KR100204002B1 - 20(S)-진세노사이드 Rg₂의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 홍삼의 특유성분인 천연형인하기 일반식(I)의 20(S)-진세노사이드 Rg2를 제조하는 방법에 관한 것임. 일반식(I)의 20(S)-진세노사이드 Rg2는 진세노사이드 Re를 완충용액중에서 효소인 베타-갈락토시다제와 반응시켜 제조함. 본 발명에 의하면 제조방법이 간단하고 20(S)-진세노사이드 Rg2의 수율이 높음.

Description

20(S)-진세노사이드 Rg2의 제조방법
본 발명은 다음 일반식(1)으로 표시되는 20(S)-프로토파낙사트라이올-6-O-β-D-람노실(1→2)-β-D-글루코피라노사이드 [20(S)-진세노사이드 Rg2라 함]의 제조방법에 관계되는 것으로서, 특히 진세노사이드 Re를 효소와 반응시켜 20(S)-진세노사이드 Rg2를 제조하는 효소적 제조방법에 관한 것이다.
[일반식 1]
상기 일반식(I)의 20(S)-진세노사이드 Rg2는 혈소판응집억제, 항트롬빈, 플라스민 활성촉진, 기억감퇴개선 및 평활근세포 증식억제 등의 효과가 있는 생리활성성분으로 이미 알려진 물질이다. 고려 인삼에서는 현재까지 약 30여종의 약리활성 진세노이드 유도체들이 밝혀져 있다. 진세노사이드 유도체들은 아글리콘에 결합되어 있는 당의 종류나 결합된 당류의 수 또는 결합위치에 따라 약리효능이 각각 다르다는 것이 이미 밝혀져 있다. 특히 수삼이나 백삼에 함유되어 있는 주요 사포닌의 약리효능에 대해서는 많은 연구가 행해졌으나 주로 홍삼에만 존재하는 미량 사포닌의 약리효능에 관한 연구는 상대적으로 적은 편이다.
홍삼은 수삼을 수증기처리하여 제조하는데 이 과정에서 구조적으로 불안정한 아글리콘C-20위치 제3급 알코올의 배당체결합이 쉽게 가수분해됨과 동시에 수산기가 반전 평형을 일으켜 C-20(R)과 C-20(S)의 이성체가 생성되기 때문에 홍삼에는 프로사포게닌인 20(RS)-진세노사이드 Rg2,Rg3, Rh1및 Rh2가 수삼이나 백삼에 비해 많이 함유되어 있다. 홍삼에는 이 성분들이 20(RS) 이성체 혼합물로 존재하기 때문에 20(S)형만의 유도체를 분리하는 데는 많은 어려움이 있다. 또한 화학적인 방법에 의해 인삼에 많이 함유된 트라이올 타입 사포닌으로부터 20(S)형의 진세노사이드 유도체를 제조할 수도 있으나 제조과정에서 C-20위치 수산기의 반전 평형에 의한 C-20(R)과 C-20(S) 이성체 혼합물의 생성, 탈수, 히드록실화반응과 같은 바람직하지 못한 부반응을 동반하기 때문에 수율이 극히 낮고 여러단계의 반응을 거쳐야 하는 등의 문제점이 있다(예를 들면 대한민국특허 4066호, 8291호).
본 발명자들은 인삼의 주요사포닌중의 하나인 진세노사이드 Re와 아스퍼질러스속의 미생물에서 분리한 베타-갈락토시다제를 함께 반응시키면 단기간내에 C-20위치의 배당체 결합이 선택적으로 절단되어 천연형인 20(S)-진세노사이드 Rg2가 고수율로 생성된다는데 착안하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 진세노사이드 Re를 물, 완충용액과 같은 수용성용매 또는 이들과 유기용매의 혼합액중에서 효소와 함께 반응시키는 방법을 포함한다. 본 발명에 사용되는 용매로는 효소의 활성을 저하시키지 않는 것이라면 특별히 제한을 받지 않으나 pH 4∼8, 특 pH4∼6범위의 완충용액이 바람직하다. 용매의 사용량은 기질의 중량을 기준으로 1-50%, 특히 2-30%가 바람직하다. 또한 수용성용매와 유기용매의 혼합액을 사용할 수도 있는데, 유기용매로서는 물과 혼합되는 것이라면 특별히 제한을 받지 않으나 그 중에서도 메탄올, 에탄올, 프로판올 같은 저급알코올, 디옥산, 디메틸설폭사이드, 아세토니트릴 등이 사용되며 수용성 용매에 대한 유기용매의 비율을 30% 이내로 하는 것이 바람직하다.
본 발명에 의하면 효소로는 아스퍼질러스 나이저 또는 아스퍼질러스 오리제에서 분리한 베타-갈락토시다제가 사용되며, 효소의 첨가방법은 효소의 불활성화가 일어나지 않는 방법이라면 특별히 제한을 받지 않는다. 예를들면 진세노사이드 Re를 용해시킨 용액에 효소를 첨가하거나 효소를 수용액 상태로 첨가하는 방법이 사용된다.
반응온도는 효소의 불활성화가 일어나지 않는 온도조건이어야 하며, 수용성 용매만을 사용하는 경우는 60℃이하, 수용성 용매와 유기용매의 혼합액을 사용하는 경우는 40℃이하가 바람직하다. 본 발명에 사용되는 반응시간 역시 효소의 활성이 유지되는 기간이라면 특별히 제한을 받지 않으나 1∼72시간, 바람직하게는 24∼48시간이 적당하다.
본 발명에 의한 20(S)-진세노사이드 Rg2제조방법의 일례를 설명하면 다음과 같다.
진세노사이드 Re를 완충용액에 용해시킨 다음, 여기에 아스파질러스속에서 분리한 배타-갈락토시다제를 가하고 10-50℃에서 48시간 반응시킨후 비등 수욕조에서 10분 가열하여 효소를 불활성화시킴으로써 고수율로 천연형의 20(S)-진세노사이드 Rg2가 생성된 반응액을 얻는다. 이와같은 효소적 방법에 의하면 종래 화학적 방법을 사용하는 경우보다 수율이 높고 단기간내에 반응이 이루어지며 20(S)형의 진세노사이드 유도체만이 생성되기 때문에 분리하기가 용이하다. 본 발명에 의해 제조된 진세노사이드 유도체는 다음과 같은 물리 화학적 성상을 나타내어 이를 20(S)-진세노사이드 Rg2로 동정하였다.
20(S)-진세노사이드 Rg2의 물리화학적 성상
mp:185-186℃
IR(㎝-1):3368(히드록실), 1636(올레피닉)
Positive FAB-MS:m/z 785.3(M+1)+, 808.3(M+Na)+
13C-NMR(ppm):16.8, 17.1, 17.6, 18.7, 19.1, 25.8, 22.9, 26.7, 27.0, 27.7, 32.0, 32.1, 32.1, 35.7, 39.3, 39.9, 46.0, 41.1, 39.5, 49.7, 51.6, 54.6, 60.7, 63.0, 69.4, 70.9, 72.2, 72.4, 72.5, 72.9, 74.1, 74.2, 78.3, 78.3, 78.4, 79.4, 101.9, 126.3, 130.7
이하 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명하면 다음과 같다.
[실시예 1]
진세노사이드 Re 1g을 0.1M 초산완충용액(pH5.0)에 용해시켜 전체를 50㎖로 정용한 다음 여기에 아스파질러스 오리제에서 분리한 베타-갈락토시다제를 5g을 첨가하여 50℃ 수욕조상에서 교반하면서 48시간 반응시킨다. 박층크로마토그라피에 의해 주기적으로 확인하여 반응생성물이 더 이상 증가되지 않으면 열수중에서 10분간 가열하여 반응을 종료시킨 다음, 반응액은 수포화 부탄올로 추출, 농축하여 20(S)-진세노사이드 Rg2가 60%이상 함유된 분말상 반응생성물을 얻었다. 반응생성물은 실리카겔 칼럼 크로마토그라피(클로로포름-메탄올-물 = 75 : 25 : 5)에 의해 20(S)-진세노사이드 Rg2367㎎을 얻었다.
[실시예 2]
진세노사이드 Re 1g을 20% 아세톤을 함유하는 인산완충용액(pH5.0)에 용해시켜 전체를 100㎖로 정용한 다음 여기에 아스퍼질러스 나이저에서 분리한 베타-갈락토시다제 5g을 첨가하여 20℃ 에서 교반하면서 72시간 반응시킨다. 반응액은 열수중에서 10분간 가열하여 반응을 종료시킨 다음 반응액은 수포화부탄올로 추출, 농축하여 분말상의 반응생성물 0.71g을 얻었다. 반응생성물은 실리카겔 칼럼 크로마토그라피(클로로포름-메탄올-물 = 75 : 25 : 5)에 의해 20(S)-진세노사이드 Rg2342㎎을 얻었다.
[실시예 3]
진세노사이드 Re 1g을 30% 에탄올을 함유하는 시트레이트-포스페이트 완충용액(pH5.0)에 용해시켜 전체를 50㎖로 정용한 다음 여기에 아스퍼질러스 오리제에서 분리한 베타-갈락토시다제 3g을 첨가하여 20℃ 교반하면서 72시간 반응시킨다. 반응액은 열수중에서 가열하여 반응을 종료시킨 다음 엠버라이트 엑스에이디-2 수지를 충족시킨 칼럼에 통과시켜 당류와 효소는 증류수로 세척하여 제거하고 반응생성물은 메탄올로 용출시켜 농축한다. 농축액은 실리카겔 칼럼 크로마토그라피(클로로포름-메탄올-물 = 75 : 25 : 5)에 의해 20(S)-진세노사이드 Rg2355㎎을 얻었다.
[실시예 4]
진세노사이드 Re 1g을 20% 아세톤을 함유하는 인산 완충용액(pH4.8)에 용해시켜 전체를 50㎖로 정용한 다음 여기에 아스퍼질러스 나이저에서 분리한 베타-갈락토시다제 3g을 첨가하여 25℃ 에서 교반하면서 72시간 반응시킨다. 박층크로마토그라피에 의해 주기적으로 확인하여 반응생성물이 더 이상 증가되지 않으면 열수중에서 10분간 가열하여 반응을 종료시킨 다음, 반응액은 수포화부탄올로 추출, 농축한 반응생성물을 실리카겔 칼럼 크로마토그라피(클로로포름-메탄올-물 = 75 : 25 : 5)에 의해 20(S)-진세노사이드 Rg2373㎎을 얻었다.

Claims (5)

  1. 진세노사이드-Re를 pH 4-7의 완충용액중에서 효소인 베타-갈락토시다제와 반응시켜 일반식(I)로 표시되는 20(S)-진세노사이드 Rg2를 제조하는 방법
  2. 제1항에서, 베타-갈락토시다제가 아스퍼질러스 나이저와 아스퍼질러스 오리제중의 하나에서 분리한 것임을 특징으로 하는 방법
  3. 제1항에서, 완충용액이 저급알콜, 아세톤 디옥산, 디메틸설폭사이드, 아세토니트릴중에서 선택된 유기용매와 함께 사용됨을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3항에서, 유기용매가 완충용액의 중량을 기준으로 30%이하로 사용됨을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에서, 반응이 10-50℃ 범위에서 진행됨을 특징으로 하는 방법.
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