KR101451629B1 - 스미자임 ＡＣ를 이용한 진세노사이드 Ｒｇ2의 제조방법 - Google Patents

스미자임 ＡＣ를 이용한 진세노사이드 Ｒｇ2의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 과일과 채소류의 농축액 제조 및 여과 수율 향상을 위해 사용되는 효소를 이용하여 진세노사이드 Rg2를 제조하는 방법에 관한 기술이다.
이러한 본 발명인 스미자임 AC를 이용한 진세노사이드 Rg2의 제조방법은, 진세노사이드 Rg2의 제조방법에 있어서, 진세노사이드가 함유된 수삼추출물 수용액에 아스페르질루스 니제르로부터 획득되는 스미자임 AC를 첨가하여 제조하며, 상기 수삼추출물 수용액은 증류수 93~98 중량%에 수삼추출물이 2~7 중량%가 함유된 2~7% 수삼추출물 수용액을 사용하며, 상기 2~7% 수삼추출물 수용액 90~92 중량%에 스미자임 AC를 8~10 중량%를 첨가한다.

Description

스미자임 ＡＣ를 이용한 진세노사이드 Ｒｇ2의 제조방법{Manufacturing Method for Ginsenoide Rg2 using Sumizyme AC}
본 발명은 과일과 채소류의 농축액 제조 및 여과 수율 향상을 위해 사용되는 효소를 이용하여 진세노사이드 Rg2의 제조하는 방법에 관한 기술이다.
수삼은 각성 효과, 스태미나 증대, 각종 스트레스에 대한 저항성 외에도 치매 예방 효과 등으로 꾸준히 연구되고 있는 작물이다. 수삼은 항암, 항당뇨, 신경보호, 항노화 효과 등 다양한 약리 활성을 가지고 있는데 진세노사이드(ginsenoside)는 수삼의 주요 약리활성 성분으로 간주된다. 특히 고려수삼에는 30여종의 진세노사이드 성분이 알려져 있고, 이러한 진세노사이드 성분들은 각각 다양한 약효를 나타내고, 그 구조에 따라 약효의 종류와 강도가 다르게 나타난다.
이 중 진세노사이드 Rg2는 수삼 속 식물에는 극미량이 존재하는 성분이나 혈소판응집억제, 항트롬빈, 플라스민 활성촉진, 기억감퇴개선 및 평활근세포 증식억제 등의 효과가 있는 생리활성성분으로 알려진 물질로 간단하면서도 수득률 높은 대량 제조가 필요한 실정이다.
수삼의 주요 유효성분은 진세노사이드로 명명되는 트리테르펜 사포닌(triterpene saponin)으로, 이들 대부분은 비당부(aglycone)의 구조가 4개의 환상구조를 기본골격으로 하는 담마란계 진세노사이드이다. 일반적으로 진세노사이드의 추출정제는 주로 수삼을 메탄올로 추출,농축하여 디에틸에텔, 클로로포름과 같은 지용성 유기용매로 지방질을 제거한 후, 수포화 n-부탄올로 추출분획, 농축하여 조사포닌을 얻은 다음, 실리카겔의 흡착성을 이용한 컬럼크로마토그라피 분리과정을 거쳐 진세노사이드를 종류별로 분리, 정제하는 것이 통상적인 방법이다. 이 분리 정제과정에서 컬럼크로마토그라피의 전개용매로서 메탄올, 클로로포름 등의 혼합용매를 사용하여 진세노사이드 분획을 수득하게 된다.
이러한 실리카겔을 사용하는 종래의 방법은 실리카겔의 흡착성질에 의한 것으로 상당량의 함량이 흡착되어 제조수율이 수삼, 백삼, 홍삼에서 0.02% 미만으로 매우 낮아 진세노사이드 Rg2 성분을 분리 정제하여 활용하는데 부적합한 방법에 그치고 있다. 진세노사이드 Rg2는 수삼 속 식물에는 극미량이 존재하는 성분으로, 수삼에서 종래의 방법으로 분리 정제하는 것은 비용이 많이 들며 수율도 매우 낮아 실용화하는 데는 부적합하다.
이에 효소를 이용하여 진세노사이드 Rg2의 수율을 높인 진세노사이드 Rg2를 제조하는 방법의 기술이 제공되어 있다.
특허문헌 (KR) 등록특허 제10-0620107호로서 제공되는 컬럼크로마토그래피 방법에 의한 진세노사이드 Rg2를 제조하는 방법과, 특허문헌 (KR) 등록특허 제10-0204002호로서 제공되는 효소인 베타-갈락토시다제를 이용하여 진세노이드 Rg2를 제조하는 방법 등의 다양한 기술이 제공되어 있다.
(KR) 등록특허 제10-0204002호 (KR) 등록특허 제10-0620107호
본 발명 또한 종래의 진세노사이드 Rg2를 제조하는 방법과 같이 효소를 이용하여 진세노사이드 Rg2를 제조하는 방법으로 종래에 사용되고 있지 않은 효소를 이용하여 진세노사이드 Rg2를 제조하고자 하는 것이다.
즉, 본 발명은 과채류 가공에 적합한 아스페르질루스 니제르(Aspergillus niger)의 배양물에서 얻어지는 복합효소((주)비전바이오켐의 공급 상품:스미자임 AC)를 사용하여 진세노사이드 Rg2를 제조하는 방법을 제공하고자 하는 것이다.
상기 아스페르질루스 니제르(Aspergillus niger)의 배양물에서 얻어지는 복합효소는 과채류 가공에 적합한 셀룰라아제(cellulase), 베타-글루카나아제(β-glucanase), 헤미셀룰라아제(hemicellulase)의 복합 효소이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 발명된 본 발명인 스미자임 AC를 이용한 진세노사이드 Rg2의 제조방법은 진세노사이드 Rg2의 제조방법에 있어서, 진세노사이드가 함유된 수삼추출물 수용액에 아스페르질루스 니제르로부터 획득되는 복합효소((주)비전바이오켐의 공급 상품:스미자임 AC)를 첨가하여 제조한다.
상기 수삼추출물 수용액은 증류수 93~98 중량%에 수삼추출물이 2~7 중량%가 함유된 2~7% 수삼추출물 수용액을 사용하며, 상기 2~7% 수삼추출물 수용액 90~92 중량%에 스미자임 AC를 8~10 중량%를 첨가한다.
상기 수삼추출물 수용액과 스미자임 AC로 이루어진 혼합물을 48~72시간 동안 60~80℃로 가열하고 100~140rpm으로 교반시켜 진세노사이드 Rg2를 제조한다.
상기와 같이 이루어진 본 발명의 스미자임 AC를 이용한 진세노사이드 Rg2의 제조방법은 과실과 채소류의 농축액 제조 및 여과 수율을 향상시키기 위하여 사용되는 효소로 이루어진 아스페르질루스 니제르로부터 획득되는 스미자임 AC를 사용하여 진세노사이드 Rg2를 제조함으로써 식품으로의 사용가능한 장점이 있다.
또한, 본 발명은 종래에 사용하고 있지 않은 아스페르질루스 니제르로부터 획득되는 스미자임 AC의 복합효소를 사용하고, 이 스미자임 AC의 복합효소를 이용한 진세노사이드 Rg2의 제조방법은 간단함으로써 생산단가를 낮출 수 있어 소비자들의 부담을 줄일 수 있는 동시에 경쟁력을 확보할 수 있는 장점이 있다.
또한, 본 발명의 스미자임 AC를 이용한 진세노사이드 Rg2의 제조방법은 간단한 제조방법으로도 높은 함량의 진세노사이드 Rg2를 획득할 수 있는 장점이 있다.
도 1은 진세노사이드 표준혼합물(STD Mix)과, 스미자임 AC(복합효소)와 반응 후 수삼추출물의 TLC상에서의 Rg2의 전환 여부.
도 2는 Rg2 표준품의 HPLC 크로마토그램.
도 3은 스미자임 AC(복합효소)와 반응 전인 수삼추출물 HPLC 크로마토그램.
도 4는 스미자임 AC(복합효소)와 24시간 반응 후의 HPLC 크로마토그램(여기서, 1은 Rg1, 2는 Re, 3은 Rg2, 4는 Rb2, 5는 Rd, 6은 Rg3이다).
도 5는 스미자임 AC(복합효소)와 48시간 반응 후의 HPLC 크로마토그램(여기서, 1은 Rg1, 2는 Re, 3은 Rg2, 4는 Rb2, 5는 Rd, 6은 Rg3이다).
도 6은 스미자임 AC(복합효소)와 72시간 반응 후의 HPLC 크로마토그램(여기서, 1은 Rg1, 2는 Re, 3은 Rg2, 4는 Rb2, 5는 Rd, 6은 Rg3이다).
본 발명의 여러 실시 예들을 상세히 설명하기 전에, 다음의 상세한 설명에 기재되거나 도면에 도시된 구성요소들의 구성 및 배열들의 상세로 그 응용이 제한되는 것이 아니라는 것을 알 수 있을 것이다. 본 발명은 다른 실시 예들로 구현되고 실시될 수 있고 다양한 방법으로 수행될 수 있다. 또, 장치 또는 요소 방향(예를 들어 "전(front)", "후(back)", "위(up)", "아래(down)", "상(top)", "하(bottom)", "좌(left)", "우(right)", "횡(lateral)")등과 같은 용어들에 관하여 본원에 사용된 표현 및 술어는 단지 본 발명의 설명을 단순화하기 위해 사용되고, 관련된 장치 또는 요소가 단순히 특정 방향을 가져야 함을 나타내거나 의미하지 않는다는 것을 알 수 있을 것이다. 또한, "제 1(first)", "제 2(second)", 및 "제 3(third)"과 같은 용어는 설명을 위해 본원 및 첨부 청구항들에 사용되고 상대적인 중요성 또는 취지를 나타내거나 의미하는 것으로 의도되지 않는다.
본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위해 아래의 특징을 갖는다.
이하 첨부된 도면을 참조로 본 발명의 바람직한 실시 예를 상세히 설명하도록 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
따라서, 본 명세서에 기재된 실시 예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일 실시 예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형 예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
본 발명은 혈소판응집억제, 항트롬빈, 플라스민 활성촉진, 기억감퇴개선 및 평활근세포 증식억제 등의 효능을 가지는 진세노사이드 Rg2의 제조방법에 관한 기술이다.
상세하게는 진세노이드가 함유된 수삼추출물 수용액에 아스페르질루스 니제르로부터 획득되는 복합효소((주)비전바이오켐의 공급 상품:스미자임 AC)를 첨가하여 진세노사이드 Rg2를 제조한다.
상기 수삼추출물 수용액은 증류수와 수삼추출물의 혼합물이다. 보통 수삼추출물은 증류수 93~98 중량%에 수삼추출물 2~7 중량%가 함유된 2~7% 수삼추출물 수용액을 사용한다.
본 발명인 스미자임 AC를 이용한 진세노사이드 Rg2의 제조방법을 설명하면,
증류수와 수삼추출물이 혼합된 2~7% 수삼추출물 수용액 90~92 중량%에 아스페르질루스 니제르로부터 획득되는 스미자임 AC를 8~10 중량%를 첨가하고, 상기 혼합물(수삼추출물 수용액과 스미자임 AC)을 48~72시간 동안 60~80℃로 가열하고 100~140rpm으로 교반시켜 진세노사이드 Rg2를 제조한다.
상기 복합효소(상품명:스미자임 AC)는 아스페르질루스 니제르(Aspergillus niger)의 배양물에서 얻어지는 것으로 과채류 가공에 적합한 셀룰라아제(cellulase), 베타-글루카나아제(β-glucanase), 헤미셀룰라아제(hemicellulase)의 복합 효소이다.
상기 아스페르질루스 니제르(Aspergillus niger) 곰팡이는 많은 양의 셀룰라아제(cellulase)를 생산해내는 능력이 있으며 이 셀룰라아제(cellulase)는 진세노사이드와 반응하게 되면 단기간 내에 Re에서 C20 위치에서 글루코스 기를 떼어 냄으로써 Rg2가 생성되게 된다.
이하, 실험방법과 실시 예를 통하여 본 발명인 스미자임 AC를 이용한 진세노사이드 Rg2의 제조방법을 이해한다.
실험방법.
증류수 98 중량%에 수삼추출물 2 중량%를 첨가하여 증류수에 수삼수출물을 녹여 2% 수삼추출물 수용액을 제작하고, 상기 2% 수삼추출물 수용액 91 중량%에 갈색의 액상 효소인 스미자임 AC 9 중량% 첨가하여 혼합물을 만든다.
상기 혼합물을 70℃의 인큐베이트에서 120rpm으로 교반하면서 24시간, 48시간, 72시간 동안 반응시킨 후 비등 수욕조에서 10분간 가열하여 효소반응을 중지시켰다.
효소반응이 끝난 반응액을 여과하여 적당량 취하여 TLC로 Rg2의 전환 여부를 확인한 후 HPLC를 이용하여 Rg2의 함량을 확인하였다.
상기 TLC는 여러 진세노사이드 표준품이 혼합되어있는 것과, 효소 반응 전의 2% 수삼추출물 수용액 그리고 효소반응 후의 반응액을 여과한 여과액을 TLC판에 적당량 점적하고 CHCl3 65Vol% : CH3OH 35Vol% : H2O 10Vol% 혼합용매로 전개한 후, 30% H2SO4를 분무하고 가열하여 발색시켜 Rg2의 전환 여부를 확인하였다.(도 1 참조)
HPLC는 TLC에서 확인된 Rg2의 함량 및 다른 진세노사이드들(Rg1, Re, Rb1, Rc, Rb2, Rd, Rg3)의 함량 변화를 알아보기 위하여 사용되었으며, 여과한 반응액을 0.22μm syringe filter로 여과하여 그것을 분석용 시료로 사용하고 Acetonitrile과 Water를 이동상으로 하여 gradient 조건으로 분석하였으며 그 분석 결과는 아래 표 1과 같다. (표 1. 효소(스미자임 AC)반응 전 수삼추출물과 효소반응 후 Rg2를 포함한 진세노이드의 함량변화)
Figure 112012075791848-pat00001
상기 표 1과 같이 HPLC 분석 결과로 효소(스미자임 AC)반응 전의 수삼추출물에서는 미량 검출되었던 Rg2가 효소(스미자임 AC)반응 24시간에서는 수삼추출물에서 6,187㎎/100g이 검출되었으며, 48시간에는 7,763㎎/100g, 72시간에는 7,974㎎/100g이 검출됨에 따라 효소반응 72시간일 때 전환율이 높은 것으로 보인다.
실시예 1.
진세노사이드 Rg1, Re, Rb1, Rb2, Rc, Rd가 함유되어 있는 수삼 추출물을 증류수에 2 중량%함량이 되도록 녹인 후 이 수용액에 액상 효소인 스미자임 AC를 9중량% 첨가한 후 40, 50, 60, 70, 80℃의 인큐베이트에서 120rpm 교반하면서 72시간 반응 시킨 후 비등 수욕조에서 10분간 가열하여 반응을 종료 시켰다. 효소반응이 끝난 반응액을 여과, 당류 및 효소를 세척하여 제거하고, 수포화 부탄올로 추출, 농축하여 무게 비에 따른 Rg2의 함량을 확인하였으며, 그 분석 결과는 아래 표 2와 같다.
Figure 112012075791848-pat00002
상기 표 2와 같이 HPLC 분석 결과로 효소(스미자임 AC)반응 전의 수삼추출물에서는 미량 검출되었던 Rg2가 효소(스미자임 AC)반응 온도 70℃에서 가장 많이 검출됨을 확인하였으며, 따라서 효소반응온도가 70℃일 때 전환율이 높은 것으로 보인다.
실시예 2.
진세노사이드 Rg1, Re, Rb1, Rb2, Rc, Rd가 함유되어 있는 인삼 추출물을 증류수에 2~5 중량% 함량이 되도록 녹인 후 이 수용액에 액상 효소인 스미자임 AC를 9 중량% 첨가한 후 70℃의 인큐베이트에서 120rpm 교반하면서 72시간 반응 시킨 후 비등 수욕조에서 10분간 가열하여 반응을 종료시켰다. 효소반응이 끝난 반응액을 여과, 당류 및 효소를 세척하여 제거하고, 수포화부탄올로 추출, 농축하여 무게 비에 따른 Rg2의 함량을 확인하였다.
Figure 112012075791848-pat00003
상기 표 3과 같이 HPLC 분석 결과로 효소(스미자임 AC)반응 전의 수삼추출물에서는 미량 검출되었던 Rg2가 효소(스미자임 AC)반응으로 다량 검출되며, 수삼추출물을 증류수에 5 중량%의 함량이 되도록 첨가한 5%의 수삼추출물 수용액에서 가장 많이 검출됨을 확인하였다.
이상과 같이, 본 발명은 비록 한정된 실시 예와 도면에 의해 설명되었으나, 본 발명은 이것에 의해 한정되지 않으며 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 기술 사상과 아래에 기재될 특허 청구범위의 균등범위 내에서 다양한 수정 및 변경이 가능함은 물론이다.

Claims (4)

  1. 스미자임 AC를 이용한 진세노사이드 Rg2의 제조방법으로서,
    진세노이드가 함유된 수삼추출물 수용액에 아스페르질루스 니제르의 배양물에서 획득되는, 셀룰라아제(cellulase), 베타-글루카나아제(β-glucanase), 헤미셀룰라아제(hemicellulase)의 복합 효소인 스미자임 AC를 첨가하여 제조함을 특징으로 하는 스미자임 AC를 이용한 진세노사이드 Rg2의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 수삼추출물 수용액은 중량대비 증류수에 수삼추출물이 2~7 중량%가 함유된 2~7% 수삼추출물 수용액을 사용하며,
    상기 2~7% 수삼추출물 수용액 90~92 중량%에 스미자임 AC를 8~10 중량%를 첨가함을 특징으로 하는 스미자임 AC를 이용한 진세노사이드 Rg2의 제조방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 2~7% 수삼추출물 수용액과 스미자임 AC로 이루어진 혼합물을 48~72시간 동안 60~80℃로 가열하고 100~140rpm으로 교반시킴을 특징으로 하는 스미자임 AC를 이용한 진세노사이드 Rg2의 제조방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 2~7% 수삼추출물 수용액과 스미자임 AC로 이루어진 혼합물을 70~72시간 동안 70±3℃ 로 가열하고 120rpm으로 교반시킴을 특징으로 하는 스미자임 AC를 이용한 진세노사이드 Rg2의 제조방법.
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