KR102557358B1 - 아네모시스 켈리포니카 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 탄력 및 주름개선용 조성물 - Google Patents
아네모시스 켈리포니카 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 탄력 및 주름개선용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 아네모시스 켈리포니카 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 탄력 및 주름 개선용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 타닌산(Tannic acid), 클로로겐산(Chlorogenic acid) 및 아피제닌(Apigenin)의 성분들을 다량 함유하고, 아네모시스 켈리포니카 추출물은 자유라디칼 소거 활성 효과가 뛰어나며, ROS 저해 활성이 우수하고, 자외선으로 인한 진피 섬유아세포의 사멸을 억제할 뿐만 아니라, ERK, p38 및 JNK 단백질과 AP-1 단백질의 인산화를 억제하고, MMP-1(matrix metalloproteinase-1) 유전자의 발현을 억제하는 동시에 프로콜라겐 타입 I(Procollagen type Ⅰ) 단백질의 발현을 촉진하여 피부 탄력 및 주름 개선에 우수한 효과를 나타낸다.
또한, 본 발명의 조성물은 천연 추출물인 아네모시스 켈리포니카 추출물을 원료로 하여 인체에 매우 안전할 뿐만 아니라, 안정성도 매우 탁월하여 화장품 및 의약품 분야에서 유용하게 이용 가능하다.
본 발명의 조성물은 타닌산(Tannic acid), 클로로겐산(Chlorogenic acid) 및 아피제닌(Apigenin)의 성분들을 다량 함유하고, 아네모시스 켈리포니카 추출물은 자유라디칼 소거 활성 효과가 뛰어나며, ROS 저해 활성이 우수하고, 자외선으로 인한 진피 섬유아세포의 사멸을 억제할 뿐만 아니라, ERK, p38 및 JNK 단백질과 AP-1 단백질의 인산화를 억제하고, MMP-1(matrix metalloproteinase-1) 유전자의 발현을 억제하는 동시에 프로콜라겐 타입 I(Procollagen type Ⅰ) 단백질의 발현을 촉진하여 피부 탄력 및 주름 개선에 우수한 효과를 나타낸다.
또한, 본 발명의 조성물은 천연 추출물인 아네모시스 켈리포니카 추출물을 원료로 하여 인체에 매우 안전할 뿐만 아니라, 안정성도 매우 탁월하여 화장품 및 의약품 분야에서 유용하게 이용 가능하다.
Description
아네모시스 켈리포니카 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 탄력 및 주름개선용 조성물에 관한 것이다.
피부는 인체의 1차 방어막으로 온도 및 습도의 변화, 자외선, 공해물질 등 외부 환경의 자극으로부터 체내 기관들을 보호해준다. 피부는 인체의 다른 장기들과 마찬가지로 나이가 들어감에 따라 점차 노화가 진행되고, 노화로 인해 피부탄력저하, 각질화, 주름생성, 피부 위축 등의 현상이 나타난다.
피부 노화는 크게 내인성 노화(Intrinsic aging) 혹은 생리학적 노화와 외인성 노화(Extrinsic aging) 혹은 광노화(Photoaging)로 구분된다. 생리학적 노화는 유전적 원인에 의한 것이므로 조절이 어려우나, 광노화는 자외선(UV, Ultraviolet)으로 인해 기미, 주근깨, 피부색소침착 등은 환경적 원인에 의한 것이므로 인위적인 조절이 용이하다. 따라서 광노화를 방지하기 위한 연구가 지속되고 있으며, 특히 장기간 자외선 노출에 의해 진행되는 외인성 노화로 형성된 주름 방지에 대한 연구가 주목되고 있다.
한편, 콜라겐은 진피의 약 90%를 차지하는 아교질 섬유성 단백질로서 엘라스틴과 함께 피부에 탄력과 강도를 부여하는 주요 성분으로 알려져 있다. 콜라겐은 자연 노화에 따른 세포 활성 저하와 같은 내부 요인에 의해 감소하기도 하지만, 여러 유해 환경에서 스트레스의 증가나 지속적인 자외선 노출로 인해 콜라겐 생합성 감소, 콜라겐 분해효소 발현 촉진 등으로 인해 콜라겐 섬유의 변성 및 파괴가 유발되고, 이로 인해 피부 탄력이 감소하고 주름의 생성이 촉진된다. 또한, 지속적으로 자외선에 노출된 피부조직은 활성산소종(ROS)의 발생이 증가하고, EGF-R(Epidermal growth factor receptor), TNF(tumor necrosis factor)-receptor 등에 의해 매개되는 신호전달 체계를 통해 전염증 사이토카인의 생성이 촉진된다. 이들 수용체의 활성화는 결과적으로 MAPKs(mitogen activated protein kinases), ERK(extracellular signal-regulated kinase), p38 kinase, JNK(c-Jun amino-terminal kinase) 등의 단백질들의 연속적인 인산화로 이어지고, 결과적으로 AP-1(activator protein-1)과 NF-κB(nuclear factor κB)와 같은 전사인자가 활성화되어 염증반응이 유발되며, MMPs(matrix metalloproteinase)와 같은 콜라겐 분해 효소(collagenase)의 활성을 촉진함으로써 피부탄력이 감소되고 주름생성이 촉진된다.
AP-1 단백질은 세포의 성장과 분화에 관련되는 수많은 유전자의 발현을 조절하고 일부 MMPs(matrix metalloproteinase)의 발현을 강력히 조절한다. AP-1 단백질에 의해 발현이 조절되는 MMP 중 MMP-1은 collagenase 1 단백질로 알려져 있으며, 타입 Ⅰ과 Ⅲ 콜라겐을 기질로 한다. 그러므로 AP-1 및 MAPKs 인자에 의해 조절되는 활성산소종(ROS)의 생성과, MMPs, ILs, TGF-β, 및 타입 I 프로콜라겐의 발현은 피부 노화, 피부의 탄력 감소 및 주름 증가에 관한 연구에 있어서 유용한 마커로 작용한다. 이에 본 발명자들은 세포 내 자연노화와 광노화에 의해 발현이 유도되는 MMP 발현량 및 활성을 억제하는 방향으로 연구를 진행하였다.
최근 의료 기술의 발달로 평균수명이 연장되고 삶의 질 향상과 건강하고 아름다운 삶에 대한 욕구가 증가함에 따라 피부미용 및 건강에 관한 관심이 확대되고 있다. 또한, 피부 자극을 줄이기 위해 천연물질로부터 얻어진 항산화, 주름 완화, 미백 등의 효과를 가진 기능성 화장품에 많은 관심이 집중되고 있다.
천연물질로부터 유래한 물질은 피부에 부작용이 적을 뿐 아니라, 소비자들의 호응이 높아짐에 따라 기능성 화장품 및 피부 외용제 원료로서 개발가치가 한층 증가하고 있다. 최근 부작용이 적고 치료 효과는 개선한 천연물들이 주목을 받으면서, 피부 탄력 및 주름의 개선을 목적으로 하는 천연 추출물들의 개발되고 있다.
그러나 종래 개발된 비타민C, 레티노익산, 형질전환 생장인자(transforming growth factor, TGF), 동물태반 유래의 단백질(JP8-231370), 베툴린산(betulinic acid, JP8-208424), 클로렐라 추출물(JP9-40523, JP10-36283, 섬유아세포 증식 촉진작용) 등의 소재들은 피부에 적용시 자극과 발적 등 안전성 문제로 사용량에 제한이 있거나, 그 효과가 미미하여 실질적으로 피부 탄력 및 주름의 개선에 효과를 기대할 수 없다는 문제점이 있었으며, 아직까지 상업적으로 활용할 만큼 우수한 효과를 나타내는 천연 추출물은 소수에 불과하다. 특히, 아네모시스 켈리포니카의 피부 탄력 및 주름 개선 효과에 대하여 알려진 바는 없다.
이러한 배경 아래에서, 본 발명자들은 상업적으로 활용할 만큼 우수한 피부 탄력 및 주름 개선 효과를 나타내는 천연 추출물을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 아네모시스 켈리포니카 추출물이 자유라디칼을 소거하는 활성이 뛰어나고, ROS 저해 활성이 우수하며, 자외선으로 인한 진피 섬유아세포의 사멸을 억제할 뿐만 아니라, AP-1 단백질 및 콜라겐 분해 효소-1(MMP-1, matrix metalloproteinase-1)의 분비를 억제하고, MMPs(matrix metalloproteinase) 유전자 발현을 억제하는 효과가 있으므로, 피부 탄력 및 주름 개선에 유용하게 활용할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 주된 목적은 아네모시스 켈리포니카 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 탄력 및 주름 개선용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 아네모시스 켈리포니카 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 탄력 및 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 아네모시스 켈리포니카 추출물 성분의 유용성에 관한 연구를 수행한 결과, 타닌산(Tannic acid), 클로로겐산(Chlorogenic acid) 및 아피제닌(Apigenin)의 성분들을 다량 함유하고, 아네모시스 켈리포니카 추출물은 자유라디칼 소거 활성 효과가 뛰어나며, ROS 저해 활성이 우수하고, 자외선으로 인한 진피 섬유아세포의 사멸을 억제할 뿐만 아니라, ERK, p38 및 JNK 단백질과 AP-1 단백질의 인산화를 억제하고, MMP-1(matrix metalloproteinase-1) 유전자의 발현을 억제하는 동시에 프로콜라겐 타입 I(Procollagen type Ⅰ) 단백질의 발현을 촉진하는 효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 조성물은 부작용이 없이 안전한 천연 식물 소재 유래의 아네모시스 켈리포니카 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 탄력 및 주름 개선용 조성물로, 인체에 적용 시에도 부작용이 없이 안전하다.
본 발명의 "아네모시스 켈리포니카(Anemopsis californica)"는 미국 남서부 지역과 멕시코 북부 지역에서 자생하는 유명한 다년생 허브로서, 습지, 특히 알칼리성 또는 염분이 많은 곳에서 자란다. 예로부터 아네모시스 켈리포니카는 상처치유, 통증 및 염증 완화, 폐, 순환기, 비뇨기 및 소화기관 치료에 활용되었으며, 자궁암 및 효모 감염, 질염을 포함한 부인과 질환이나 성병, 궤양의 치료체로 사용되었다. 특히, 위경련, 폐의 점액 제거, 요산 축적 억제, 통풍 예방 및 염증 완화에 도움이 되는 것으로 알려져 있으므로, 이를 뒷받침하는 약리적 효과를 평가하기 위한 여러 연구가 수행되었다. 그러나, 아직 피부 탄력 및 주름 개선 활성에 관한 연구는 이루어진 바가 없다.
본 발명에서 사용되는 용어, "추출물"은 아네모시스 켈리포니카의 추출 처리로 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다. 본 발명의 상기 추출물은 바람직하게 추출 후 건조 분말 형태로 제조되어 사용될 수 있다.
상기 아네모시스 켈리포니카의 추출에 있어서, 상기 추출물을 추출하는 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다. 상기 추출 방법의 비 제한적인 예로는, 열수 추출법, 초음파 추출법, 여과법, 환류 추출법 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 수행되거나 2종 이상의 추출 방법을 병용하여 수행될 수 있다.
본 발명에서 상기 아네모시스 켈리포니카를 추출하는데 사용되는 추출 용매의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 추출 용매의 비제한적인 예로는 물; 메탄올, 에탄올, 프로필알코올, 부틸알코올 등의 C1 내지 C4의 저급 알코올; 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 등의 다가 알코올; 및 메틸아세테이트, 에틸아세테이트, 아세톤, 벤젠, 헥산, 디에틸에테르, 디클로로메탄 등의 탄화수소계 용매; 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 바람직하게, 물, 저급알코올, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸아세테이트를 단독으로 사용하거나 2종 이상 혼합하여 사용할 수 있다.
본 발명에서 열수 추출 또는 냉침 추출한 추출물은 부유하는 고체 입자를 제거하기 위해 여과, 예를 들어 나일론 등을 이용해 입자를 걸러내거나 냉동여과법 등을 이용해 여과한 후, 그대로 사용하거나 이를 동결건조, 열풍건조, 분무건조 등을 이용해 건조하여 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "분획물"은 여러 다양한 구성성분들을 포함하는 혼합물로부터 특정 성분 또는 특정 성분 그룹을 분리하기 위하여 분획을 수행하여 얻어진 결과물을 의미한다.
상기 분획 방법의 비 제한적인 예로는, 아네모시스 켈리포니카를 추출하여 얻은 추출물에 소정의 용매를 처리하여 상기 추출물로부터 분획물을 얻는 방법을 들 수 있다. 본 발명에서 상기 분획물을 얻는 데에 사용되는 용매의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 분획 용매의 비 제한적인 예로는 물, 알코올 등의 극성 용매; 헥산(Hexane), 에틸아세테이트(Ethyl acetate), 클로로포름(Chloroform), 디클로로메탄(Dichloromethane) 등의 비극성 용매 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합하여 사용될 수 있다. 상기 분획 용매 중 알코올을 사용하는 경우에는 구체적으로는 C1 내지 C4의 알코올을 사용할 수 있다.
본 발명의 상기 아네모시스 켈리포니카의 추출물은 아네모시스 켈리포니카의 전초, 잎, 줄기, 뿌리, 및 열매 중 어느 하나 이상의 부위에서 추출이 가능하다. 또한, 상기 아네모시스 켈리포니카 추출물은 천연, 잡종 또는 변종 식물로부터 추출될 수 있고, 식물 조직 배양물에서도 추출이 가능하다.
본 발명에서, 상기 아네모시스 켈리포니카 추출물은 타닌산(Tannic acid), 클로로겐산(Chlorogenic acid) 및 아피제닌(Apigenin)을 함유하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 아네모시스 켈리포니카 추출물은 그 자체로 피부 탄력 및 주름 개선 활성을 나타내는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 바람직한 실시예에서는 상기 아네모시스 켈리포니카 추출물이 자유라디칼 소거 활성 효과가 뛰어나고, 자외선으로 인한 진피 섬유아세포의 사멸을 억제할 뿐만 아니라, ERK, p38 및 JNK 단백질과 AP-1 단백질의 인산화를 억제하고, MMP-1(matrix metalloproteinase-1) 유전자의 발현을 억제하는 동시에 프로콜라겐 타입 I(Procollagen type Ⅰ) 단백질의 발현을 촉진하는 활성이 있음을 확인한 바 있다.
구체적으로 본 발명의 피부 탄력 및 주름개선 조성물은 항산화 활성을 갖는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 아네모시스 켈리포니카 추출물이 처리된 실험군은 음성대조군에 비하여 전반적으로 우수한 항산화 효과를 보이는 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 항산화 효과 수치들은 양성대조군인 아스코르브산 처리군과 비교하였을 때도 유사한 수준인 것으로 분석되었다(도 3 및 도 4 참조). 본 발명의 아네모시스 켈리포니카 추출물은 진피 섬유아세포 내의 ROS 생성을 농도의존적으로 감소시켜 ROS 소거능이 우수한 것으로 나타났다(도 5 참조).
또한, 본 발명의 아네모시스 켈리포니카 추출물은 MMP-1(matrix metalloproteinase-1) 단백질의 발현을 억제하고, 프로콜라겐 타입 I(Procollagen type Ⅰ) 단백질의 발현을 촉진하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 상기 아네모시스 켈리포니카 추출물이 농도 의존적으로 MMP-1 효소 활성을 저해하는 것으로 관찰되었는데, 50㎍/㎖ 농도로 처리한 시험군에서는 UVB 조사 무처리 음성대조군과 비교하여 MMP-1 효소 활성을 21.2% 저해하는 것으로 나타났다. 또한, UVB 조사에 의해 증가한 MMP-1 단백질의 발현 증가가 본 발명의 아네모시스 켈리포니카 추출물의 처리로 인해 농도 의존적으로 감소되는 것을 확인할 수 있었고, UVB 조사에 의해 감소한 Procollagen type Ⅰ 단백질의 발현이 본 발명의 아네모시스 켈리포니카 추출물의 처리로 인해 농도 의존적으로 증가함을 확인할 수 있었다(도 9 참조).
또한, 본 발명의 아네모시스 켈리포니카 추출물은 ERK, p38 및 JNK 단백질의 인산화를 억제하고, c-Jun 및 c-FOS 단백질의 인산화를 억제하는 것을 특징으로 한다. MAPKs(mitigen activated protein kinases)는 ERK 단백질과 p38 및 JNK 단백질로 구성되어 있으며, UVB 자극에 의해 활성을 나타내는 인산화 형태로 유도된다고 알려져 있다. UVB 조사된 진피 섬유아세포에서 본 발명의 아네모시스 켈리포니카의 영향을 평가하기 위해, MAPKs 단백질에 대한 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)을 수행한 결과, UVB 조사로 인해 MAP Kinase 효소의 구성원인 p38, ERK 및 JNK 단백질의 인산화가 증가한 것으로 나타났으나, 본 발명의 아네모시스 켈리포니카 추출물을 처리한 시험군에서는 UVB 조사에도 불구하고 ERK, p38 및 JNK 단백질의 인산화가 억제되는 것으로 확인할 수 있었다(도 7 참조). 또한, AP-1(Activator protein-1) 단백질은 자외선에 의한 피부세포 노화에서 중요한 역할을 하는 전사인자로 MMPs 효소의 발현을 강력히 조절하는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 아네모시스 켈리포니카 추출물의 세포 내 기전을 명확하게 확인하기 위하여, UVB 조사된 진피 섬유아세포에서 AP-1의 구성인자인 c-Jun 및 c-FOS 단백질에 대한 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)을 수행한 결과, UVB 조사로 AP-1의 구성 인자인 c-Jun 및 c-FOS 단백질의 인산화가 유도되어 이를 통해 AP-1 단백질의 활성이 증가된 것을 확인할 수 있었다. 이에 반해 본 발명의 아네모시스 켈리포니카 추출물을 처리한 시험군에서는 농도 의존적으로 c-Jun 및 c-FOS 단백질의 인산화가 억제되는 것을 확인할 수 있었다(도 8 참조).
본 발명의 피부 탄력 및 주름 개선용 화장료 조성물에서, 상기 아네모시스 켈리포니카 추출물은 0.01 내지 10 중량부로 전체 조성물 중량대비 포함될 수 있다.
본 발명의 피부 탄력 및 주름 개선용 화장료 조성물에서, 상기 조성물은 용액, 외용연고, 크림, 폼, 영양화장수, 유연화장수, 마스크 팩, 유연수, 유액, 메이크업베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린크림, 선오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패치 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체는 제형에 따라 다양하다.
본 발명의 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는, 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되며, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일이 이용될 수 있으며, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 비누인 경우에는 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알콜, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 아네모시스 켈리포니카 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 탄력 및 주름개선용 식품 조성물을 제공한다. 본 발명의 아네모시스 켈리포니카 추출물과, 피부 탄력 및 주름개선에 대한 효과는 상기에서 설명한 바와 같다. 상기 식품 조성물은 건강기능식품의 형태로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 피부 탄력 및 주름개선용 식품 조성물은 아네모시스 켈리포니카 추출물을 포함하는 식물 추출물, 이의 분획물 또는 이의 가공물의 형태로 포함될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 유효성분 이외에 식품학적으로 허용 가능한 식품보조첨가제를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, "식품보조첨가제"란 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제형의 건강기능식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 식품보조첨가제의 예로는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 본 발명의 식품보조첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 식품 조성물에는 건강기능식품이 포함될 수 있다. 본 발명에 있어서, "건강기능식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미하며, 더욱 구체적으로는 피부 탄력과 피부 주름을 개선하는 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법으로 제조 가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다.
또한, 상기 건강기능식품의 제형 또한 건강기능식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 발명의 건강기능식품은 피부 보습 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
본 발명의 건강기능식품이 취할 수 있는 형태에는 제한이 없으며, 통상적인 의미의 식품을 모두 포함할 수 있고, 기능성 식품 등 당업계에 알려진 용어와 혼용이 가능하다. 아울러 본 발명의 건강기능식품은 당업자의 선택에 따라 식품에 포함될 수 있는 적절한 기타 보조 성분과 공지의 첨가제를 혼합하여 제조할 수 있다. 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 본 발명에 따른 아네모시스 켈리포니카 추출물을 주성분으로 하여 제조한 즙, 차, 젤리 및 주스 등에 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 동물을 위한 사료로 이용되는 식품도 포함한다.
또한, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 아네모시스 켈리포니카 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 탄력 및 주름개선용 의약외품 조성물을 제공한다. 본 발명의 상기 아네모시스 켈리포니카 추출물과 피부 탄력 및 피부 주름 개선의 효과는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 의약외품 조성물에는 상기 성분 외에 필요에 따라 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더욱 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제는 본 발명의 효과를 해하지 않는 한 제한되지 않으며, 예를 들어 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제, 윤활제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제의 대표적인 예로는, 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 젤라틴, 글리세린, 아카시아 고무, 알지네이트, 칼슘포스페이트, 칼슘카보네이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 식물성 오일, 주사가능한 에스테르, 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우리지 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 아네모시스 켈리포니카 추출물을 의약외품으로 사용하는 경우, 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 예컨대, 공지의 피부 탄력 및 주름 개선 성분을 포함할 수 있을 것이다. 추가적인 피부 탄력 및 주름 개선 성분을 포함하게 되면 본 발명 조성물의 효과는 더욱 증가할 수 있다. 상기 성분 추가 시에는 복합 사용에 따른 피부 안전성, 제형화의 용이성, 유효성분들의 안정성을 고려할 수 있다. 상기 의약외품 조성물은 당업계에 공지된 피부 주름 개선 성분으로서, 캐모마일 꽃 추출물, 로즈마리 잎 추출물, 할미꽃 잎 추출물, 어스니어 추출물, 인삼 추출물, 제라늄 꽃 추출물, 고삼 추출물, 쐐기풀 추출물, 야로우 추출물, 클로브 추출물, 펜넬 추출물, 파파야 잎 추출물, 해바라기 추출물, 정향 추출물 등으로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 성분을 추가로 포함할 수 있다. 추가 성분은 전체 조성물 중량에 대하여 0.001 중량% 내지 10중량%로 포함될 수 있을 것이며, 상기 함량 범위는 피부 안전성과, 아네모시스 켈리포니카 추출물의 제형화 시의 용이성 등의 요건에 따라 조절될 수 있을 것이다.
본 발명의 의약외품 조성물은 소독 청결제, 샤워폼, 연고액, 물티슈, 코팅제 등을 예시할 수 있으나 이에 제한되는 것이 아니며, 의약외품의 제제화 방법, 용량, 이용방법, 구성성분 등은 기술 분야에 공지된 통상의 기술로부터 적절히 선택될 수 있다.
또한, 본 발명의 아네모시스 켈리포니카 추출물은 개체의 피부에 도포하는 단계를 포함하는, 피부 탄력 및 주름 개선 방법에 사용될 수 있다. 상기 개체는 쥐, 가축, 인간 등을 포함하는 포유동물을 제한 없이 포함한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 아네모시스 켈리포니카 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 탄력 및 주름 개선용 조성물을 제공한다.
(b) 본 발명의 조성물은 타닌산(Tannic acid), 클로로겐산(Chlorogenic acid) 및 아피제닌(Apigenin)의 성분들을 다량 함유하고, 아네모시스 켈리포니카 추출물은 자유라디칼 소거 활성 효과가 뛰어나며, ROS 저해 활성이 우수하고, 자외선으로 인한 진피 섬유아세포의 사멸을 억제할 뿐만 아니라, ERK, p38 및 JNK 단백질과 AP-1 단백질의 인산화를 억제하고, MMP-1(matrix metalloproteinase-1) 유전자의 발현을 억제하는 동시에 프로콜라겐 타입 I(Procollagen type Ⅰ) 단백질의 발현을 촉진하여 피부 탄력 및 주름 개선에 우수한 효과를 나타낸다.
(c) 또한, 본 발명의 조성물은 천연 추출물인 아네모시스 켈리포니카 추출물을 원료로 하여 인체에 매우 안전할 뿐만 아니라, 안정성도 매우 탁월하여 화장품 및 의약품 분야에서 유용하게 이용 가능하다.
도 1은 아네모시스 켈리포니카 추출물의 크로마토그램 결과이다.
도 2는 본 발명의 아네모시스 켈리포니카 추출물의 처리 농도에 따른 진피 섬유아세포(NHDF)의 세포 생존율을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 아네모시스 켈리포니카 추출물의 처리 농도에 따른 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 아네모시스 켈리포니카 추출물의 처리 농도에 따른 ABTS 라디칼 소거 활성을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 아네모시스 켈리포니카 추출물의 처리 농도에 따른 진피 섬유아세포(NHDF) 내부의 ROS 소거 활성을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 아네모시스 켈리포니카 추출물의 처리 농도에 따른 MMP-1(matrix metalloproteinase-1) 효소의 활성 억제율을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 아네모시스 켈리포니카 추출물의 처리 농도에 따른 MAP Kinase 효소의 구성원인 p38, ERK 및 JNK 단백질의 인산화를 측정한 웨스턴 블롯 결과 사진이다.
도 8은 본 발명의 아네모시스 켈리포니카 추출물의 처리 농도에 따른 c-Jun 및 c-FOS 단백질의 인산화를 측정한 웨스턴 블롯 결과 사진이다.
도 9는 본 발명의 아네모시스 켈리포니카 추출물의 처리 농도에 따른 MMP-1 및 프로콜라겐 타입 I(Procollagen type Ⅰ) 단백질의 발현 변화를 측정한 웨스턴 블롯 결과 사진이다.
도 2는 본 발명의 아네모시스 켈리포니카 추출물의 처리 농도에 따른 진피 섬유아세포(NHDF)의 세포 생존율을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 아네모시스 켈리포니카 추출물의 처리 농도에 따른 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 아네모시스 켈리포니카 추출물의 처리 농도에 따른 ABTS 라디칼 소거 활성을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 아네모시스 켈리포니카 추출물의 처리 농도에 따른 진피 섬유아세포(NHDF) 내부의 ROS 소거 활성을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 아네모시스 켈리포니카 추출물의 처리 농도에 따른 MMP-1(matrix metalloproteinase-1) 효소의 활성 억제율을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 아네모시스 켈리포니카 추출물의 처리 농도에 따른 MAP Kinase 효소의 구성원인 p38, ERK 및 JNK 단백질의 인산화를 측정한 웨스턴 블롯 결과 사진이다.
도 8은 본 발명의 아네모시스 켈리포니카 추출물의 처리 농도에 따른 c-Jun 및 c-FOS 단백질의 인산화를 측정한 웨스턴 블롯 결과 사진이다.
도 9는 본 발명의 아네모시스 켈리포니카 추출물의 처리 농도에 따른 MMP-1 및 프로콜라겐 타입 I(Procollagen type Ⅰ) 단백질의 발현 변화를 측정한 웨스턴 블롯 결과 사진이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1. 아네모시스 켈리포니카 추출물의 제조
아네모시스 켈리포니카의 전초를 흐르는 물에 세척하여 불순물을 제거한 후, 전초 100g 기준으로 70% 에탄올 수용액 500mL를 가하여 1일간 실온에서 교반하여 추출하였다. 상기 과정은 3-Batch로 진행하였다. 얻어진 추출액을 모은 후, 40℃ 이하에서 감압 농축한 후, 동결건조하여 분말형태로 제조하였으며, 수득율은 28.3% 였다(제조예 1).
실시예 2. 아네모시스 켈리포니카 추출물의 성분분석
상기 실시예 1에서 제조한 아네모시스 켈리포니카 추출물들의 지표 성분의 함량을 분석하였다.
고속 액체크로마토 그래피 분석은 Thermo UHPLC U3000 기기(모델명, 제조사, 국가)를 사용하였다. HPLC 분석 조건은 다음과 같다. 컬럼은 Sunfire TM C18 column(Waters, 250×4.6mm, 5μm)을 이용하였으며, 컬럼 온도는 25℃로 하였다. UV 파장은 272nm 및 300nm에서 측정하였으며 이동상은 0.1% 포름산이 포함된 물과 아세토나이트릴(gradient mode)을 사용하였다.
상기 실시예 1에서 제조한 아네모시스 켈리포니카 추출물(제조예 1)은 이동상 용매에 1mg/㎖의 농도로 용해하여 10uL를 주입한 후 유속 1㎖/min으로 측정하였다. 상기 추출물의 지표성분 함량을 하기 [표 1]에 나타내었다.
[표 1]
상기 [표 1] 및 [도 1]을 참조하면, 아네모시스 켈리포니카 추출물은 타닌산(Tannic acid), 클로로겐산(Chlorogenic acid), 아피제닌(Apigenin)을 다량 함유하고 있는 것으로 분석되었다.
실험예 1. 아네모시스 켈리포니카 추출물의 세포 독성
상기 실시예 1에서 제조한 본 발명의 아네모시스 켈리포니카 추출물의 진피 섬유아 세포에 대한 세포독성을 확인하였다.
구체적으로, 진피 섬유아세포를 10% 소태아혈청(fetal bovine serum)이 함유된 DMEM을 이용하였고, 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양하였다. 세포 배양용 96-웰 플레이트에 합류(confluent) 상태까지 배양한 후, 아네모시스 켈리포니카 추출물을 각각 1, 10, 50 및 100㎍/㎖ 농도로 처리하고, 48시간 후에, MTT(tetrazolium bromide salt)를 처리하여 2시간 동안 배양시켰다. 배양 후, 모든 배양액을 제거하고 DMSO 100㎕를 분주하여 생성된 포르마진(formazin)을 녹인 뒤 마이크로플레이트 리더기(microplate reader)로 570nm(determination wave) 및 690nm(reference wave) 파장에서 흡광도를 측정하였다.
실험 결과, 본 발명의 아네모시스 켈리포니카 추출물은 50㎍/㎖ 농도까지세포독성을 나타내지 않는 것으로 확인되었으며, 100㎍/㎖ 농도에서 진피 섬유아세포의 생장을 다소 저해하는 것으로 확인되었다(도 2).
실험예 2. 아네모시스 켈리포니카 추출물의 항산화 활성
2-1. DPPH 라디칼 소거 활성
산화적 스트레스는 신경세포의 신호전달 체계를 작동시키고 과산화수소 등의 활성산소종의 발생을 증가시키며, 항산화 효소의 발현을 감소시킨다. 이러한 활성산소종의 증가는 유전자와 단백질의 구조를 변화시켜 세포 내 및 세포 외의 항상성이 파괴되어 신경세포의 손상을 유발한다. 이와 같은 신경세포의 손상을 유발하는 활성산소종의 하나인 DPPH 라디칼의 억제 활성은 항산화 효능을 평가하는 중요한 지표가 된다.
DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, Sigma, USA)의 환원력을 이용하는 상등의 문헌(Sang S et al., J.Agric. Food Chem. 50(8), p2459-2463, 2002)에 기재된 방법에 따라, 본 발명에 따른 아네모시스 켈리포니카 추출물의 항산화 활성을 측정하였다.
실시예 1에서 준비한 아네모시스 켈리포니카 추출물을 각각 1, 10, 50, 100, 및 250㎍/㎖ 농도로 96-웰마이크로 플레이트에 넣고 37℃에서 30분간 배양한 후, 환원된 DPPH의 양을 분광 광도계(Precision microplate reader; Molecular Devices, VersaMax)를 이용하여 520nm에서 흡광도를 측정하여 시료를 가하지 않는 무첨가 대조군과 활성을 비교하였다. 상기 시험은 3회 반복하였으며, 측정 결과를 도 3에 나타내었다. 비교 실험을 위해 아스코르브산(Ascorbic acid)을 양성대조군으로 사용하였다.
실험 결과, 본 발명의 아네모시스 켈리포니카 추출물이 처리된 실험군은 시료 무처리 음성대조군에 비하여 전반적으로 매우 우수한 항산화 효과를 보이는 것을 관찰할 수 있었고, 이러한 항산화 효과 수치들은 양성대조군인 아스코르브산 처리군과 비교하였을 때도 유사한 수준인 것으로 나타났으며, 매우 우수한 항산화 활성이 있는 것으로 분석되었다.
2-2. ABTS 라디칼 소거 활성
2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산)(ABTS) 라디칼 양이온 소거능은 디암모늄염과 과황화칼륨과의 반응으로 ABTS 라디칼이 생성되면 특유의 색인 청록색을 띄게 되는데, 항산화 효과를 나타내는 시료를 첨가함에 따라 연한 녹색으로 탈색(decolorization)되는 현상을 이용하는 방법이다.
ABTS 라디칼을 이용한 항산화능 측정 시험은 7mM 2,2'-아지노-bis(3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산)과 2.4 mM 과황화칼륨을 혼합하여 사용 전 16시간 동안 빛을 차단하고 실온에서 반응시켰다. 반응 후 ABTS 1㎖(in PBS, pH 7.4)에 상기 실시예 1에 따라 준비된 아네모시스 켈리포니카 추출물을 각각 1, 10, 50, 100 및 250㎍/㎖(in PBS, pH 7.4) 농도로 첨가하여 반응시킨 후, 10분 뒤 원심분리하고, 상층액만 취득하여 734nm에서 흡광도를 측정하였다. 비교 실험을 위해 아스코르브산(Ascorbic acid)을 양성대조군으로 사용하였다.
실험 결과, 본 발명의 아네모시스 켈리포니카 추출물이 처리된 실험군은 음성대조군에 비하여 모든 구간에서 매우 우수한 항산화 효과를 보이는 것을 관찰할 수 있었고, 이러한 항산화 효과 수치들은 양성대조군인 아스코르브산 처리군과 비교하였을 때도 유사한 수준인 것으로 나타났으며, 매우 우수한 항산화 활성을 갖는 것으로 분석되었다(도 4).
특히, 50㎍/㎖ 농도 이상 구간에서는 ABTS 라디칼 양이온 소거능이 80% 이상인 것으로 나타나는 점은 주목할만한 특징으로 보이며, 이러한 강력한 항산화 활성은 본 발명의 아네모시스 켈리포니카 추출물을 소재로 이용하여 상품화할 때 유용할 것으로 사료된다.
2-3. 세포 내 ROS 소거 활성
진피 섬유아세포의 ROS 생성량을 측정하기 위하여 진피 섬유아세포를 10% FBS(fetal bovine serum), 1% 페니실린을 포함하는 DMEM 배지에 접종하여 37℃, 5% CO2 조건에서 24∼48시간 계대 배양하여 실험에 사용하였다.
진피 섬유아세포를 1.2×105 내지 1.2×106 세포 농도로 분주하고, 본 발명의 아네모시스 켈리포니카 추출물을 1, 10 및 50㎍/㎖ 농도로 처리하여 48시간 동안 배양하였다. 양성대조군으로는 아스코르브산을 사용하였다. 배양 후, 멸균된 PBS(pH7.4)를 이용하여 2회 세척 후, DCFDAFL-2 염료로 30분 동안 세포를 염색시키고, 차가운 PBS로 2회 세척하였다. 0.05% TE를 넣어 세포를 떼어내준 뒤, 차가운 PBS로 세포를 모아 튜브로 옮기고, 원심분리기를 통해 세포를 가라앉혔다. 상층액은 제거하고 차가운 PBS 용액으로 세포를 부유시킨 후, 튜브에 담아 아이스박스에서 차갑게 유지하였다. 이후, FACs 기기로 ROS 농도를 측정하였다.
실험 결과, 본 발명의 아네모시스 켈리포니카 추출물은 진피 섬유아세포 내의 ROS 생성을 농도의존적으로 감소시켜 ROS 소거능이 우수한 것으로 나타났다(도 5). 특히, 50㎍/㎖ 처리군에서는 UVB 조사 음성대조군과 비교하여 진피 섬유아세포 내 라디칼의 생성을 57.7% 감소시키는 것으로 나타났으며, 상기 결과를 통해 본 발명의 아네모시스 켈리포니카 추출물은 산화 스트레스에 대해 뛰어난 세포보호 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 3. 아네모시스 켈리포니카 추출물의 MMP-1 효소 활성 저해능
MMP-1(matrix metalloproteinase-1) 저해 활성에 따른 피부 주름 개선 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1에서 제조한 아네모시스 켈리포니카 추출물의 처리에 따른 MMP-1 효소의 활성 변화를 측정하였다.
구체적으로, 본 발명의 아네코시스 켈리포니카 추출물을 각각 1, 10 및 50㎍/㎖ 농도로 사용하였다. 실험 진행 하루 전 포획 항체(Capture Antibody)를 이용하여 96-웰 플레이트를 코팅시켰다. 24시간 뒤 워싱 버퍼(Washing buffer)로 코팅된 플레이트를 세척하였다. 시약 희석제(Reagent Diluent)를 이용하여 1시간 동안 블록킹 한 후, 워싱 버퍼(Washing buffer)로 플레이트를 세척하고, 샘플과 스텐다드를 넣고 2시간 동안 반응시켰다. 이후, 워싱 버퍼(Washing buffer)로 플레이트를 세척하고, 검출 항체(Detection Antibody)를 넣고 2시간 반응시키고, 워싱 버퍼(Washing buffer)로 플레이트를 세척하였다. 스트렙트애비딘-HRP(Streptavidin-HRP)을 넣어주고, 어두운 곳에서 20분간 반응시키고, 워싱 버퍼로 플레이트를 세척하였다. 마지막으로 기질 용액(Substrate Soluction)을 넣고 어두운 곳에서 20분간 반응시킨 후, 스톱 솔루션(Stop soluction)을 가하여 천천히 흔들어 준 뒤 450nm에서 ELISA 기기로 MMP-1 효소의 활성을 측정하였다.
실험 결과, 본 발명의 아네모시스 켈리포니카 추출물은 농도 의존적으로 MMP-1 효소 활성을 저해하는 것으로 관찰되었는데, 50㎍/㎖ 농도로 처리한 시험군에서는 UVB 조사 무처리 음성대조군과 비교하여 MMP-1 효소 활성을 21.2% 저해하는 것으로 나타났다(도 6). 상기 실험 결과를 통해, 본 발명의 아네모시스 켈리포니카 추출물이 MMP-1 효소 활성을 저해하는데 효과적이고, 이를 통해 피부 탄력 및 주름개선용 소재로 활용될 수 있음을 확인할 수 있었다.
실험예 4. 단백질 인산화 억제
4-1. 웨스턴 블롯 분석(Western blotting analysis)
진피 섬유아세포 내에서 아네모시스 켈리포니카 추출물의 처리에 따른 단백질 인산화 변화를 확인하기 위하여 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)을 실시하였다.
실험은 40mm 세포 배양 접시에 2㎖의 DMEM 배양액을 넣고, 인간 진피섬유아세포를 약 1.2x105 농도로 접종한 후, 37℃, 5% CO2 환경에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후, UVB를 144mJ/cm2 조건으로 조사하였고, 샘플을 포함한 배지로 교체하여 3일간 배양하였다. 세포를 회수하여 용해 버퍼(lysis buffer)(pH 7.4 50mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 1 mMEDTA, 1 mMEGTA, 10mg/mL aprotinin, 10mg/mL leupeptin, 5mM phenylmethylsulfonyl fluoride 및 1mM DTT)를 이용하여 단백질을 추출하였다. 추출한 단백질을 BCA protein assay kit(Thermo, Waltham, MA, USA)를 사용하여 정량하였으며, 20μL의 단백질을 10% SDS-PAGE로 전기영동하고 PVDF 멤브레인(Merck, Billerica, MA, USA)에 옮겼다. 멤브레인은 1차 항체와 반응시키고, TBS-T로 10분간 3회 세척한 후, 2차 항체로 1시간 반응시켰다. 항체들에 대한 발현 분석은 HRP(horseradish peroxidase-linked) 이차 항체에 의해 발현되는 ECL(enhanced chemiluminescence)을 이용하였으며, 이미징 시스템(Imaging system)을 이용하여 비교 분석하였다.
4-2. MAPKs(mitigen activated protein kinases) 단백질의 인산화 억제
UVB 유도에 의한 MMPs 발현에 중요한 역할을 하는 전사인자로 알려진 NF-κB와 AP-1은 MAP Kinase 효소에 의해 활성화되는 것으로 알려져 있다. MAP Kinase는 ERK 단백질과 p38 및 JNK 단백질로 구성되어 있으며, UVB 자극에 의해 활성을 나타내는 인산화 형태로 유도된다고 알려져 있다. UVB 조사된 진피 섬유아세포에서 본 발명의 아네모시스 켈리포니카의 처리에 따른 인산화 정도를 평가하기 위해, 실시예 4-1의 실험방법으로 MAPKs(mitigen activated protein kinases) 단백질에 대한 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)을 수행하였다.
분석 결과, UVB 조사로 인해 MAP Kinase 효소의 구성원인 p38, ERK 및 JNK 단백질의 인산화가 증가한 것으로 나타났다. 한편, 본 발명의 아네모시스 켈리포니카 추출물을 처리한 시험군에서는 UVB 조사에도 불구하고 ERK, p38 및 JNK 단백질의 인산화가 억제되는 것으로 확인되었다(도 7).
4-3. AP-1(Activator protein-1) 단백질의 인산화 억제
AP-1(Activator protein-1) 단백질은 자외선에 의한 피부세포 노화에서 중요한 역할을 하는 전사인자로 MMPs 효소의 발현을 강력히 조절하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 아네모시스 켈리포니카 추출물의 세포 내 기전을 명확하게 확인하기 위하여, UVB 조사된 진피 섬유아세포에서 AP-1의 구성인자인 c-Jun 및 c-FOS 단백질에 대한 인산화 억제를 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis) 방법으로 확인하였다.
분석 결과, UVB 조사로 AP-1의 구성 인자인 c-Jun 및 c-FOS 단백질의 인산화가 유도되어 이를 통해 AP-1 단백질의 활성화가 증가된 것을 확인할 수 있었다. 이에 반해 본 발명의 아네모시스 켈리포니카 추출물을 처리한 시험군에서는 농도 의존적으로 c-Jun 및 c-FOS 단백질의 인산화가 억제되는 것을 확인할 수 있었다(도 8).
상기와 같은 결과를 통해 본 발명의 아네모시스 켈리포니카 추출물이 c-Jun 및 c-FOS 단백질의 인산화를 억제하고, 이를 통해 전사인자인 AP-1 단백질의 활성을 저해시키며, MMPs 효소의 발현을 억제하는 것을 확인할 수 있었다.
4-4. MMP-1 및 Procollagen type Ⅰ 단백질 발현 변화
자외선에 의한 피부 노화에서 MMP-1 효소의 발현은 하나의 표지자 및 표적 유전자로 알려져 있으며, MMP-1 효소는 피부 콜라겐을 분해하여 피부 주름의 생성을 촉진하게 된다. 따라서, UVB 조사된 진피 섬유아세포에서 본 발명의 아네모시스 켈리포니카 추출물의 처리에 따른 MMP-1 단백질 및 Procollagen type Ⅰ 단백질의 발현 변화를 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)으로 확인하였다.
실험 결과 도 9를 참조하면, UVB 조사에 의해 증가한 MMP-1 단백질의 발현 증가가 본 발명의 아네모시스 켈리포니카 추출물의 처리로 인해 농도 의존적으로 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, UVB 조사에 의해 감소한 Procollagen type Ⅰ 단백질의 발현이 본 발명의 아네모시스 켈리포니카 추출물의 처리로 인해 농도 의존적으로 증가함을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 통해, 본 발명의 아네모시스 켈리포니카 추출물이 UVB 조사로 유도된 증가된 MMP-1 단백질의 발현을 억제하고, Procollagen type Ⅰ 단백질의 발현을 증가시켜 피부 탄력이 줄어드는 것을 방지할 수 있음을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다.
따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (7)
- 아네모시스 켈리포니카 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 탄력 및 주름개선용 화장료 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 아네모시스 켈리포니카 추출물은 타닌산(Tannic acid), 클로로겐산(Chlorogenic acid) 및 아피제닌(Apigenin)을 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 탄력 및 주름개선용 화장료 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 아네모시스 켈리포니카 추출물은 항산화 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 피부 탄력 및 주름개선용 화장료 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 아네모시스 켈리포니카 추출물은 MMP-1(matrix metalloproteinase-1) 단백질의 발현을 억제하고, 프로콜라겐 타입 I(Procollagen type Ⅰ) 단백질의 발현을 촉진하는 것을 특징으로 하는 피부 탄력 및 주름개선용 화장료 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 아네모시스 켈리포니카 추출물은 ERK, p38 및 JNK 단백질의 인산화를 억제하고, c-Jun 및 c-FOS 단백질의 인산화를 억제하는 것을 특징으로 하는 피부 탄력 및 주름개선용 화장료 조성물. - 아네모시스 켈리포니카 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 탄력 및 주름개선용 식품 조성물.
- 아네모시스 켈리포니카 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 탄력 및 주름개선용 의약외품 조성물.
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