(Hyaluronan) 합성량 변화를 측정하였다.
히알루론산(HA, Hyaluronan, Hyaluronic acid)은 주로 표피 각질형성세포와 진피 섬유아세포에 의해 합성되며, 수분과 결합하여 세포가 정상적으로 활동할 수 있는 환경을 조성하는 중요한 역할을 하는 물질이다. 피부에서 히알루론산의 감소는 피부 탄력 저하 및 수분 함유량 감소의 직접적인 원인 중 하나이다. 따라서 본 실험에서는 인간각질형성세포(HaCaT) 내에서 히알루론산의 생성량을 확인하였다.
먼저, 인간각질형성세포(HaCaT)를 24 well 세포배양 접시에 1㎖의 배양액을 넣고 약 1×105의 농도로 세포를 접종한 후, 37℃, 5% CO2 환경에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 상기 실시예 1-1에 따라 준비된 삼천리 품종의 무궁화 꽃잎 추출물과, 상기 실시예 1-2에 따라 준비된 삼천리 품종의 무궁화 연화 꽃잎 추출물을 각각 100, 및 250㎍/mL 농도로 포함하는 배지로 교체하여 24시간 배양하였다. 이후 배양액을 회수(harvest)하여 4℃, 7,500rpm 환경에서 5분간 원심분리(centrifuge)한 뒤, ELISA 방법을 이용하여 히알루론산(Hyaluronan kit, R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA)의 발현량 변화를 확인하였다.
실험 결과, 도 9를 참조하면, 삼천리 품종의 무궁화 꽃잎 추출물 처리군은 100㎍/mL 및 250㎍/mL 용량에서 용매 처리 대조군(veh) 대비 각각 12.98% 및 34.11% 개선된 히알루론산 합성 증가 효과를 나타내었고, 삼천리 품종의 무궁화 연화 꽃잎 추출물 처리군은 100㎍/mL 및 250㎍/mL 용량에서 용매 처리 대조군(DMSO, veh) 대비 각각 17.88% 및 65.19% 개선된 히알루론산 합성 증가 효과를 나타내어 연화 처리에 따라 대략 50% ~200% 증가된 히알루론산 합성 증가 효과를 나타내는 것으로 관찰되었다.
또한, 상기 히알루론산의 합성량 측정 방법과 동일한 방법을 사용하되, 시료를 연화 처리한 무궁화 3개 품종의 단일 꽃잎 추출물(실시예 1-2, 1-4, 및 1-6)과, 3개 품종의 무궁화 연화 꽃잎 복합추출물(실시예 1-7)로 교체하여 품종 간 혼합에 따른 히알루론산의 합성량 변화를 측정하였다.
실험 결과, 도 10을 참조하면, 삼천리 품종의 무궁화 연화 꽃잎 추출물 처리군은 100㎍/mL 및 250㎍/mL 용량에서 용매 처리 대조군(veh) 대비 각각 4.81% 및 22.28% 개선된 히알루론산 합성 증가 효과를 나타내었고, 자명 품종의 무궁화 연화 꽃잎 추출물 처리군은 100㎍/mL 및 250㎍/mL 용량에서 용매 처리 대조군(veh) 대비 각각 17.67% 및 41.01% 개선된 히알루론산 합성 증가 효과를 나타내었으며, 태원순자 품종의 무궁화 연화 꽃잎 추출물 처리군은 100㎍/mL 및 250㎍/mL 용량에서 용매 처리 대조군(veh) 대비 각각 6.09% 및 29.42% 개선된 히알루론산 합성 증가 효과를 나타내어, 무궁화 연화 꽃잎 추출물이 피부 보습에 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
더 나아가, 삼천리, 자명, 및 태원순자의 3개 품종을 연화처리하여 추출한 실시예 1-7의 복합추출물은 이들의 단일 추출물 대비 히알루론산 합성에 시너지 효과가 있음을 확인할 수 있었는데, 구체적으로 무궁화 연화 꽃잎 복합추출물(실시예 1-7)을 처리한 시험군은 100㎍/mL 및 250㎍/mL 용량에서 용매 처리 대조군(veh) 대비 각각 62.66% 및 112.31% 개선된 히알루론산 합성 증가 효과를 나타내었다.
상기와 같은 결과를 통해, 본 발명의 삼천리, 자명, 및 태원순자의 3개 품종을 연화처리하여 추출한 복합추출물은 3종 품종의 혼합에 따라 히알루론산 합성 증가에 대한 시너지 효과가 발생하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5. 피부 주름 개선 활성
본 발명의 삼천리, 자명, 및 태원순자 품종으로 이루어진 3종 품종의 무궁화 연화 꽃잎 추출물의 피부 주름 개선 효과를 검증하기 위해, MMP-1 단백질의 합성 저해 활성을 실험하였다.
먼저, 40mm 세포 배양 접시에 2㎖의 DMEM 배양액을 넣고, 인간섬유아세포(HDF)를 약 2.5x105 농도로 접종한 후, 37℃, 5% CO2 환경에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후, UVB를 225mJ/cm2 조건으로 조사한 후, 상기 실시예 1-1에 따라 준비된 삼천리 품종의 무궁화 꽃잎 추출물과, 상기 실시예 1-2에 따라 준비된 삼천리 품종의 무궁화 연화 꽃잎 추출물을 각각 100, 및 250㎍/mL 농도로 포함하는 배지로 교체하여 3일간 배양하였다. 이후 배양액을 회수(harvest)하여 4℃, 7,500rpm 환경에서 5분간 원심분리(centrifuge)하고, ELISA 방법을 이용하여 MMP-1(Human Total MMP-1 kit, R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA)의 단백질 발현량 변화를 확인하였다.
실험 결과, 도 11을 참조하면, 자외선 조사 처리로 MMP-1 단백질의 생성이 1.5배 정도 증가하였으며, 무궁화 연화 추출물의 처리에 의해서 편차를 두고 감소하는 현상을 나타내었다.
구체적으로, 자외선 조사 무처리군 대비 삼천리 품종의 무궁화 연화 추출물 처리군은 MMP-1 단백질 생성량이 7.04%(100㎍/mL) 및 17.42%(250㎍/mL) 감소하였고, 자명 품종의 무궁화 연화 추출물 처리군은 MMP-1 단백질 생성량이 21.53%(100㎍/mL) 및 28.89%(250㎍/mL) 감소하였으며, 태원순자 품종의 무궁화 연화 추출물 처리군은 MMP-1 단백질 생성량이 2.57%(100㎍/mL) 및 8.45%(250㎍/mL) 감소한 것으로 나타나, 무궁화 3개 품종의 단일 추출물 중에서 자명 품종의 무궁화 연화 추출물의 피주 주름 개선 효과가 가장 우수한 것으로 나타났다.
또한, 삼천리, 자명 및 태원순자의 3개 품종을 혼합한 꽃잎 연화 추출물을 처리한 시험군에서는 자외선 조사 무처리군 대비 22.90%(100㎍/mL) 및 38.36%(250㎍/mL) 감소한 MMP-1 단백질의 생성 저해 효과를 나타내었으며, TGF-β1(10ng/mL) 처리 양성대조군의 20.42% 저해효과와 비교하여 동등 이상의 효과를 나타내는 것으로 관찰되었다.
상기와 같은 결과를 통해, 본 발명의 삼천리, 자명, 및 태원순자 품종으로 이루어진 3종 품종의 무궁화 연화 꽃잎 추출물은 MMP-1 단백질의 생성을 효과적으로 억제하여 주름개선에 우수한 효과가 있으며, 3종 품종의 혼합에 따른 시너지 효과가 발생하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6. 피부 상처 재생 활성
본 발명의 삼천리, 자명, 및 태원순자 품종으로 이루어진 3종 품종의 무궁화 연화 꽃잎 추출물의 피부 재생 활성을 실험하였다.
실험은 피부 상처(Wound) 제작용 인서트(insert)를 사용하여 인간섬유아세포(HDF)를 24 well 배양접시에 분주하여 24시간 배양하고, 검체(실시예 1-2, 1-4, 1-6, 및 1-7) 250 ㎍/mL를 포함한 serum free 배지(1mL)를 처리하여 현미경으로 각 well을 촬영한 후, 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양하였다. 이 후, 현미경으로 각 well을 촬영하고, 검체 처리 직후와 24시간 배양 후의 피부 상처(wound) 면적을 비교하여 세포재생률을 확인하였다.
세포 증식의 측정은 MTT(methylthiazole-2-yl-2.5-diphenyl tetrazolium bromide) 분석 방법과 디프 퀵 스테인(Diff quic stain) 방법을 이용하여 세포염색 후 현미경으로 확인한 후, 무처리군 대비 세포 재생율을 측정하였다.
실험 결과, 도 12 및 도 13을 참조하면, 무궁화 연화 추출물의 처리로 피부 상처 재생 활성이 증가하는 현상을 나타내었다.
구체적으로, 시료 없이 용매만을 처리한 시험군(vehicle) 대비 삼천리 품종의 무궁화 연화 추출물 처리군은 피부 상처 재생률이 96.52% 증가하였고, 자명 품종의 무궁화 연화 추출물 처리군은 42.25% 증가하였으며, 태원순자 품종의 무궁화 연화 추출물 처리군은 117.81% 증가한 것으로 나타나, 무궁화 3개 품종의 단일 추출물 중에서는 태원순자 품종의 무궁화 연화 추출물이 피부 상처 재생에 가장 우수한 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.
또한, 삼천리, 자명 및 태원순자의 3개 품종을 혼합한 꽃잎 연화 추출물을 처리한 시험군에서는 시료 없이 용매만을 처리한 시험군(vehicle) 대비 251.31% 증가한 피부 상처 재생률을 나타내었으며, 양성대조군인 알란토인(Allantoin 10㎍/mL) 처리군의 156.84% 증가한 피부 상처 재생률과 비교하여도 더욱 우수한 활성을 나타내는 것으로 관찰되었다.
상기와 같은 결과를 통해 3종 품종의 혼합에 따른 무궁화 연화 추출물의 피부 상처 재생에 대한 시너지 효과가 발생하는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 삼천리, 자명 및 태원순자의 3개 품종을 혼합한 꽃잎 연화 추출물을 손상된 피부세포에 처리하는 경우, 재생된 피부세포의 형태적인 모양이 정상적인 피부세포와 동일하게 성장하는 것으로 관찰되었다(도 13 참조).
상기와 같은 결과를 통해, 본 발명의 삼천리, 자명 및 태원순자의 3개 품종을 혼합한 무궁화 연화 꽃잎 추출물은 세포독성이 없고, 우수한 항산화 활성을 나타내며, 산화질소 생성을 억제하여 우수한 항염증 활성을 나타내고, 피부 보습과 피부 주름 개선에 우수한 효과가 있으며, 피부 상처 재생 촉진에 이바지함으로써 피부 상태 개선에 우수한 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (7)

  1. 삼천리, 자명, 및 태원순자 품종으로 이루어진 3종 품종의 무궁화 연화 꽃잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염증, 보습, 피부 주름 개선 및 피부 상처 재생용 화장료 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 삼천리, 자명, 및 태원순자의 3종 품종은 3:0.5-2:0.5-2의 중량비로 혼합된 것을 특징으로 하는 항산화, 항염증, 보습, 피부 주름 개선 및 피부 상처 재생용 화장료 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 3종 품종의 무궁화 연화 꽃잎 추출물은 일산화질소(NO) 생성 억제를 통해 항염증 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 항산화, 항염증, 보습, 피부 주름 개선 및 피부 상처 재생용 화장료 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 3종 품종의 무궁화 연화 꽃잎 추출물은 히알루론산 합성을 촉진하여 피부 보습 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 항산화, 항염증, 보습, 피부 주름 개선 및 피부 상처 재생용 화장료 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 3종 품종의 무궁화 연화 꽃잎 추출물은 MMP-1((matrix metallo-proteinase 1) 유전자의 발현을 억제하여 피부 주름 개선 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 항산화, 항염증, 보습, 피부 주름 개선 및 피부 상처 재생용 화장료 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 3종 품종의 무궁화 연화 꽃잎 추출물은 피부 상처 재생 촉진 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 항산화, 항염증, 보습, 피부 주름 개선 및 피부 상처 재생용 화장료 조성물.
  7. 삼천리, 자명, 및 태원순자 품종으로 이루어진 3종 품종의 무궁화 연화 꽃잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염증, 보습, 피부 주름 개선 및 피부 상처 재생용 식품 조성물.
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