TWI422679B - 液體麴的製法 - Google Patents

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Description

液體麴之製法
本發明關係液體麴之製法。詳言之，本發明是關於經強化酵素活性之液體麴之製法。
酒類等之製造用麴，有將絲狀菌之孢子接種在經過蒸煮等處理過之原料上、培養而得之固體麴，以及將麴菌之孢子或經過前培養得到之菌絲接種在將原料與其他營養源加入水中調製成之培養基內培養而得之液體麴。
傳統之酒類等發酵飲料品，如日本酒、燒酒、醬油、味噌、味醂等之製造乃廣泛使用以固體培養製麴法製備之固體麴。此固體培養法乃是將川治麴菌(Aspergillus kawachii ),泡盛麴菌(Aspergillus awamori ),黑麴菌(Aspergillus niger ),米麴菌(Aspergillus oryzae ),大豆麴菌(Aspergillus sojae )等麴菌之孢子散布在蒸煮過之穀類等固體原料上，讓麴菌在其表面繁殖。
例如在製造燒酒時，川治麴菌、泡盛麴菌等之固體麴廣被使用。可是，固體培養法屬原料、麴菌非均勻分散之培養系統，因此溫度、水分含量、各種營養成分等因子不易均一，致使培養之管制非常複雜；加上大多在開放狀況下製麴，此時也必須注意到雜菌污染等品質管理層面。因此可以說，固體麴並不適合在大規模製造。
反之，液體培養法之培養管制、品質管理容易，是一種適用於高效率生產之培養形式。但是，基於無法充分得到諸如燒酒釀造時所必要之酵素活性等理由，以液體培養法培養麴菌出之培養物，被當作燒酒麴之實例甚少。此時，以液體培養法得到之所謂培養物，除了培養法所得之培養物(以下有時稱為液體麴)本身之外，也可以是培養液、菌體、其濃縮物或乾燥物。
以液體培養法得到之培養物之所以無法被當作麴菌以製造發酵飲食品之主要理由，除上述理由外，液體培養中麴菌之澱粉酶(amylase)、纖維素酶(cellulase)等酵素之生產模式與固體培養大異，而且整體生產性低落乃是既知事實(參照非專利文獻1,2)。
通常在製造燒酒以及其他酒類時，乃以並行複醱酵方式生產酒精。因此，影響對麴菌之葡萄糖之供應之麴菌糖質分解酵素、特別是葡糖糖化酶(glucoamylase)、耐酸性α－澱粉酶、乃是酒精發酵的關鍵酵素。但是，以液體培養法得到之培養物之葡糖糖化酶顯著低、生產模式也與固體培養大不相同亦是既知事實(參照非專利文獻3－6)。
提高麴菌葡糖糖化酶活性之方法有，在對菌絲之繁殖施以壓力(stress)之同時培養麴菌之方法(參考專利文獻1)、將焙炒過之穀類添加到麴菌培養液之方法(參考專利文獻2)等報告。專利文獻1所揭示之方法為在多孔性膜或含有空隙之固定化劑中培養，使編碼含葡糖糖化酶之新穎glaB基因表現、以提高該酵素活性之方法，但需要嚴密之控制或特殊之培養裝置，故不合實用。另外，專利文獻2所揭示之方法為使用以至少一部份焙炒穀類為原料之液體培養基培養麴菌，因此在其新製造步驟中增加了穀類焙炒。
於是，本案發明者提出有關以含有不易被麴菌分解之糖質之液體培養基之麴菌培養法(參考專利文獻3)。本發明之麴菌液體培養可簡便地獲得價廉、含有可使用於酒類等發酵飲食品之高活性葡糖糖化酯等糖質分解關連酵素之麴菌培養物。
另一方面，關於耐酸性α－澱粉酶，最近已經開始進行其分子生物學之詳細解析(參考非專利文獻7)。依照此文獻，白麴菌含有非耐酸性α－澱粉酶及耐酸性α－澱粉酶二種不同性質之澱粉酶基因，兩者之表現模式大不相同，在液體培養時，有大量之非耐酸性α－澱粉酶產生，可是，燒酒釀造關鍵酵素之耐酸性α－澱粉酶則幾乎不產生。
在製造燒酒時，為了要防止燒酒液腐敗，其發酵作業乃是在低pH環境下進行。但是，非耐酸性α－澱粉酶由於在低pH條件下迅速失去其活性，所以對燒酒釀造時之糖質分解幾乎毫無貢獻。因此，利用麴菌之液體培養以生產大量被認為對燒酒釀造之糖質分解有貢獻之耐酸性α－澱粉酶是燒酒製造上不可或缺的。
過去曾經有詳細檢討麴菌液體培養液中耐酸性α－澱粉酶之生產模式之報告。報告所述之方法為使用含有胰、檸檬酸之合成培養基，加上培養時間長達100小時以上，很難說是可適用於實際燒酒釀造之液體麴之製法(參考非專利文獻8－10)。
如上述，一般認為耐酸性α－澱粉酶乃是基本上無法以液體培養生產之酵素，因此，到目前為止，含高活性耐酸性α－澱粉酶之液體麴尚未被開發。
專利文獻1：特開平11-225746號公報
專利文獻2：特開2001-321154號公報
專利文獻3：特開2003-265165號公報
非專利文獻1：Iwashita K. et al.: Biosci. Biotechnol. Bioche., 62, 1938-1946(1998)
非專利文獻2：山根雄一等：日本釀造協會誌，99, 84-92 (2004)
非專利文獻3：Hata Y. et. al.: Ferment. Bioeng., 84, 532-537 (1997)
非專利文獻4：Hata Y. et. al.: Gene., 207, 127-134 (1998)
非專利文獻5：Ishida H. et. al.: J. Ferment. Bioeng., 86, 301-307 (1998)
非專利文獻6：Ishida H. et. al.: Curr. Genet., 37, 373-379 (2000)
非專利文獻7：Nagamine K. et. al.: Biosci. Biotechnol. Biochem, 67, 2194-2202 (2003)
非專利文獻8：Sudo S. et. al.: J. Ferment. Bioeng., 76, 105-110 (1993)
非專利文獻9：Sudo S. et. al.: J. Ferment. Bioeng., 77, 483-489 (1994)
非專利文獻10：須藤茂俊等：日本釀造協會誌，89, 768-774 (1994)
本案發明發現以使用含有表面全部或至少一部份為穀皮所被覆之穀類為培養原料之液體培養基培養麴菌，可以製造出含有燒酒等之製造上必要之高活性葡糖糖化酶、耐酸性α-澱粉酶之液體麴，並且已經提出申請專利範圍(參照特願2004-350661號說明書、特願2004-352320號說明書)。
可是，此等方法除葡糖糖化酶、耐酸性α-澱粉酶外，對其他酵素之生產模式到目前尚未明瞭。
本發明之目的在於開發增強液體麴中葡糖糖化酶及耐酸性α-澱粉酶等澱粉分解酵素、以及其他酵素活性之方法，特別是提供藉液體培養液組成之最適化以製造高酵素活性液體麴之方法。
本案發明者。以更加提高液體麴酵素之生產為目標，專心重複檢討上述培養原料與種種營養源併用之效果，結果發現在液體培養基中加入特定之氮源、並且使硫酸鹽與磷酸鹽共存時，可提高澱粉分解酵素之葡糖糖化酶、纖維分解酵素之纖維素酶、以及蛋白質分解酵素之羧肽酶(carboxypeptidase)之生產性，遂完成本發明。
即，本發明之申請專利範圍第1項乃是以表面全部為穀皮所被覆之穀類為培養原料之含氮源的液體培養基來培養白麴菌及/或黑麴菌；氮源為選自硝酸鈉、硝酸鉀、酵母菌體、酵母菌體處理物、穀類榖皮及穀類糠之一種以上；酵素為選自葡糖糖化酶、耐酸性α-澱粉酶、纖維素酶及酸性羧肽酶之一種以上；液體培養基中含濃度為0.05~2.0%(w/vol)之硝酸鈉及/或硝酸鉀；液體培養基中含有濃度為0.1~2.0%(w/vol)之選自酵母菌體、酵母菌體處理物、穀類榖皮及穀類糠之一種以上；液體培養基中含有濃度為1~20%(w/vol)之培養原料為特徵之經強化酵素活性之液體麴之製法。
本發明之申請專利範圍第2項乃是以表面全部為穀皮所被覆之穀類為培養原料之含氮源的液體培養基來培養白麴菌及/或黑麴菌；氮源為選自硝酸鈉、硝酸鉀、酵母菌體、酵母菌體處理物、穀類榖皮及穀類糠之一種以上；酵素為選自葡糖糖化酶、耐酸性α-澱粉酶、纖維素酶及酸性羧肽酶之一種以上；液體培養基中含濃度為0.1~2.0%(w/vol) 之氮源；液體培養基中含有濃度為1~20%(w/vol)之培養原料為特徵之經強化酵素活性之液體麴之製法。
本發明之申請專利範圍第3項乃是以液體培養基中更含磷酸二氫鉀為特徵之申請專利範圍第1或2項記載之經強化酵素活性之液體麴之製法。
本發明之申請專利範圍第4項乃是以液體培養基中含0.05~1.0%(w/vol)濃度之磷酸二氫鉀為特徵之申請專利範圍第3項記載之經強化酵素活性之液體麴之製法。
本發明之申請專利範圍第5項乃是以液體培養基中更含硫酸鎂為特徵之申請專利範圍第3項記載之經強化酵素活性之液體麴之製法。
本發明之申請專利範圍第6項乃是以液體培養基中含0.01~0.5%(w/vol)濃度之硫酸鎂為特徵之申請專利範圍第5項記載之經強化酵素活性之液體麴之製法。
本發明之申請專利範圍第7項乃是以使用米、小麥、大麥、蕎麥、稗(barnyard millet)、粟(foxtail millet)、稷(millet)、高粱或玉米為穀類為特徵之申請專利範圍第1或2項記載之增經強酵素活性之液體麴之製法。
本發明之申請專利範圍第8項乃是以其中該表面全部為穀皮所被覆之穀類係自未精白至穀皮為經精白而殘留在穀粒表面程度之精白率以上的穀類為特徵之申請專利範圍第1或2項記載之增經強酵素活性之液體麴之製法。
本發明之申請專利範圍第9項乃是以申請專利範圍第1至2或4至6項中任一項所記載之製法得到之液體麴。
本發明之申請專利範圍第10項乃是以濃縮、精製申請專利範圍第9項記載之液體麴為特徵之酵素製劑之製法。
本發明之申請專利範圍第11項乃是以申請專利範圍第10項記載之製法得到之酵素製劑。
本發明之申請專利範圍第12項乃是以申請專利範圍第3項所記載之製法得到之液體麴。
本發明之申請專利範圍第13項乃是以濃縮、精製申請專利範圍第12項記載之液體麴為特徵之酵素製劑之製法。
本發明之申請專利範圍第14項乃是以申請專利範圍第13項記載之製法得到之酵素製劑。
本發明之申請專利範圍第15項乃是以申請專利範圍第7項所記載之製法得到之液體麴。
本發明之申請專利範圍第16項乃是以濃縮、精製申請專利範圍第15項記載之液體麴為特徵之酵素製劑之製法。
本發明之申請專利範圍第17項乃是以申請專利範圍第16項記載之製法得到之酵素製劑。
本發明之申請專利範圍第18項乃是以申請專利範圍第8項所記載之製法得到之液體麴。
本發明之申請專利範圍第19項乃是以濃縮、精製申請專利範圍第18項記載之液體麴為特徵之酵素製劑之製法。
本發明之申請專利範圍第20項乃是以申請專利範圍第19項記載之製法得到之酵素製劑。
本發明之申請專利範圍第21項乃是以含有當作培養原料之全部為榖皮所被覆之穀類及氮源之液體培養基來培養白麴菌及/或黑麴菌而生產酵素；氮源為選自由硝酸鈉、硝酸鉀、酵母菌體、酵母菌體處理物、穀類榖皮及穀類糠之一種以上；酵素為選自葡糖糖化酶、耐酸性α-澱粉酶、纖維素酶及酸性羧肽酶之一種以上；液體培養基中含濃度為0.05~2.0%(w/vol)之硝酸鈉及/或硝酸鉀；液體培養基中含有濃度為0.1~2.0%(w/vol)之選自酵母菌體、酵母菌體處理物、穀類榖皮及穀類糠之一種以上；液體培養基中含有濃度為1~20%(w/vol)之培養原料為特徵之酵素之生產方法。
本發明之申請專利範圍第22項乃是以含有當作培養原料之全部為榖皮所被覆之穀類及氮源之液體培養基來培養白麴菌及/或黑麴菌而生產酵素；氮源為選自由硝酸鈉、硝酸鉀、酵母菌體、酵母菌體處理物、穀類榖皮及穀類糠之一種以上；酵素為選自葡糖糖化酶、耐酸性α-澱粉酶、纖維素酶及酸性羧肽酶之一種以上；液體培養基中含濃度為0.1~2.0%(w/vol)之氮源；液體培養基中含有濃度為1~20%(w/vol)之培養原料為特徵之酵素之生產方法。
本發明之申請專利範圍第23項乃是以液體培養基中更且含有磷酸二氫鉀為特徵之申請專利範圍第21或22項記載之酵素之生產方法。
本發明之申請專利範圍第24項乃是以液體培養基中含濃度0.05~1.0%(w/vol)之磷酸二氫鉀為特徵之申請專利範圍第23項記載之之酵素之生產方法。
本發明之申請專利範圍第25項乃是以液體培養基中更含有硫酸鎂為特徵之申請專利範圍第23項記載之酵素之生產方法。
本發明之申請專利範圍第26項乃是以液體培養基中含濃度0.01~0.5%(w/vol)之硫酸鎂為特徵之申請專利範圍第25項記載之酵素之生產方法。
本發明之申請專利範圍第27項乃是以米、小麥、大麥、蕎麥、稗、粟、稷、高粱或玉米為穀類為特徵之申請專利範圍第21或22項記載之酵素之生產方法。
本發明之申請專利範圍第28項乃是以其中該表面全部為穀皮所被覆之穀類係自未精白至穀皮為經精白而殘留在穀粒表面程度之精白率以上的穀類為特徵之申請專利範圍第21或22項記載之酵素之生產方法。
依照本發明，在以表面全部或至少一部份為榖皮所被覆之穀類為培養原料之液體培養基中添加特定之有機及/或無機氮源、更進一步添加硫酸鹽及磷酸鹽後，以此液體培養基培養麴菌時，不但能夠大幅提高液體麴中澱粉分解酵素之生產性，而且能夠製造出含大量纖維素分解酵素及蛋白質分解酵素之液體麴。又，除上述酵素外，麴菌所生產之其他酵素之生產性應該也會全面提升。
若以本發明製造之液體麴製造燒酒等發酵飲食品，則由於纖維素分解酵素之活性高，致使諸味黏度降低、發酵順 利進行、酒精之收量也可望大幅增加。此外，其高蛋白質分解酵素活性可增加胺基酸之生產量，因而能夠製造出香醇之發酵飲食品。
更且，與固體培養相比，液體培養能夠對培養作嚴密之控制，因此能夠製造出品質安定、價格低廉之液體麴。
而且，本發明使用之穀類為未精白，或雖經過精白處理、但穀粒表面之至少一部份仍然殘留有穀皮者，因此可以期待原料利用率及產率之提高。
發明之最佳實施態樣式
以下具體說明本發明
本發明之液體麴之製法，包含以穀類及氮源等原料調製成之液體培養基培養麴菌，以製造經強化酵素活性之液體麴之步驟。
即，在本發明中，由於使用含以表面之全部或至少一部份為穀皮所蓋覆之穀類為培養原料之液體培養基培養麴菌，導致該穀類中之澱粉之糖化時間長、培養系中之糖釋出速度受到抑制，液體麴之酵素活性提高。更且，由於使用含特定營養源之液體培養基，麴菌將高度生產各種酵素。
此時麴菌所生產之酵素例有葡糖糖化酶、α-澱粉酶等澱粉分解酵素、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)等纖維素分解酵素、酸性羧肽酶(acid carboxypeptidase)、酸性蛋白酶等蛋白質分解酵素，但是不一定限定在此等酵素。
本發明適用之培養原料、屬於穀類者有大麥、米、小麥、蕎麥、稗、小米、稷、高粱、玉米等。此等培養原料在形 態上，表面之全部或至少一部份必須為穀皮所蓋覆；即未精白穀、或至少有穀皮殘留在穀粒表面之精白度者，糙米及糙麥等亦可得使用。使用米時，除當然之糙米外，含全部或部份殼者亦可。
例如，當穀類為大麥時，有未精白之精白率為100%者，或以未精白之精白度為100%計，自未精白之精白率100%減去大麥之穀皮率(一般為7~8%)，亦即92-93%程度之精白率以上者。
此處所謂之精白率係指殘留穀類之比例，例如，精白率為90%時，表示穀類表層部之穀皮等有10%被削除。又，本發明所指之糙麥，包括未精白之大麥，乃至穀粒表面有穀皮殘留(即，精白率90%以上)者。又，所指之穀皮係指包被在穀粒表面之外側部位者。
上述之培養原料用在調製下述之液體培養基時，可以是單獨或二種以上之組合。即，將培養原料之穀類與後述之氮源一起加水混合以調製液體培養基。穀類之配合比例決定於麴菌培養物中澱粉分解酵素、纖維素分解酵素、蛋白質分解酵素等酵素之選擇性生成、積蓄程度。
例如，以大麥為培養原料時，可添加對水1~20%(w/vol)之糙麥以調製液體培養基。又，使用未精白大麥為糙麥時，更理想之添加量為8~10%(w/vol)，而以95%精白大麥為原料時，更理想之添加量為1~4%(w/vol)。
又，以去殼糙米為培養原料配製液體培養基時，糙米之用量為對水1~20%(w/vol)，但以5~13%(w/vol)較理想，8~10%(w/vol)更理想。
使用其他穀類配製液體培養基時，其用量同樣也是對水1~20%(w/vol)。
如此，最適配合使用量因使用之原料之精白度、麴菌株及培養原料之種類等而異，因此，可以考量此等因素、做適宜的選擇。
培養原料之使用量以不高於上限值為佳，否則培養液之黏性變高，麴菌好氣培養所需氧氣、空氣無法充分供應，導致培養物中之氧濃度下降，培養不易進行。另一方面，假如該原料之使用量低於其下限值，則標的酵素之產量低。
將培養原料所含之澱粉可在培養前先加以糊化。澱粉之糊化在方法上無特別限定，可以使用蒸煮、焙炒等常用之方法。在後述之液體培養基之滅菌步驟中、使用高溫高壓滅菌法等方法以高於澱粉糊化溫度加熱時，澱粉會同時被糊化。
在液體培養基中，除上述之培養原料外，也可添加當作氮源之有機物、無機物等。此等氮源在種類上無特別限定，只要能夠讓麴菌增殖、標的酵素能夠充分生產即可。其有機物之例有酵母菌體或其處理物(如酵母菌體分解物、酵母萃取物等)、穀類穀皮、穀類糠等；無機物之例有硝酸鹽。
可用之硝酸鹽有硝酸鉀、硝酸鈉等，但以硝酸鉀特別理想。
此等氮源可單獨使用，也可將二種以上之有機物及/或無機物組合使用。
氮源在添加量方面並無特別限定，只要在促進麴菌增殖之程度即可。有機物之用量為0.1~2%(w/vol)，較理想為0.5~1.0%(w/vol)。無機物之硝酸鹽添加量為0.05~2.0%(w/vol)，較理想為0.1~2.0%(w/vol)，更理想為0.2~1.5%(w/vol)。
本發明中使用作為氮源之一之酵母，可例如釀造步驟或食品製造用啤酒酵母、葡萄酒酵母、威士忌酒酵母、燒酒酵母、清酒酵母、麵包酵母，亦可例如酵母菌屬(Saccharomyces)、念珠菌屬(Candida)、球擬酵母菌屬(Torulopsis)、漢遜孢酵母菌屬(Hanseniaspora)、漢遜酵母菌屬(Hansenula)、德巴利酵母菌屬(Debaryomyces)、腹膜孢酵母菌屬(Saccharomycopsis)、類酵母菌屬(Saccharomycodes)、畢赤酵母菌屬(Pichia)、管囊酵母菌屬(Pachysolen)等酵母之菌體。
以此等酵母為氮源時，可以使用菌體本身，亦可使用酵母菌體分解物、酵母萃取物。酵母菌體分解物或酵母萃取物可以經由下列方法取得：酵母菌體自體消化法(利用酵母菌體內固有之蛋白質分解酵素溶化菌體之方法)、酵素分解法(添加微生物由來、植物由來酵素製劑進行溶化之方法)、熱水抽出法(將酵母菌體浸漬在熱水中一定時間進行溶化之方法)、酸或鹼分解法(添加種種酸或鹼進行溶化之方法)、物理破碎法(超音波處理或高壓均質化法、加玻璃珠等固行物混合攪拌以進行破碎質方法)、凍結融解法(進行一次以上凍結、融解以破碎之方法)。
又，亦可用米糠等穀類糠為氮源，此等糠為穀類精白時之副產物。穀類之種子由表皮部、胚芽部、胚乳部、及保護此三部之殼所構成；其中，胚芽加表皮部成為糠。
更且，本發明可使用穀類穀皮、亦即穀類之表皮部為氮源，而通常是使用與培養原料同一種穀類之穀類穀皮。此等穀類糠、穀類穀皮可與其他氮源併用。
本發明使用之液體培養基內、除上述之培養原料、氮源外，亦可添加硫酸鹽及磷酸鹽。此等無機鹽類之併用可提高澱粉分解酵素、纖維素分解酵素及蛋白質分解酵素等酵素之活性。
例如，可使用硫酸鎂七水合物、硫酸鐵七水合物、硫酸銨等為硫酸鹽，其中特別以硫酸鎂七水合物最為理想。可當作磷酸鹽使用者有磷酸二氫鉀、磷酸銨等，尤其以磷酸二氫鉀最為理想。
此等無機鹽可單獨使用，亦可二種以上組合使用。
上述無機鹽類在液體培養基內之濃度可針對麴菌培養物中澱粉分解酵素、纖維素分解酵素、蛋白質分解酵素等酵素選擇性生成、蓄積程度做調整。例如，硫酸鹽之濃度為0.01~0.5%，較理想為0.02~0.1%。磷酸鹽之濃度為0.05~1.0%，較理想為0.1~0.5%(全部為w/vol)。
上述之無機鹽類可單獨使用，亦可二種以上組合使用。
在液體培養基內，前述氮源、無機鹽類以外之有機物、無機鹽類等亦可適宜添加做為營養源。此等添加物並無特別限定，只要是使用於一般麴菌培養者即可。其例有屬於有機物之小麥麩、玉米浸液、大豆粕等，一及屬於無機鹽類之銨鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽等。可同時使用2種以上之有機物及/或無機鹽類。
此等物質在添加量上無特別限制，只要能夠促進麴菌之增殖即可。理想之添加量為有機物1~5%(w/vol)，無機物為0.1~1%(w/vol)。
營養源之添加量若超過其上限值，將阻礙麴菌之增殖；若低於下限值，將無法促進酵素之生產。兩者都不佳。
上述之由培養原料與氮源加水混合而得之麴菌液體培養液必要時可做滅菌處理。處理方法無特別限定，其例有高壓高溫滅菌法，在121℃下進行15分鐘。
當滅菌過之液體培養基冷卻到培養溫度後，將白麴菌及/或黑麴菌接種到液體培養基內。
本發明使用之理想麴菌為具有葡糖糖化酶、耐酸性α－澱粉酶、α－澱粉酶等澱粉分解酵素、纖維素酶、β－葡萄糖苷酶等纖維素分解酵素、酸性羧肽酶、酸性蛋白酶等蛋白質分解酵素等酵素之生產能力者。其具體例有屬於白麴菌之川治麴菌(Aspergillus Kawachii) 等,以及屬於黑麴菌之泡盛麴菌(Aspergillus awamori) 、黑麴菌(Aspergillus niger) 等。
又，接種之麴菌在形態上可以是任意的，即可用孢子，也可用菌絲。
培養時可以使用此等麴菌中之一種、或屬於同種或異種之2種菌株之混合培養。雖然可以使用此等麴菌之孢子或經過前培養得到之菌絲，但是如果使用菌絲，最好是能夠在短時間內達到對數增殖期之菌絲。
接種到液體培養基之麴菌，在接種量上無特別限定，但是使用孢子時，對每1 ml液體培養基最好接種1 x 104 ~1x106 個程度之孢子，使用菌絲時，則最好接種0.1~10 %程度之菌絲。
在麴菌之培養溫度方面，只要不影響生育即可，並無特別限定。理想之培養溫度為25~45℃，較理想為30~40℃。如果培養溫度低，則由於麴菌之增殖速度變慢，容易引起雜菌污染。適當之培養時間為24~72小時。
使用之培養裝置，雖然只要能夠做液體培養即可，但是因為麴菌需要好氣培養，所以必須在能夠將氧氣、空氣送進培養基中之好氣條件下進行。同時，最好能夠攪拌、使在培養時培養基中之原料、氧氣及麴菌在裝置內均勻分布。至於攪拌條件、通氣量，只要是能夠維持好氣培養環境之條件即可，可依照培養裝置、培養基黏度等作適宜之選擇。
以上述培養法進行培養，可獲得高產量澱粉分解酵素、纖維素分解酵素、蛋白質分解酵素等酵素、具有適用於製造燒酒等之酵素活性之液體麴。
本發明之液體麴除培養物本身外，還包含經離心分離等方法取得之培養液、以及此等培養液之濃縮物或乾燥物。
如上述，如果依照上述之培養法，就能夠高度生產澱粉分解酵素、纖維素分解酵素、蛋白質分解酵素等酵素。
因此，申請專利範圍第14項記載之酵素之生產方法與上述液體麴製造法相同。
依本發明製法得到之液體麴很適合於燒酒等發酵飲食品之製造。例如，在製造清酒時之酒母、各諸味發酵階段，製造燒酒時之諸味發酵階段，製造醬油時之調合階段，製造味噌時之發酵階段，製造味醂時之發酵階段，製造甜酒時之發酵階段皆可以液體麴取代固體麴。
此外，所得之液體麴之一部份當作製造次批液體麴之開始者(starter)。此種液體麴連續製造法可穩定生產，亦可期待提高生產效率。
使用上述液體麴製造燒酒等發酵飲食品時，全製程可以在液相進行。以液相全程製造發酵飲食品之例為在製造燒酒時，將玉米、麥、米、馬鈴薯、甘蔗等起始原料以耐熱性酵素劑在80℃之高溫下溶解、液化後，加入上述液體麴及酵母以進行發酵，再將發酵後之諸味以常壓蒸餾法或減壓蒸餾法進行蒸餾。
本發明之液體麴，由於具有高酵素活性，所以有可能當作酵素製劑及消化劑等醫藥品利用。此時，可將麴菌培養物濃縮到希望之濃度、精製，加入適當之賦型劑、增黏劑、甘味料等常法做成製劑。
另外，還可以利用麴菌之澱粉分解酵素等之啟動子、在麴菌培養物中大量生產目標之異種蛋白質。
以下利用實施例具體說明本發明；但是，本發明並非限定在此等實施例內。
[實施例1](液體麴製造時無機氮物之添加)
下述方法調查將當作無機氮物之硝酸鉀添加到液體培養基後之結果。
首先配製無添加(對照)0、添加0.2%(w/vol)或0.4%(w/vol)硝酸鉀於水溶液之再加入2%(w/vol)糙麥所調製成之3種液體培養基。
取100 ml液體培養基加入500ml三角瓶(baffled conical flask)內，高壓高溫滅菌後，以對液體培養基1%(v/vol)之接種量接種事先以液體培養基培養好之白麴菌(Aspergillus kawachii IFO4308)。使用之糙麥為澳洲產Sterling 95%精白米(基本上以下之實施例亦同)。
之後，以溫度37℃、振盪速度100rpm培養48小時，培養結束後，測定各培養物之葡糖糖化酶、耐酸性α－澱粉酶之活性。表1及第1圖為以含不同硝酸鉀之液體培養基培養麴菌後、培養物中之葡糖糖化酶及耐酸性α－澱粉酶之活性。
其中，葡糖糖化酶之酵素活性以糖化力分別定量試劑組套(kit,Kikkoman製)測定，耐酸性α－澱粉酶之活性之測定乃使用非專利文獻7所述方法之改良法，即：對培養物做酸處理以消除非耐酸性α－澱粉酶之活性後，以α－澱粉酶測定組套(Kikkoman製)測定耐酸性α－澱粉酶之活性。詳言之，取1 ml培養液，加入9 ml之100mM醋酸緩衝液(pH 3)，於37℃酸處理1小時後，以α－澱粉酶測定組套(Kikkoman製)測定耐酸性α－澱粉酶之活性。
如表1及第1圖所示，與沒有硝酸鉀無機氮添加之液體培養基對照區相比，添加0.2%添加區及0.4%添加區之葡糖糖化酶與耐酸性α－澱粉酶兩種酵素之活性大幅提高，而且，葡糖糖化酶與耐酸性α－澱粉酶間之平衡性良好。
[實施例2](液體麴製造時添加複數之無機物)
以下調查添加複數之無機物時之效果。
以硝酸鉀或硝酸鈉為無機氮，以磷酸二氫鉀為無機鹽，依表2之比例加水調製。硝酸鉀之濃度在2.0%時之莫耳濃度為20 mM，因此，添加與硝酸鉀相同離子濃度之硝酸鈉時，硝酸鈉之添加量為1.7%。對照區使用不含無機氮及無機鹽之水。
於上述調製好之原料水中加入培養原料用糙麥至2%(w/vol)、調製出4種液體培養基，再以與實施例1相同之條件進行白麴菌之液體培養。之後，以與實施例1相同之方法測定葡糖糖化酶與耐酸性α－澱粉酶兩種酵素之活性。結果如表2及第2圖所示。
如表2及第2圖所示，添加無機氮及無機鹽時之葡糖糖化酶及耐酸性α－澱粉酶也比無添加之對照區高。
[實施例3](液體麴製造時酵母菌體及酵母自溶物之添加)
使用添加酵母菌體或酵母自溶物(酵母萃取物)之液體培養基製造液體麴。
(1)酵母菌體或酵母自溶物之調製將從啤酒釀造步驟回收之啤酒酵母以下列條件處理，得啤酒酵母菌體及酵母自溶物(1)、(2)。
酵母菌體：將啤酒酵母以5,000 x g、15分鐘離心、脫水至水分含量達70%程度，得酵母菌體。
酵母自溶物(1)：取酵母菌體，以等量水懸濁後，以52℃處理18小時所得之酵母自溶物。
酵母自溶物(2)：取酵母菌體，以等量之1%乳酸懸濁後，以52℃處理18小時所得之酵母自溶物。
(2)以酵母添加液體培養基調製液體麴將調製好之酵母菌體、酵母自溶物(1)~(2)個別以水調製成濃度為0.20%、0.50%、以及1%(v/vol)之原料水。於原料水中加入培養原料之糙麥至2%(w/vol)以調製液體培養基後，以與實施例1相同之條件進行白麴菌之液體培養。然後，以與實施例1相同之方法測定葡糖糖化酶與耐酸性α－澱粉酶兩種酵素之活性。
另一方面，對於只含2%(w/vol)糙麥之液體培養基(No.1)，也以與實施例1相同之條件進行白麴菌之液體培養。所得之液體麴，也以與實施例1相同之方法測定葡糖糖化酶與耐酸性α－澱粉酶之活性。結果如表3及第3圖所示。
(3)結果如表3及第3圖所示，酵母菌體添加試驗區與酵母自溶物添加試驗區之葡糖糖化酶活性及耐酸性α－澱粉酶活性都比無添加之對照區(No.1)高。尤其，No.7試驗區有良好之結果。而且，在所有試驗區，葡糖糖化酶活性及耐酸性α－澱粉酶活性都隨著酵母菌體或酵母自溶物添加量之增加而上升。
[實施例4](無機氮及/或無機鹽與酵母菌體之組合之添加)
依照表4組合硝酸鉀、磷酸二氫鉀及酵母菌體、加水調製原料水。使用之酵母菌體為自啤酒步驟回收之啤酒酵母經離心分離、脫水至水分含量為70%程度之酵母菌體(實施例3之酵母菌體)。對照區使用無添加之原料水。
於依表4之組合配製之原料水中加入2%(w/vol)之糙麥以調製液體培養基，與實施例1同樣個別接種白麴菌、進行液體培養，測定葡糖糖化酶與耐酸性α－澱粉酶之活性。結果如表4及第4圖所示。
從表4及第4圖可知，全部試驗區之葡糖糖化酶與耐酸性α－澱粉酶之活性高出無添加之對照區(No.1)非常多。尤其，No.15~18之兩酵素之活性都非常高。由此可知，無機氮及/或無機鹽與酵母菌體之併用改善了液體培養基內之營養平衡，促進菌絲體之酵素生產。
[實施例5](大麥糠、酵母菌體、無機物之組合)
將大麥糠及酵母菌體、硝酸鉀、磷酸二氫鉀依照表5組合，加水成液體培養基之原料水。使用之大麥糠為從70%精白大麥(澳洲產Sterling)碾精步驟回收之含大麥穀皮及糠者。使用之酵母菌體為自啤酒釀造步驟之啤酒酵母經離心分離、脫水至水分含量達70%左右者(實施例3之酵母菌體)。對照區使用無添加之原料水。
於依照表5組合配製之原料水中，添加糙麥2%(w/vol)、調製液體培養基，與實施例1同樣個別接種白麴菌、進行液體培養，及葡糖糖化酶與耐酸性α-澱粉酶活性之測定。結果顯示在表5與第5圖。
之試驗區。
從表5及第5圖可知，全部試驗區之葡糖糖化酶與耐酸性α-澱粉酶之活性高出無添加之對照區(No.1)非常多。尤其，No.4之兩酵素之活性都非常高，平衡性亦佳。可知，大麥糠與酵母菌體之併用改善了液體培養基內之營養平衡，促進菌絲體之酵素生產。
而且，大麥糠或酵母菌體與無機氮及無機鹽之併用(No.8、No.9)亦得到良好之結果。
[實施例6](大麥穀皮與酵母菌體之組合物之添加)
將硝酸鉀、離酸二氫鉀、大麥穀皮及酵母菌體依照表6組合，加原水當作液體培養基之原料水。使用之大麥穀皮為自70%精白大麥之碾精步驟取得之大麥糠以2mm篩目之篩篩過之大麥穀皮。使用之壓榨酵母為自啤酒釀造步驟回收之啤酒酵母經離心分離、脫水至水分含量達70%程度之酵母菌體(實施例3之酵母菌體)。對照區(No.1)使用無添加之原水。
於依照表6組合配製之原料水中，添加糙麥2%(w/vol)以調製液體培養基，與實施例1同樣個別接種白麴菌、進行液體培養，測定得到之液體麴之葡糖糖化酶與耐酸性α-澱粉酶活性之測定。結果顯示在表6與第6圖。
從表6及第6圖可知，全部試驗區之葡糖糖化酶與耐酸性α-澱粉酶之活性高出無添加之對照區(No.1)非常多。尤其，No.6~9之兩酵素之活性都非常高、平衡性亦佳。可知，大麥穀皮與酵母菌體之併用改善了液體培養基內之營養平衡性，促進菌絲體之酵素生產。
[實施例7](液體麴製造時之硫酸鹽添加效果)
依以下列方法製造液體麴，測定此等之酵素活性。
1.前培養方法
取65%精白麥(澳洲產Sterling)8g及水100ml、放入500ml三角瓶(baffled conical flask)，121℃、15分鐘高壓高溫滅菌。此前培養培養基經放冷後，接種白麴菌(Aspergillus kawachii NBRC4308)至1 x 106 個/ml，37℃、24小時、100rpm振盪培養後，當作前培養液。
2.本培養方法
取98%精白麥(糙麥，澳洲產Sterling)2.0%(w/vol)與硝酸鉀0.2%(w/vol)、磷酸二氫鉀0.3%(w/vol)、硫酸鎂7水合物0.1%(w/vol)及氯化鎂6水合物0.082%(w/vol)，依表7所示之組成比調製5個試驗區之100 ml液體培養基。將此等培養基分別注入500 ml三角瓶(baffled conical flask)，121℃、15分鐘高壓高溫滅菌。
冷卻後，將前培養液1 ml接種到本培養培養基，37℃、48小時、100 rpm振盪培養。再者，氯化鎂6水合物的添加量莫耳濃度與硫酸鎂7水合物相同；硫酸鎂7水合物之添加量為0.1%時之莫耳濃度為8.12 mM；如此則鎂於各試驗區培養基中的濃度相同。
3.酵素活性測定法培養結束後，測定葡糖糖化酶活性(GA)與耐酸性α－澱粉酶活性(ASAA)。
其中，葡糖糖化酶之活性(GA)以糖化力分別定量試劑組套(kit,Kikkoman製)測定。
耐酸性α－澱粉酶之活性(ASAA)之測定乃使用<Sudo S.et al：J.Ferment.Bioeng.,76,105－110(1993),Sudo S.et al：J.Ferment.Bioeng.,77,483－489(1994),須藤茂俊等：日本釀造協會誌.,89,768－774(1994)>文獻所記載之方法之改良法，即：對培養物做酸處理以消除非耐酸性α－澱粉酶之活性後，以α－澱粉酶測定組套(Kikkoman製)測定耐酸性α－澱粉酶之活性。具體上，取1 ml培養液，加入9 ml之100mM醋酸緩衝液(pH 3)，於37℃酸處理1小時後，以以α－澱粉酶測定組套(Kikkoman製)測定耐酸性α－澱粉酶之活性。
另外,同時還測定纖維素分解酵素之纖維素酶(CEL)及蛋白質分解酵素之一之酸性羧肽酶(ACP)之活性。
纖維素酶(CEL)活性之測定，乃以羧基甲基纖維素(CMC)為基質，將水解所產生之還原糖以二硝基水楊酸(dinitrosalicylic acid,DNS)法定量。具體言之，對1% CMC基質溶液(Sigma社製，Low Viscosity(商品名)，以100 mM醋酸緩衝液(pH 5)溶解)1 ml加入培養液1 ml，於40℃進行酵素反應10分鐘後，加DNS試劑(含0.75%二硝基水楊酸、1.2%氫氧化鈉、22.5%酒石酸氫鈉4水合物、0.3%乳糖1水合物)4 ml充分混合以停止反應。將反應中止液置於沸騰水浴中加熱準確15分鐘，以利進行還原糖之定量。室溫冷卻後，測定在540 nm之吸光度，求出相當於葡萄糖之還原糖量。
1單位之纖維素酶(CEL)活性為每1分鐘產生相當於1 μ mol葡萄糖之還原糖之酵素量。
酸性羧肽酶(ACP)活性乃使用酸性羧肽酮測定組套(Kikkoman製)測定。
測定結果如第7圖所示。
4.結果
如第7圖(A)所示，在硫酸鎂添加區之試驗區2，葡糖糖化酶活性有顯著上升。如第7圖(C)、圖(D)所示，在硫酸鎂添加區之試驗區2，纖維素酶、酸性羧肽酶活性也上升。反之，在添加屬鎂鹽之氯化鎂之試驗區3，卻無活性上升現象。由此判斷，酵素生產性之提升效果決定於硫酸基。
又，在不含硝酸鉀、磷酸二氫鉀之硫酸鎂添加試驗區4、5，亦不出現酵素生產性提升效果，可知在硝酸鹽、磷酸鹽及硫酸鹽同時存在時，酵素生產性有顯著提升。
如此，以含表面被覆穀皮之穀類(糙麥)與硝酸鹽、磷酸鹽及硫酸鹽之液體培養基培養麴菌時，可製造出除含燒酒製造所必需之葡糖糖化酶活性、耐酸性α-澱粉酶活性等酵素群外，同時含高量之纖維素分解酵素之纖維素酶及蛋白質分解酵素之酸性羧肽酶之液體麴。
纖維素分解酵素高度生產時，可降低燒酒製造時諸味之黏度，並提高酒精之收量。同時，由於含有大量之蛋白質分解酵素，假如因此能夠增加燒酒諸味之胺基酸成分，則可製造出香醇之燒酒。
此外，本發明很可能全盤提高前述已測出之酵素以外、麴菌所生產之酵素群，如澱粉分解酵素群、纖維素分解酵素群、蛋白質分解酵素群等之產量。
產業上之利用可能性
本發明除了能夠顯著提高液體麴內澱粉分解酵素之生產性外，也能夠製造出含高濃度纖維素分解酵素與蛋白之分解酵素之液體麴。而且，與固體培養相比，液體培養能夠嚴密控制培養、高效率製造出品質安定、價格便宜之液體麴。
更且，因為本發明使用之穀類為未精白、或穀粒表面至少殘留部份穀皮之精白穀，所以可望提高原料利用率及產率。
第1圖：圖示以使用硝酸鉀為氮源之液體培養基培養時，所得培養物之葡糖糖化酶及耐酸性α－澱粉酶之活性。黑棒為葡糖糖化酶之活性(U/ml)，白棒為耐酸性α－澱粉酶之活性(U/ml)。
第2圖：圖示以使用無機氮及無機鹽之液體培養基培養所得培養物之葡糖糖化酶α－澱粉酶之活性(U/ml)。
第3圖：圖示以使用酵母菌體或酵母自溶物為氮源之液體培養基培養時，所得培養物之葡糖糖化酶及耐酸性α－澱粉酶之活性。黑棒為葡糖糖化酶之活性(U/ml)，白棒為耐酸性α－澱粉酶之活性(U/ml)。
第4圖：圖示以組合使用無機氮、無機鹽及酵母菌體之液體培養基培養時，所得培養物之葡糖糖化酶及耐酸性α－澱粉酶之活性。黑棒為葡糖糖化酶之活性(U/ml)，白棒為耐酸性α－澱粉酶之活性(U/ml)。
第5圖：圖示以組合使用大麥糠、酵母菌體及無機氮為氮源之液體培養基培養時，所得培養物之葡糖糖化酶及耐酸性α－澱粉酶之活性。黑棒為葡糖糖化酶之活性(U/ml)，白棒為耐酸性α－澱粉酶之活性(U/ml)。
第6圖：圖示以組合使用大麥糠及酵母菌體為氮源之液體培養基培養時，所得培養物之葡糖糖化酶及耐酸性α－澱粉酶之活性。黑棒為葡糖糖化酶之活性(U/ml)，白棒為耐酸性α－澱粉酶之活性(U/ml)。
第7圖：圖示以使用硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽之液體培養基培養時，所得麴菌培養物之各種酵素之活性。(A)為葡糖糖化酶(GA)、(B)為耐酸性α－澱粉酶(ASAA)、(C)為纖維素酶(CEL)、(D)為酸性羧肽酶(ACP)之活性(U/ml)。

Claims (28)

  1. 一種經強化酵素活性之液體麴之製法，其係以表面全部為穀皮所被覆之穀類為培養原料之含氮源的液體培養基來培養白麴菌及/或黑麴菌；氮源為選自硝酸鈉、硝酸鉀、酵母菌體、酵母菌體處理物、穀類榖皮及穀類糠之一種以上；酵素為選自葡糖糖化酶、耐酸性α-澱粉酶、纖維素酶及酸性羧肽酶之一種以上；液體培養基中含濃度為0.05~2.0%(w/vol)之硝酸鈉及/或硝酸鉀；液體培養基中含有濃度為0.1~2.0%(w/vol)之選自酵母菌體、酵母菌體處理物、穀類榖皮及穀類糠之一種以上；液體培養基中含有濃度為1~20%(w/vol)之培養原料。
  2. 一種經強化酵素活性之液體麴之製法，其係以表面全部為穀皮所被覆之穀類為培養原料之含氮源的液體培養基來培養白麴菌及/或黑麴菌；氮源為選自硝酸鈉、硝酸鉀、酵母菌體、酵母菌體處理物、穀類榖皮及穀類糠之一種以上；酵素為選自葡糖糖化酶、耐酸性α-澱粉酶、纖維素酶及酸性羧肽酶之一種以上；液體培養基中含濃度為0.1~2.0%(w/vol)之氮源；液體培養基中含有濃度為1~20%(w/vol)之培養原料。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之經強化酵素活性之液體麴之製法，其中液體培養基中更含磷酸二氫鉀。
  4. 如申請專利範圍第3項之經強化酵素活性之液體麴之製法，其中液體培養基中含濃度為0.05~1.0%(w/vol)之磷酸二氫鉀。
  5. 如申請專利範圍第3項之經強化酵素活性之液體麴之製 法，其中液體培養基中更含硫酸鎂。
  6. 如申請專利範圍第5項之經強化酵素活性之液體麴之製法，其中液體培養基中含濃度為0.01~0.5%(w/vol)之硫酸鎂。
  7. 如申請專利範圍第1或2項之經強化酵素活性之液體麴之製法，其中穀類為米、小麥、大麥、蕎麥、稗(barnyard millet)、粟(foxtail millet)、稷(millet)、高粱或玉米。
  8. 如申請專利範圍第1或2項之經強化酵素活性之液體麴之製法，其中該表面全部為穀皮所被覆之穀類係自未精白至穀皮為經精白而殘留在穀粒表面程度之精白率以上的穀類。
  9. 一種液體麴，其係由如申請專利範圍第1至2或4至6項中任一項之製法製得。
  10. 一種酵素製劑之製法，其特徵為濃縮、精製如申請專利範圍第9項之液體麴。
  11. 一種酵素製劑，其係由如申請專利範圍第10項之製法製得。
  12. 一種液體麴，其係由如申請專利範圍第3項之製法製得。
  13. 一種酵素製劑之製法，其特徵為濃縮、精製如申請專利範圍第12項之液體麴。
  14. 一種酵素製劑，其係由如申請專利範圍第13項之製法製得。
  15. 一種液體麴，其係由如申請專利範圍第7項之製法製得。
  16. 一種酵素製劑之製法，其特徵為濃縮、精製如申請專利範圍第15項之液體麴。
  17. 一種酵素製劑，其係由如申請專利範圍第16項之製法製得。
  18. 一種液體麴，其係由如申請專利範圍第8項之製法製得。
  19. 一種酵素製劑之製法，其特徵為濃縮、精製如申請專利範圍第18項之液體麴。
  20. 一種酵素製劑，其係由如申請專利範圍第19項之製法製得。
  21. 一種酵素之生產方法，其係以含有當作培養原料之全部為榖皮所被覆之穀類及氮源之液體培養基來培養白麴菌及/或黑麴菌而生產酵素；氮源為選自由硝酸鈉、硝酸鉀、酵母菌體、酵母菌體處理物、穀類穀皮及穀類糠之一種以上；酵素為選自葡糖糖化酶、耐酸性α-澱粉酶、纖維素酶及酸性羧肽酶之一種以上；液體培養基中含濃度為0.05~2.0%(w/vol)之硝酸鈉及/或硝酸鉀；液體培養基中含有濃度為0.1~2.0%(w/vol)之選自酵母菌體、酵母菌體處理物、穀類穀皮及穀類糠之一種以上；液體培養基中含有濃度為1~20%(w/vol)之培養原料。
  22. 一種酵素之生產方法，其係以含有當作培養原料之全部為榖皮所被覆之穀類及氮源之液體培養基來培養白麴菌及/或黑麴菌而生產酵素；氮源為選自由硝酸鈉、硝酸鉀、酵母菌體、酵母菌體處理物、穀類榖皮及穀類糠之一種以上；酵素為選自葡糖糖化酶、耐酸性α-澱粉酶、纖維素酶及酸性羧肽酶之一種以上；液體培養基中含濃度為0.1~2.0%(w/vol)之氮源；液體培養基中含有濃度為1~20%(w/vol)之培養原料。
  23. 如申請專利範圍第21或22項之酵素之生產方法，其中液體培養基中更含磷酸二氫鉀。
  24. 如申請專利範圍第23項之酵素之生產方法，其中液體培養基中含有濃度為0.05~1.0%(w/vol)之磷酸二氫鉀。
  25. 如申請專利範圍第23項之酵素之生產方法，其中液體培養基中更含有硫酸鎂。
  26. 如申請專利範圍第25項之酵素之生產方法，其中液體培養基中含有濃度為0.01~0.5%(w/vol)之硫酸鎂。
  27. 如申請專利範圍第21或22項之酵素之生產方法，其中原料的穀類係為米、小麥、大麥、蕎麥、稗(barnyard millet)、粟(foxtail millet)、稷(millet)、高粱或玉米。
  28. 如申請專利範圍第21或29項之酵素之生產方法，其中該表面全部為穀皮所被覆之穀類係自未精白至穀皮為經精白而殘留在穀粒表面程度之精白率以上的穀類。
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