CN103102305B - 瘤果黑种草籽中具有骨架类型2的生物碱及其制备方法 - Google Patents

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CN103102305B CN201310046468.XA CN201310046468A CN103102305B CN 103102305 B CN103102305 B CN 103102305B CN 201310046468 A CN201310046468 A CN 201310046468A CN 103102305 B CN103102305 B CN 103102305B
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信学雷
陈其宾
阿吉艾克拜尔·艾萨
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Abstract

本发明涉及一种瘤果黑种草籽中具有骨架类型2的生物碱及其制备方法，该骨架类型2的生物碱的化学名称为：6-异丙基-2,2,4,8a-三甲基-8a,9-二氢-2H-环戊二烯[g]喹啉-7(8H)-酮和8a-异丙基-2,2,4,6-三甲基-8a,9-二氢-2H-环戊二烯[g]喹啉-7(8H)-酮，该方法从瘤果黑种草籽中采用有机溶剂提取，酸溶碱沉，制得总生物碱后采用pH区带高速逆流色谱法得到具有骨架类型2的生物碱成分。本发明采用的方法，简便易行，上样量大，可以此获得较多的纯品。

Description

瘤果黑种草籽中具有骨架类型2的生物碱及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种瘤果黑种草籽中具有骨架类型2的生物碱及其制备方法。
背景技术
黑种草属（Nigella）植物属于被子植物门，双子叶植物纲，毛茛科（Ranunculaceae）金莲花亚科（Helleboroideae）铁筷子族（HelleboreaeDC.）。广泛分布在地中海、中欧、西亚、新疆等地，在印度、埃及和中东地区也有种植。该属约有22种，药用植物主要有三种，分别为：瘤果黑种草（Nigella glandulifera Freyn）；果黑种草（Nigella sativa）；以及原产于欧洲南部，在新疆也有栽培的黑种草（Nigella damaseena L.）。本研究选取具新疆特有植物资源的瘤果黑种草（Nigella glandul ifera Freyn）草籽做为研究对象。
瘤果黑种草又名腺毛黑种草、斯亚旦（维语）、色拉那博（藏语）、景郎（傣语），是维吾尔族、藏族和傣族的常用药材。已收录于《中华人民共和国药典》、《中国药用植物志》、《维吾尔药志》；功能主治：刺激消化健胃、驱风止痛、补肾健脑、利尿发汗、抗蠕虫、治疗哮喘等。现有成药：十二味石榴散、复方木尼孜其颗粒及用于生发的复方斯亚旦生发油、复方斯亚旦生发酊等
国际上对黑种草籽、果黑种草籽的化学成分及活性研究较多，已经证实其具有抗感染、治疗风湿、镇痛、类雌激素活力、抗溃疡、抗病毒、抗细菌、真菌、降脂降糖等作用。但对瘤果黑种草籽的研究只有国内以及韩国的少数研究报道，信学雷等对瘤果黑种草提取物分段组分进行了降脂降糖活性的研究，发现其中的一些部位具有较好的促进Apo-AI与SR-BI之间的相互作用，进而促胆固醇逆转运的进行，以降低血脂；同时，利用PTP-1B、α-葡萄糖苷酶和蛋白非酶糖化抑制剂筛选模型对提取过程中的成分进行跟踪，已初步证实了瘤果黑种草籽中具有PTP1B、α-葡萄糖苷酶和蛋白非酶糖化抑制成分存在。迄今已从黑种草属植物中分离到的化合物类型有：黄酮类化合物，皂苷类化合物，生物碱类化合物，甾体化合物，酚类化合物，以及香豆素类化合物，醌类化合物，挥发油和多糖等。郝海峰、刘玉明、倪君君等先后从瘤果黑种草籽中分离得到了17个化合物；信学雷等从瘤果黑种草籽中分离得到了33个化合物，其中包括：7个三萜，6个黄酮，3个生物碱，4个甾体化合物，3个异苯并呋喃酮衍生物，4个酚类化合物，2个三糖，以及多种挥发油、不饱和脂肪和脂肪酸。已报道的从瘤果黑种草籽中分离得到的5个新化合物分别为：黑种草糖，黑种草三糖，黑种草碱，黑种草苷，山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖-(1→6)-O-[β-D-吡喃葡萄糖-(1→2)-O-β-D-吡喃半乳糖-(1→2)]-O-β-D-吡喃葡萄糖。本发明对瘤果黑种草籽的生物碱的研究过程中，发现了新骨架类型2的两个生物碱，分别为：6-异丙基-2,2,4,8a-三甲基-8a,9-二氢-2H-环戊二烯[g]喹啉-7(8H)-酮和8a-异丙基-2,2,4,6-三甲基-8a,9-二氢-2H-环戊二烯[g]喹啉-7(8H)-酮。
发明内容
本发明目的在于，提供一种瘤果黑种草籽中具有骨架类型2的生物碱及其制备方法，该骨架类型2的生物碱的化学名称为：6-异丙基-2,2,4,8a-三甲基-8a,9-二氢-2H-环戊二烯[g]喹啉-7(8H)-酮和8a-异丙基-2,2,4,6-三甲基-8a,9-二氢-2H-环戊二烯[g]喹啉-7(8H)-酮，该方法从瘤果黑种草籽中采用有机溶剂提取，酸溶碱沉，制得总生物碱后采用pH区带高速逆流色谱法得到具有骨架类型2的生物碱成分。
本发明所述的一种瘤果黑种草籽中具有骨架类型2的生物碱，结构式为：
其中：式（Ⅰ）为生物碱化合物，化学名称为：6-异丙基-2,2,4,8a-三甲基-8a,9-二氢-2H-环戊二烯[g]喹啉-7(8H)-酮，式（Ⅱ）为骨架类型2-1，式（Ⅲ）为生物碱化合物，化学名称为：8a-异丙基-2,2,4,6-三甲基-8a,9-二氢-2H-环戊二烯[g]喹啉-7(8H)-酮，式（Ⅳ）为骨架类型2-2。
所述的瘤果黑种草籽中具有骨架类型2的生物碱的制备方法，按下列步骤进行：
a、将粉碎的瘤果黑种草籽，加入石油醚回流脱脂，过滤，滤渣反复用石油醚脱脂5-15次，回收滤渣并干燥，再将滤渣用1/2-1倍体积的氨水:丙酮=1:2-1:4混合液浸泡过夜，干燥得干燥物；
b、将步骤a干燥物用1-3倍体积的氯仿采用微波萃取、超声萃取、渗漏、常温浸提或加热提取的方法进行提取，反复提取至无生物碱反应，每次1-3小时，滤过，收集滤液，得到氯仿提取物；
c、将步骤b氯仿提取物用氯仿溶解后，加入1-3倍体积的0.5N硫酸溶液萃取，反复萃取至无生物碱反应，收集硫酸萃取液，合并后，硫酸萃取液再用氯仿萃取，回收硫酸水层，再用氨水碱化至pH大于10，得碱化液，过滤得到黑褐色沉淀，干燥后得到黑褐色固体粉末总生物碱；
d、再将步骤c黑褐色固体粉末总生物碱，经pH区带高速逆流色谱分离，溶剂为甲基叔丁基醚:正丁醇:水=1-3:1:3-4，放在分液漏斗中，摇匀后静置分层，待平衡后，分离上下相，上相有机相为固定相，上相中加入10mM的三乙胺做为保留碱，下相水相为流动相，下相中加入10mM的盐酸做为洗脱酸，先将固定相泵入分离柱，待分离柱充满后，调整转速至700-900转/分，同时泵入流动相，流速为1.0-2.0mL/min，待平衡后，由进样阀注入样品，打开自外检测器及记录仪，检测波长254nm，按色谱图收集所有馏分，真空干燥后，经Dragendorff试剂显色以及一维和二维核磁鉴定，得到具有骨架类型2的生物碱6-异丙基-2,2,4,8a-三甲基-8a,9-二氢-2H-环戊二烯[g]喹啉-7(8H)-酮和8a-异丙基-2,2,4,6-三甲基-8a,9-二氢-2H-环戊二烯[g]喹啉-7(8H)-酮。
步骤a中脱脂草籽与氨水:丙酮的混合液的液比为1:2-1:4。
步骤b超声萃取温度为20-40℃，常温浸提温度为20-30℃，加热提取温度为沸点温度。
本发明所述所述的瘤果黑种草籽中具有骨架类型2的生物碱及其制备方法中具有骨架类型2的两个生物碱的结构鉴定：
骨架类型2-1的生物碱化合物：6-异丙基-2,2,4,8a-三甲基-8a,9-二氢-2H-环戊二烯[g]喹啉-7(8H)-酮的理化和光谱数据以及结构鉴定：黄色无定形粉末，UV（MeOH）λmax（logε）353.5（4.04）nm和277.0（3.81）nm；Dragendorff试剂反应呈阳性；HR-EST(+)MS：[M+H]+284.2017；分子式：C19H25NO；1H-NMR（CD3OD，600MHz）：δ2.13（3H，d，J=1.2Hz），1.26（3H，d，J=7.2Hz），1.29（3H，d，J=7.2Hz），1.28（3H，s），3.08（1H，m），1.58（3H，s），1.61（3H，s），3.24（2H，s），2.53（1H，d，J=18.6Hz），2.49（1H，d，J=18.0Hz），7.60（1H，s），6.20（1H，s）；13C-NMR（CD3OD，150MHz）：δ20.6（q），18.1（q），20.8（q），21.4（q），27.0（q），27.4（q），28.1（q），29.4（q），41.6（s），43.7（t），51.2（t），60.9（s），128.1（s），128.2（s），131.2（d），135.8（d），150.8（s），163.5（s），173.8（s），207.1（s）；通过DEPT以及HSQC对化合物6-异丙基-2,2,4,8a-三甲基-8a,9-二氢-2H-环戊二烯[g]喹啉-7(8H)-酮碳氢化学位移归属如图1；通过2D核磁谱1H-1H COSY以及HMBC确定此化合物的结构如图2。
骨架类型2-2生物碱化合物：8a-异丙基-2,2,4,6-三甲基-8a,9-二氢-2H-环戊二烯[g]喹啉-7(8H)-酮的理化和光谱数据以及结构鉴定：黄色无定形粉末，UV（MeOH）λmax（logε）346.0（4.40）nm和276.5（3.95）nm；Dragendorff试剂反应呈阳性；HR-ESI(+)MS：[M+H]+284.2020；分子式：C19H25NO；1H-NMR（CD3OD，600MHz）：δ1.02（3H，d，J=6.6Hz），1.98（3H，d，J=1.2Hz），0.58（3H，d，J=6.6Hz），1.86（3H，s），1.79（1H，m），1.31（3H，s），1.29（3H，s），3.10（2H，s），2.52（1H，d，J=18.0Hz），2.07（1H，d，J=18.6Hz），6.87（1H，s），6.23（1H，s）；13C-NMR（CD3OD，150MHz）：δ7.8（q），18.0（q），18.1（q），18.2（q），29.8（q），30.7（q），33.0（d），43.9（t），44.6（t），49.1（s），60.3（s），118.6（d），128.6（s），131.0（s），136.4（s），142.8（d），162.2（s），169.5（s），209.9（s）；通过DEPT以及HSQC对化合物8a-异丙基-2,2,4,6-三甲基-8a,9-二氢-2H-环戊二烯[g]喹啉-7(8H)-酮碳氢化学位移归属如图3；通过2D核磁谱1H-1H COSY以及HMBC确定此化合物的结构如图4。
附图说明
图1为本发明化合物6-异丙基-2,2,4,8a-三甲基-8a,9-二氢-2H-环戊二烯[g]喹啉-7(8H)-酮的碳氢归属图；
图2为本发明化合物6-异丙基-2,2,4,8a-三甲基-8a,9-二氢-2H-环戊二烯[g]喹啉-7(8H)-酮的1H-1H COSY以及关键HMBC相关图；
图3为本发明化合物8a-异丙基-2,2,4,6-三甲基-8a,9-二氢-2H-环戊二烯[g]喹啉-7(8H)-酮的碳氢归属图；
图4为本发明化合物8a-异丙基-2,2,4,6-三甲基-8a,9-二氢-2H-环戊二烯[g]喹啉-7(8H)-酮的1H-1H COSY以及关键HMBC相关图；
图5为本发明化合物6-异丙基-2,2,4,8a-三甲基-8a,9-二氢-2H-环戊二烯[g]喹啉-7(8H)-酮的1H-NMR图；
图6为本发明化合物6-异丙基-2,2,4,8a-三甲基-8a,9-二氢-2H-环戊二烯[g]喹啉-7(8H)-酮的13C-NMR图；
图7为本发明化合物6-异丙基-2,2,4,8a-三甲基-8a,9-二氢-2H-环戊二烯[g]喹啉-7(8H)-酮的DEPT图；
图8为本发明化合物6-异丙基-2,2,4,8a-三甲基-8a,9-二氢-2H-环戊二烯[g]喹啉-7(8H)-酮的HSQC图；
图9为本发明化合物6-异丙基-2,2,4,8a-三甲基-8a,9-二氢-2H-环戊二烯[g]喹啉-7(8H)-酮的HMBC图；
图10为本发明化合物8a-异丙基-2,2,4,6-三甲基-8a,9-二氢-2H-环戊二烯[g]喹啉-7(8H)-酮的1H-NMR图；
图11为本发明化合物8a-异丙基-2,2,4,6-三甲基-8a,9-二氢-2H-环戊二烯[g]喹啉-7(8H)-酮的13C-NMR图；
图12为本发明化合物8a-异丙基-2,2,4,6-三甲基-8a,9-二氢-2H-环戊二烯[g]喹啉-7(8H)-酮的DEPT图；
图13为本发明化合物8a-异丙基-2,2,4,6-三甲基-8a,9-二氢-2H-环戊二烯[g]喹啉-7(8H)-酮的HSQC图；
图14为本发明化合物8a-异丙基-2,2,4,6-三甲基-8a,9-二氢-2H-环戊二烯[g]喹啉-7(8H)-酮的HMBC图。
具体实施方式
实施例1
将粉碎的瘤果黑种草籽5kg，加入1.5L的石油醚回流脱脂2小时，过滤，滤渣重复用石油醚脱脂15次，回收滤渣并干燥，再将滤渣中加入1/2倍体积的氨水:丙酮=1:2混合液浸泡过夜，干燥；
将干燥物中再加入1倍体积的氯仿反复采用加热回流1h进行提取，温度为沸点温度，提取至无生物碱反应，每次1小时，滤过，收集滤液，滤渣重复用氯仿回流10次，收集并合并滤液，浓缩得到氯仿提取物217.2g；
将氯仿提取物210g用100mL氯仿溶解后，加入1倍体积的0.5N硫酸溶液萃取，反复萃取10次，合并酸萃取液，再用250mL的氯仿萃取4次，回收硫酸水层，再用氨水碱化至pH大于10，得碱化液，过滤得到黑褐色沉淀，干燥后得到黑褐色固体粉末总生物碱2.7g；
再将黑褐色固体粉末总生物碱1g，经pH区带高速逆流色谱分离，溶剂为甲基叔丁基醚:正丁醇:水=1:1:3，放在分液漏斗中，摇匀后静置分层，待平衡后，分离上下相，上相有机相为固定相，上相中加入10mM的三乙胺做为保留碱，下相水相为流动相，下相中加入10mM的盐酸做为洗脱酸，先将固定相泵入分离柱，待分离柱充满后，调整转速至700转/分，同时泵入流动相，流速为1.0mL/min，待平衡后，由进样阀注入样品，打开自外检测器及记录仪，检测波长254nm，按色谱图收集所有馏分，真空干燥后，经Dragendorff试剂显色以及一维和二维核磁鉴定，得到具有骨架类型2-1的生物碱6-异丙基-2,2,4,8a-三甲基-8a,9-二氢-2H-环戊二烯[g]喹啉-7(8H)-酮和骨架类型2-2的生物碱8a-异丙基-2,2,4,6-三甲基-8a,9-二氢-2H-环戊二烯[g]喹啉-7(8H)-酮。
实施例2
将粉碎的瘤果黑种草籽5kg，加入2L的石油醚回流脱脂2小时，过滤，滤渣重复用石油醚脱脂10次，回收滤渣并干燥，再将滤渣中加入1倍体积的氨水:丙酮=1:3混合液浸泡过夜，干燥；
将干燥物中再加入2倍体积的氯仿超声辅助提取2h，温度为20-40℃，虑过，收集滤液，滤渣重复用氯仿超声辅助提取至提取液无生物碱反应，每次2小时，滤过，收集并合并滤液，浓缩得到氯仿提取物262.2g；
将氯仿提取物260g用200mL氯仿溶解后，加入2倍体积的0.5N硫酸溶液萃取，反复萃取10次，合并硫酸萃取液，硫酸萃取液用500mL的氯仿萃取4次，回收硫酸水层，再用氨水碱化至pH大于10，得碱化液，过滤的黑褐色沉淀，干燥后得到黑褐色固体粉末总生物碱5.1g；
再将黑褐色固体粉末总生物碱2g，经pH区带高速逆流色谱分离，溶剂为甲基叔丁基醚:正丁醇:水=2:1:3，放在分液漏斗中，摇匀后静置分层，待平衡后，分离上下相，上相有机相为固定相，上相中加入10mM的三乙胺做为保留碱，下相水相为流动相，下相中加入10mM的盐酸做为洗脱酸，先将固定相泵入分离柱，待分离柱充满后，调整转速至750转/分，同时泵入流动相，流速为2.0mL/min，待平衡后，由进样阀注入样品，打开自外检测器及记录仪，检测波长254nm，按色谱图收集所有馏分，真空干燥后，经Dragendorff试剂显色以及一维和二维核磁鉴定，得到具有骨架类型2-1的生物碱6-异丙基-2,2,4,8a-三甲基-8a,9-二氢-2H-环戊二烯[g]喹啉-7(8H)-酮和骨架类型2-2的生物碱8a-异丙基-2,2,4,6-三甲基-8a,9-二氢-2H-环戊二烯[g]喹啉-7(8H)-酮。
实施例3
将粉碎的瘤果黑种草籽5kg，加入3L的石油醚回流脱脂2小时，过滤，滤渣重复用石油醚脱脂5次，回收滤渣并干燥，再将滤渣中加入1倍体积的氨水:丙酮=1:4混合液浸泡过夜，干燥；
将干燥物中再加入3倍体积的氯仿微波辅助提取1h，虑过，收集滤液，滤渣重复用氯仿微波辅助提取至无生物碱反应，每次3小时，滤过，收集并合并滤液，浓缩的氯仿提取物293.1g；
将氯仿提取物290g用300mL氯仿溶解后，加入3倍体积的0.5N硫酸溶液萃取，反复萃取4次，合并硫酸萃取液，硫酸萃取液用750mL的氯仿萃取3次，回收硫酸水层，再用氨水碱化至pH大于10，得碱化液，过滤得到黑褐色沉淀，干燥后得到黑褐色固体粉末总生物碱5.5g；
再将黑褐色固体粉末总生物碱1.5g，经pH区带高速逆流色谱分离，溶剂为甲基叔丁基醚:正丁醇:水=3:1:3，放在分液漏斗中，摇匀后静置分层，待平衡后，分离上下相，上相有机相为固定相，上相中加入10mM的三乙胺做为保留碱，下相水相为流动相，下相中加入10mM的盐酸做为洗脱酸，先将固定相泵入分离柱，待分离柱充满后，调整转速至800转/分，同时泵入流动相，流速为2.0mL/min，待平衡后，由进样阀注入样品，打开自外检测器及记录仪，检测波长254nm，按色谱图收集所有馏分，真空干燥后，经Dragendorff试剂显色以及一维和二维核磁鉴定，得到具有骨架类型2-1的生物碱6-异丙基-2,2,4,8a-三甲基-8a,9-二氢-2H-环戊二烯[g]喹啉-7(8H)-酮和骨架类型2-2的生物碱8a-异丙基-2,2,4,6-三甲基-8a,9-二氢-2H-环戊二烯[g]喹啉-7(8H)-酮。
实施例4
将粉碎的瘤果黑种草籽5kg，加入3L的石油醚回流脱脂2小时，过滤，滤渣重复用石油醚脱脂5次，回收滤渣并干燥，再将滤渣中加入1/2倍体积的氨水:丙酮=1:2混合液浸泡过夜，干燥；
将干燥物中再加入3倍体积的氯仿渗漏提取液，至无生物碱反应，每次3小时，滤过，收集并合并滤液，浓缩的氯仿提取物198.1g；
将氯仿提取物190g用200mL氯仿溶解后，加入2倍体积的0.5N硫酸溶液萃取，反复萃取4次，合并硫酸萃取液，再用750mL的氯仿萃取3次，回收硫酸水层，用氨水碱化至pH大于10，得碱化液，过滤得到黑褐色沉淀，干燥后得到黑褐色固体粉末总生物碱3.5g；
再将黑褐色固体粉末总生物碱0.5g，经pH区带高速逆流色谱分离，溶剂为甲基叔丁基醚:正丁醇:水=3:1:4，放在分液漏斗中，摇匀后静置分层，待平衡后，分离上下相，上相有机相为固定相，上相中加入10mM的三乙胺做为保留碱，下相水相为流动相，下相中加入10mM的盐酸做为洗脱酸，先将固定相泵入分离柱，待分离柱充满后，调整转速至900转/分，同时泵入流动相，流速为2.0mL/min，待平衡后，由进样阀注入样品，打开自外检测器及记录仪，检测波长254nm，按色谱图收集所有馏分，真空干燥后，经Dragendorff试剂显色以及一维和二维核磁鉴定，得到具有骨架类型2-1的生物碱6-异丙基-2,2,4,8a-三甲基-8a,9-二氢-2H-环戊二烯[g]喹啉-7(8H)-酮和骨架类型2-2的生物碱8a-异丙基-2,2,4,6-三甲基-8a,9-二氢-2H-环戊二烯[g]喹啉-7(8H)-酮。
实施例5
将粉碎的瘤果黑种草籽5kg，加入3L的石油醚回流脱脂2小时，过滤，滤渣重复用石油醚脱脂5次，回收滤渣并干燥，再将滤渣中加入1倍体积的氨水:丙酮=1:4混合液浸泡过夜，干燥；
将干燥物加入2倍体积的氯仿室温浸提24h/次，温度为20-30℃，至无生物碱反应，滤过，收集并合并滤液，浓缩的氯仿提取物200.1g；
将氯仿提取物190g用200mL氯仿溶解后，加入2倍体积的0.5N硫酸溶液萃取，反复萃取4次，合并硫酸萃取液，再用750mL的氯仿萃取3次，回收硫酸水层，用氨水碱化至pH大于10，得碱化液，过滤得到黑褐色沉淀，干燥后得到黑褐色固体粉末总生物碱3.8g；
再将黑褐色固体粉末总生物碱0.1g，经pH区带高速逆流色谱分离，溶剂为甲基叔丁基醚:正丁醇:水=2:1:4，放在分液漏斗中，摇匀后静置分层，待平衡后，分离上下相，上相有机相为固定相，上相中加入10mM的三乙胺做为保留碱，下相水相为流动相，下相中加入10mM的盐酸做为洗脱酸，先将固定相泵入分离柱，待分离柱充满后，调整转速至850转/分，同时泵入流动相，流速为1.0mL/min，待平衡后，由进样阀注入样品，打开自外检测器及记录仪，检测波长254nm，按色谱图收集所有馏分，真空干燥后，经Dragendorff试剂显色以及一维和二维核磁鉴定，得到具有骨架类型2-1的生物碱6-异丙基-2,2,4,8a-三甲基-8a,9-二氢-2H-环戊二烯[g]喹啉-7(8H)-酮和骨架类型2-2的生物碱8a-异丙基-2,2,4,6-三甲基-8a,9-二氢-2H-环戊二烯[g]喹啉-7(8H)-酮。

Claims (2)

1.瘤果黑种草籽中的生物碱，其特征在于结构式为：
其中：式(Ⅰ)为生物碱化合物，化学名称为：6-异丙基-2,2,4,8a-三甲基-8a,9-二氢-2H-环戊二烯[g]喹啉-7(8H)-酮；式(Ⅲ)为生物碱化合物，化学名称为：8a-异丙基-2,2,4,6-三甲基-8a,9-二氢-2H-环戊二烯[g]喹啉-7(8H)-酮。
2.一种如权利要求1所述的瘤果黑种草籽中生物碱的制备方法，其特征在于按下列步骤进行：
a、将粉碎的瘤果黑种草籽，加入石油醚回流脱脂，过滤，滤渣反复用石油醚脱脂5-15次，回收滤渣并干燥，再将滤渣用1/2-1倍体积的氨水:丙酮＝1:2-1:4混合液浸泡过夜，干燥得干燥物，其中脱脂草籽与氨水:丙酮的混合液的液比为1:2-1:4；
b、将步骤a干燥物用1-3倍体积的氯仿采用微波萃取、超声萃取、渗漏、常温浸提或加热提取的方法进行提取，反复提取至无生物碱反应，每次1-3小时，滤过，收集滤液，得到氯仿提取物，其中超声萃取温度为20-40℃，常温浸提温度为20-30℃，加热提取温度为沸点温度；
c、将步骤b氯仿提取物用氯仿溶解后，加入1-3倍体积的0.5N硫酸溶液萃取，反复萃取至无生物碱反应，收集硫酸萃取液，合并后，硫酸萃取液再用氯仿萃取，回收硫酸水层，再用氨水碱化至pH大于10，得碱化液，过滤得到黑褐色沉淀，干燥后得到黑褐色固体粉末总生物碱；
d、再将步骤c黑褐色固体粉末总生物碱，经pH区带高速逆流色谱分离，溶剂为甲基叔丁基醚:正丁醇:水＝1-3:1:3-4，放在分液漏斗中，摇匀后静置分层，待平衡后，分离上下相，上相有机相为固定相，上相中加入10mM的三乙胺做为保留碱，下相水相为流动相，下相中加入10mM的盐酸做为洗脱酸，先将固定相泵入分离柱，待分离柱充满后，调整转速至700-900转/分，同时泵入流动相，流速为1.0-2.0mL/min，待平衡后，由进样阀注入样品，打开自外检测器及记录仪，检测波长254nm，按色谱图收集所有馏分，真空干燥后，经Dragendorff试剂显色以及一维和二维核磁鉴定，得到具有骨架类型2的生物碱6-异丙基-2,2,4,8a-三甲基-8a,9-二氢-2H-环戊二烯[g]喹啉-7(8H)-酮和8a-异丙基-2,2,4,6-三甲基-8a,9-二氢-2H-环戊二烯[g]喹啉-7(8H)-酮。
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