CN107325978B

CN107325978B - 蛋白质谷氨酰胺酶产生菌及发酵产物的制备与应用

Info

Publication number: CN107325978B
Application number: CN201610272833.2A
Authority: CN
Inventors: 黄静; 曲瑞丹; 严文娟; 高红亮; 张艳芳; 金明飞; 何灿; 刘英杰; 解秀娟
Original assignee: East China Normal University
Current assignee: East China Normal University
Priority date: 2016-04-28
Filing date: 2016-04-28
Publication date: 2020-10-16
Anticipated expiration: 2036-04-28
Also published as: CN107325978A

Abstract

本发明涉及一种蛋白质谷氨酰胺酶(Protein‑glutaminase，PG)产生菌及其发酵产物的制备与应用。所述蛋白质谷氨酰胺酶产生菌为解朊金黄杆菌(Chryseobacterium proteolyticum)YF810菌株，菌种保藏编号为CGMCC NO.10532。该菌株从土壤中富集筛选得到，安全无毒，经发酵可产蛋白质谷氨酰胺酶，且酶活力较高。经过制备、纯化，蛋白质谷氨酰胺酶的纯度较高，用于食品工业加工领域，能显著提高蛋白质的溶解度、起泡性、乳化性和稳定性，具有广阔的应用前景。

Description

蛋白质谷氨酰胺酶产生菌及发酵产物的制备与应用

技术领域

本发明属于食品微生物筛选应用技术领域，更具体的说是涉及一种蛋白质谷氨酰胺酶产生菌的筛选及其发酵产物蛋白质谷氨酰胺酶的制备与应用。

背景技术

天然蛋白质含有较多的谷氨酰胺和天冬酰胺残基，它们以氢键的形式和其他氨基酸交联，导致蛋白质的溶解性降低，进而影响蛋白的工艺特性，如乳化性、起泡性、凝胶性等(Fennema OR.食品化学[Z].北京：中国轻工业出版社，2003316-317)。这限制着蛋白质在食品、饮料、保健品、医药等领域的诸多应用。脱酰胺是解决这一问题的重要途径，研究表明，通过脱酰胺作用，蛋白质中的酰胺基转化为羧基，负电荷增加，降低了蛋白质的等电点，同时脱酰胺也改变了蛋白质分子的空间结构，使原本被包裹在内部的亲水基团暴露出来，且较小程度的脱酰胺作用(2％-6％)就能显著提高蛋白的功能特性(Hamada J S,Marshall WE.Preparation and functional properties of enzymatically deamidatedsoyproteins[J].Journal of Food Science.1989,54(3):598-601)。

文献报道的脱酰胺方法有酸法和酶法。酸法脱酰胺虽能显著改善蛋白质的溶解性，但在处理过程中，蛋白质肽链水解及其他氨基酸残基的降解是不可避免的，这对蛋白质风味影响较大。谷氨酰胺转移酶、蛋白酶和肽谷氨酰胺酶均可以用于蛋白质的脱酰胺。但是都有一定的不足：谷氨酰胺转移酶过量使用会使蛋白质发生凝聚；蛋白酶能将蛋白质整体水解，底物专一性较差，容易产生苦味；肽谷氨酰胺酶对高分子量的多肽和蛋白质不发挥作用，且脱酰胺度不高。

蛋白质谷氨酰胺酶(Protein-glutaminase，EC 3.5.1.44)简称PG，是近年来才被研究的一种新型水解酶，它能够脱去多种蛋白质、多肽或者短肽的氨基(Yamaguchi S,Jeenes D J,Archer D B.Protein-glutaminase from Chryseobacteriumproteolyticum,an enzyme that deamidates glutaminyl residues in proteins[J].European Journal of Biochemistry,2001,268(5):1410-1421)，能将L-β-谷氨酰胺水解成L-谷氨酸和氨，且仅作用于蛋白质或肽的谷氨酰胺基团，而对天冬酰胺残基和游离谷氨酰胺没有影响，同时不会导致蛋白质的交联和水解(Marcoa C,Rosell C M.Effect ofdifferent protein isolates and transglutaminse on rice flour properties[J].Journal of Food Engineering,2008,84(1):132-139)，从而提高蛋白质的溶解度和乳化性等，且该酶在酸性条件下也能起作用，是食品行业中一种非常有应用前景的酶。但由于生产菌株稀少，目前为止，国内外对蛋白质谷氨酰胺酶的研究主要集中在其结构和应用方面，而对能够产生蛋白质谷氨酰胺酶的其他菌株研究甚少，这在一定程度上限制了蛋白质谷氨酰胺酶的工业化应用。

现有报道中，能产蛋白质谷氨酰胺酶的细菌有解朊金黄杆菌(Chryseobacteriumproteolyticum)、黏金黄杆菌(Chryseobacterium gleum)和产吲哚金黄杆菌(Chryseobacterium indologenes)。目前唯一被批准用于工业化生产的仅有解朊金黄杆菌，但其产酶能力较低，酶活约为0.2IU/mL。

因此，筛选能够产生高酶活蛋白质谷氨酰胺酶的其他菌株十分必要。本发明的目的就是要解决现有产蛋白质谷氨酰胺酶菌株少、酶活低的难题，提供一株能安全高效应用于食品，提高蛋白质溶解度、起泡性、乳化性、稳定性的产蛋白质谷氨酰胺酶新菌株。

发明内容

本发明的目的是提供一种蛋白质谷氨酰胺酶(Protein-glutaminase，PG)产生菌，即一株能够分泌表达蛋白质谷氨酰胺酶的解朊金黄杆菌的新菌株，以及该菌株发酵产物蛋白质谷氨酰胺酶的制备及其在蛋白质脱酰胺中的应用，即将该菌株制备的蛋白质谷氨酰胺酶应用于蛋糕制作，对其中蛋清进行脱酰胺作用，提高蛋清的起泡性，增加蛋糕松软程度的同时减少蛋清的用量；应用于大豆蛋白功能饮料开发，对其中大豆分离蛋白进行脱酰胺作用，提高大豆分离蛋白的水解度，从而增加了大豆蛋白功能饮料的澄清度，且不会引起不良风味；将所述蛋白质谷氨酰胺酶与大豆多糖复配，成为一种新的蛋白质稳定剂，可以增加蛋白质饮品中蛋白质的溶解度及稳定性，且使得风味口感更加细腻清爽。

本发明首先提供了一株解朊金黄杆菌(Chryseobacterium proteolyticum)YF810菌株，已于2015年2月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.10532，其16S rDNA序列如SeqID No.3所示。

所述的蛋白质谷氨酰胺酶产生菌解朊金黄杆菌(Chryseobacteriumproteolyticum)YF810菌株，所述菌株能分泌蛋白质谷氨酰胺酶，即PG，所述酶的DNA序列如Seq ID No.10所示，氨基酸序列如Seq ID No.14所示。

所述蛋白质谷氨酰胺酶中，编码所述酶的信号肽的DNA序列如Seq ID No.11所示；所述信号肽的氨基酸序列如Seq ID No.15所示。

所述蛋白质谷氨酰胺酶中，编码所述酶的前肽的DNA序列如Seq ID No.12所示；所述前肽的氨基酸序列如Seq ID No.16所示。

所述蛋白质谷氨酰胺酶中，编码所述酶的成熟酶的DNA序列如Seq ID No.13所示；所述成熟酶的氨基酸序列如Seq ID No.17所示。

所述解朊金黄杆菌(Chryseobacterium proteolyticum)YF810在种子培养基中生长，生长温度范围为20-40℃，优选地，所述生长温度为25-30℃；生长pH范围为6.0-9.0，优选地，所述最适生长pH为6.5-7.5。

培养使用的培养基为种子培养基，其配方为多聚蛋白胨10g/L，酵母提取物2g/L，无水MgSO₄ 1g/L，pH为7.0。

本发明中，对编码所述蛋白质谷氨酰胺酶的全长DNA进行PCR扩增，上下游引物分别如Seq ID No.4和Seq ID No.5所示。

本发明中，对编码所述蛋白质谷氨酰胺酶的前肽和成熟酶的DNA进行PCR扩增，上下游引物分别如Seq ID No.6和Seq ID No.7所示。

本发明中，对编码所述蛋白质谷氨酰胺酶的成熟酶的DNA进行PCR扩增，上下游引物分别如Seq ID No.8和Seq ID No.9所示。

将解朊金黄杆菌菌株(Chryseobacterium proteolyticum)YF810的蛋白质谷氨酰胺酶基因进行PCR扩增并测序，获得其DNA序列(Seq ID No.10)。其蛋白质谷氨酰胺酶DNA序列共963bp(Seq ID No.10)，其中1-63bp(Seq ID No.11)为编码信号肽的序列，64-405bp(Seq ID No.12)为编码前肽的序列，406-963bp(Seq ID No.13)为编码成熟酶的序列。该菌株产生的蛋白质谷氨酰胺酶共320个氨基酸(Seq ID No.14)，其中信号肽为21个氨基酸(Seq ID No.15)，前肽包含114个氨基酸(Seq ID No.16)，成熟酶则由185个氨基酸组成(Seq ID No.17)。

本发明还提出了一种编码蛋白质谷氨酰胺酶信号肽的序列，如Seq ID No.11所示；所述蛋白质谷氨酰胺酶由解朊金黄杆菌菌株(Chryseobacterium proteolyticum)YF810产生。

本发明涉及的解朊金黄杆菌(Chryseobacterium proteolyticum)YF810菌株通过发酵能够产生蛋白质谷氨酰胺酶，将本菌株接种于发酵培养基，30℃，200r/min，震荡培养，本菌株发酵12h，产酶量最高，可达到0.7-2IU/mL，是目前报道的解朊金黄杆菌酶活的3.5-10倍。其中，发酵培养基配方为乳糖5g/L，大豆蛋白胨15g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 3.8g/L，KH₂PO₄0.25g/L，MgSO₄·7H₂O 0.25g/L，FeSO₄·7H₂O 0.05g/L，多孔pH稳定剂，如沸石10-50g/L，pH为7.2。

其中，在初始发酵培养基中加入10g/L-50g/L多孔pH稳定剂，其中，所述多孔pH稳定剂包括沸石、蒙脱石、活性炭、麦饭石、火山石等；优选地，在初始发酵培养基中加入30g/L多孔pH稳定剂沸石。

其中，所述发酵液中蛋白质谷氨酰胺酶的活性为0.7-2.0IU/mL。

本发明还提出了一种发酵培养基，所述发酵培养基的配方为(以发酵液的总体积为基准)：乳糖5g/L，大豆蛋白胨15g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 3.8g/L，KH₂PO₄ 0.25g/L，MgSO₄·7H₂O 0.25g/L，FeSO₄·7H₂O 0.05g/L，多孔pH稳定剂10-50g/L，pH 7.2。

其中，所述多孔pH稳定剂包括沸石、蒙脱石、活性炭、麦饭石、火山石等；优选地，所述多孔pH稳定剂为沸石。优选地，所述多孔pH稳定剂的添加量为30g/L。

本发明中，将所述菌株所产蛋白质谷氨酰胺酶进行纯化，其工艺为：

第一步：超滤浓缩

发酵液经过离心初步除去菌体，上清液用0.22μm的滤膜在压滤机中进行压滤除去不溶性杂质，并经超滤系统进行浓缩；

第二步：乙醇沉淀

浓缩液经无水乙醇沉淀，静置后离心，得到的蛋白沉淀用ddH₂O复溶后再次离心去除不溶性杂质，得到蛋白质谷氨酰胺酶粗提液；

第三步：脱盐

粗提液经0.45μm滤膜过滤后，用脱盐柱进行脱盐处理；在280nm有吸收峰的位置收集蛋白组分；用阳离子交换层析柱进行离子交换层析；

第四步：阳离子交换

经脱盐收集的蛋白组分，用阳离子交换层析柱进行阳离子交换层析；在280nm有吸收峰的位置收集组分；

第五步：浓缩

经阳离子交换收集的组分，用PEG 20000透析浓缩，得到含酶活力的浓缩液；

第六步：凝胶过滤层析

经浓缩得到的含酶活力的浓缩液，经过0.22μm的滤膜过滤之后，用凝胶过滤层析柱进行凝胶过滤层析，在280nm有吸收峰的位置收集组分。

在一个具体的实施方式中，对所述菌株所产蛋白质谷氨酰胺酶进行纯化的工艺为：种子液以2％(V/V)的接种量接入25mL发酵培养基，30℃200r/min摇床培养12h，得到发酵液，经过10000r/min，4℃离心20min去菌体得到上清，用大小为0.22μm的滤膜在压滤机中进行压滤除去不溶性杂质。使用Quixstand^TM超滤系统浓缩2-6倍，截留分子量为3000-5000D，料液流速0.5L/min，最大压力差0.2MPa。浓缩液用1-4倍体积4℃预冷的无水乙醇沉淀后，10000r/min，4℃离心20min，得到的蛋白沉淀用ddH₂O复溶后再次离心去除不溶性杂质，得到蛋白质谷氨酰胺酶粗提液。粗提液经0.45μm滤膜过滤后，用HiPrep 26/10Desalting脱盐柱进行脱盐处理。在280nm有吸收峰的位置收集蛋白组分。用阳离子交换层析柱进行离子交换层析。经脱盐收集的蛋白组分，用HiPrep 16/10SP Sepharose阳离子交换层析柱进行阳离子交换层析。上样完毕后进行洗脱，与柱子结合的蛋白通过0-1M的NaCl线性梯度洗脱下来，并且分管收集在280nm有吸收峰的位置的组分。离子交换后的得到含有酶活力的组分，用PEG 20000透析浓缩，得到含酶活力的浓缩液。经浓缩得到的含酶活力的浓缩液，经过0.45μm的滤膜过滤之后，用HiPrep 26/60Sephacryl S-100HR凝胶过滤层析柱进行凝胶过滤层析，在280nm有吸收峰的位置收集组分，得到蛋白质谷氨酰胺酶。通过这一纯化步骤，蛋白质谷氨酰胺酶比酶活力不低于130U/mg，总酶活回收率可达到32％。

本发明还提出了将所述蛋白质谷氨酰胺酶用于脱酰胺的应用。

本发明还提出了将所述蛋白质谷氨酰胺酶用于蛋糕制作中蛋清的脱酰胺的应用，从而改善其溶解度、起泡性、乳化性，增加蛋糕松软程度的同时可以减少蛋糕制作中蛋清的用量。

在蛋糕的制作过程中，向蛋清中添加不同比例的纯化后得到的蛋白质谷氨酰胺酶，蛋清的脱酰胺度、乳化性和起泡性随添加量的增加不断增加。

本发明还提出了将所述蛋白质谷氨酰胺酶用于大豆蛋白功能饮料的开发，用于改善其溶解度，提高大豆蛋白功能饮料的澄清度，同时，不会带来不良风味。

在大豆蛋白功能饮料的开发中，向大豆蛋白中添加纯化后得到的蛋白质谷氨酰胺酶，大豆蛋白的脱酰胺度和水解度随所述蛋白质谷氨酰胺酶添加量的增加不断增加。

本发明还提出了将所述蛋白质谷氨酰胺酶用于一种新的蛋白质稳定剂中。

在一种蛋白质稳定剂的配方中，将蛋白质谷氨酰胺酶与大豆多糖复配，可以增加蛋白质饮品中蛋白质的溶解度及稳定性，且使得风味口感更加细腻清爽。

本发明有益效果在于：第一，所涉及的解朊金黄杆菌(Chryseobacteriumproteolyticum)YF810菌株安全无毒，具有营养要求简单、生长迅速、产蛋白质谷氨酰胺酶活性高等优点；第二，应用该菌株发酵产蛋白质谷氨酰胺酶，能够作用于大豆分离蛋白等含有谷氨酰胺残基的蛋白质，脱去其中的酰胺基团，使其更好的应用于食品生产加工行业，其优势在于专一性强且在作用过程中不会带来不良风味等不好的影响；第三，应用该菌株发酵产蛋白质谷氨酰胺酶，经纯化工艺进行纯化，比酶活力与总酶活回收率高；第四，蛋白质谷氨酰胺酶可以作为增溶剂、稳定剂、营养增强剂、风味改良剂等，适用于蛋糕的制作、大豆蛋白功能饮料的开发以及蛋白质稳定剂的开发等方面。因此，该菌株应用于食品领域将有广阔的经济前景。

附图说明

图1表示实施例2中本发明涉及的解朊金黄杆菌(Chryseobacteriumproteolyticum)YF810菌株的菌落形态。

图2表示实施例2中本发明涉及的解朊金黄杆菌(Chryseobacteriumproteolyticum)YF810菌株的革兰氏染色结果。

图3表示实施例2中本发明涉及的解朊金黄杆菌(Chryseobacteriumproteolyticum)YF810菌株的扫描电镜观察结果。

图4表示实施例3中本发明涉及的解朊金黄杆菌(Chryseobacteriumproteolyticum)YF810菌株的生长曲线。

图5表示实施例4中本发明涉及的解朊金黄杆菌(Chryseobacteriumproteolyticum)YF810菌株的产酶曲线。

图6表示实施例4中本发明涉及的多孔pH稳定剂，如沸石添加量对解朊金黄杆菌YF810菌株产酶的影响。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

一种蛋白质谷氨酰胺酶产生菌YF810，分类命名：解朊金黄杆菌，拉丁文学名：Chryseobacterium proteolyticum，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位简称：CGMCC，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2015年2月6日，保藏编号为CGMCC NO.10532。

针对本发明所涉及的解朊金黄杆菌(Chryseobacterium proteolyticum)YF810菌株其发酵产物蛋白质谷氨酰胺酶的制备与应用，采用下述方式具体实施。

实施例1解朊金黄杆菌(Chryseobacterium proteolyticum)YF810菌株的筛选分离

YF810菌株通过富集培养基筛选得到，富集培养基由54mL A液、6mL 1％CBZ、60μL母液Ⅰ、60μL母液Ⅱ、60μL母液Ⅲ及120μL母液Ⅳ混合而成。

其中，A液配方为：5g/L葡萄糖，0.2g/L KH₂PO₄，0.2g/L MgSO₄·7H₂O、0.01％NaCl

母液Ⅰ其配方为：20g/L CaCl₂

母液Ⅱ其配方为：2g/L FeSO₄·7H₂O，5g/L MnSO₄·4H₂O

母液Ⅲ其配方为：5g/L NaWO₄·4H₂O，5g/L NaMO₄·2H₂O

母液Ⅳ其配方为：50g/L CuSO₄·5H₂O

其筛选步骤为：

第一步，称取土样10g，加入90mL无菌水，少量玻璃珠放入锥形瓶中，摇床振荡10min，制成土壤悬浊液。

第二步，土壤悬液静置10min后，取0.6mL接入装有富集培养基的锥形瓶中，30℃，200r/min摇床培养6天。

第三步，将上一步培养的菌液取0.6mL接入装有新鲜富集培养基的锥形瓶中，每个土样设置2个平行，30℃，200r/min摇床培养3天。

第四步，将上一步培养出的菌液取0.1mL至0.9mL无菌水中，稀释至10^-5、10^-6两个梯度进行涂板，涂板菌液量为100μL。

第五步，将平板置于30℃培养箱倒置培养2-3d后观察。

第六步，用3％KOH溶液喷洒在黄色或橘黄色菌落表面，立即观察，若菌落变成红色，则再喷洒3％HCl溶液。若菌落又变回黄色或橘黄色，即为疑似菌株，进行进一步筛选。

实施例2解朊金黄杆菌(Chryseobacterium proteolyticum)YF810菌株的鉴定

1.形态鉴定

(1)观察菌落的形态

疑似菌株经LB平板培养后观察，菌落呈圆形，直径为2mm-4mm，边缘整齐，金黄色或橘黄色，不透明，菌落表面湿润光滑，有光泽，如图1所示。

(2)显微镜观察

进行革兰氏染色和芽孢染色后，在普通光学显微镜下观察，结果显示，菌株呈杆状，不运动，无芽孢，革兰氏阴性，如图2所示。

在扫描电镜下观察，菌体光滑无鞭毛，不运动，宽0.2μm-0.4μm，长0.8μm-2.2μm，如图3所示。

2.生理生化鉴定

用细菌微量生化鉴定管(购自青岛海博生物技术有限公司)对解朊金黄杆菌(Chryseobacterium proteolyticum)YF810菌株进行生理生化鉴定，其结果如表1所示。

表1解朊金黄杆菌(Chryseobacterium proteolyticum)YF810菌株生理生化鉴定

其中，“+”表示解朊金黄杆菌(Chryseobacterium proteolyticum)YF810菌株呈阳性反应，“-”表示解朊金黄杆菌(Chryseobacterium proteolyticum)YF810菌株呈阴性反应。

根据生理生化鉴定结果，可初步认定所筛选的YF810菌株归属于为金黄杆菌属，鉴定结果与Shotaro Yamaguchi筛选出的解朊金黄杆菌9670T菌株有部分差异，表明是一株新的解朊金黄杆菌菌株。

3. 16S rDNA序列测定

提取YF810菌株的总基因组DNA，并以此为模版，扩增该菌株的16S rDNA序列，其引物序列为：

Seq ID No.1，F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'

Seq ID No.2，R:5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，割胶回收，并送至商业公司测序。测序工作由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。将测得的16S rDNA序列与已有细菌的16SrDNA序列进行相似性比对，结果表明YF810菌株与解朊金黄杆菌(Chryseobacteriumproteolyticum)9670^T(AB039830)同源性最高，达98％，因此该菌株为解朊金黄杆菌。

结合菌落形态、生理生化特征和16S rDNA基因序列分析的结果，可以确定YF810菌株是一株新的解朊金黄杆菌(Chryseobacterium proteolyticum)，命名为解朊金黄杆菌YF810(Chryseobacterium proteolyticum YF810)。

实施例3编码蛋白质谷氨酰胺酶的DNA序列测定及氨基酸序列预测

1.编码蛋白质谷氨酰胺酶全长DNA序列测定及其氨基酸序列预测

提取YF810菌株的总基因组DNA，并以此为模版，扩增该菌株所产蛋白质谷氨酰胺酶的全长DNA序列，其引物序列为：

Seq ID No.4，F:5'-CCAACCAACTTAACAAAAACTCACCATTAAAC-3'

Seq ID No.5，R:5'-GGAACCCGAACTACCGGAGCAGGATG-3'

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，割胶回收，并送至商业公司测序。测序工作由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

将上述测得的DNA序列，即Seq ID No.10；用软件Clone Manager进行翻译，获得相应氨基酸序列，即Seq ID No.14。

2.编码蛋白质谷氨酰胺酶前肽和成熟酶DNA序列测定及其氨基酸序列预测

Seq ID No.6，F:5'-CTGTGCCGATTCCAACGGGAATCAG-3'

Seq ID No.7，R:5'-GAACCCGAACTACCGGAGCAGGATG-3'

将上述测得的DNA序列，即Seq ID No.12和Seq ID No.13；用软件Clone Manager进行翻译，获得相应氨基酸序列，即Seq ID No.16和Seq ID No.17。

3.编码蛋白质谷氨酰胺酶成熟酶DNA序列测定及其氨基酸序列预测

Seq ID No.8，F:5'-AGTCTGCAAGTCCGGAAGACGTAAG-3'

Seq ID No.9，R:5'-CAGCTGGATACATCCGGTGCAGGTG-3'

将上述测得的DNA序列，即Seq ID No.13；用软件Clone Manager进行翻译，获得相应氨基酸序列，即Seq ID No.17。

因此，所述的蛋白质谷氨酰胺酶产生菌解朊金黄杆菌(Chryseobacteriumproteolyticum)YF810菌株分泌的蛋白质谷氨酰胺酶，其DNA序列如Seq ID No.10所示，氨基酸序列如Seq ID No.14所示。

其中，编码所述酶的信号肽的DNA序列如Seq ID No.11所示；所述信号肽的氨基酸序列如Seq ID No.15所示；编码所述酶的前肽的DNA序列如Seq ID No.12所示；所述前肽的氨基酸序列如Seq ID No.16所示；编码所述酶的成熟酶的DNA序列如Seq ID No.13所示；所述成熟酶的氨基酸序列如Seq ID No.17所示。

实施例4解朊金黄杆菌(Chryseobacterium proteolyticum)YF810菌株的培养

将解朊金黄杆菌(Chryseobacterium proteolyticum)YF810菌株接种于25mL种子培养基中，其配方为：多聚蛋白胨10g/L，酵母提取物2g/L，无水MgSO₄ 1g/L，pH 7.0。30℃，200r/min，震荡培养12h，以2％接种量转接于新鲜种子培养基中，30℃，200r/min，摇床培养12h。得到YF810菌液。

其生长曲线如图1所示，0-6h为迟滞期，6-14h为对数生长期，14h后进入稳定期。解朊金黄杆菌(Chryseobacterium proteolyticum)YF810菌株营养要求简单、生长迅速，适宜于工业化应用。

实施例5蛋白质谷氨酰胺酶发酵培养

第一步蛋白质谷氨酰胺酶的发酵培养

将YF810菌液以2％的接种量接入25mL发酵培养基，其配方为：乳糖5g/L，大豆蛋白胨15g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 3.8g/L，KH₂PO₄ 0.25g/L，MgSO₄·7H₂O 0.25g/L，FeSO₄·7H₂O0.05g/L，pH为7.2。30℃200r/min摇床培养12h，得到发酵液。

第二步蛋白质谷氨酰胺酶的酶活测定

发酵液经过10000r/min，4℃，离心20min去菌体得到上清，将上清液稀释5倍，取0.1mL的上清稀释液加入到试管中，37±0.5℃温浴1min；然后向其中加入已预热的0.01mol/L Cbz-Gln-Gly溶液1mL，37±0.5℃温浴反应60min。然后加入1mL的三氯乙酸溶液，混合均匀，终止反应。苯酚法测定反应后溶液中氨的含量。A₆₃₀测定吸光值A1。对照组为先加入三氯乙酸溶液后反应60min后再加入底物溶液。其余操作同实验组。测定A₆₃₀为A2。定义每分钟产生1μmol氨所需的酶的量为一个酶活单位(IU)。发酵液中酶活计算公式如下：

酶活力(U/mL)＝(A1-A2)×2.1/0.1×1/17.03×1/60×a×5

A1：实验组的吸光值；

A2：对照组的吸光值；

a：苯酚次氯酸盐分光光度法测定的氨的标准曲线的斜率。

用所述方法对本菌株酶活进行测定，其产酶曲线如图2所示，最高酶活出现在对数生长中后期，酶活可达到0.7IU/mL，是目前报道的解朊金黄杆菌9670^T酶活的3.5倍。

实施例6蛋白质谷氨酰胺酶发酵优化

在原始发酵培养基中添加10g/L-50g/L多孔pH稳定剂，如沸石，30℃200r/min摇床培养12h，得到发酵液。对各发酵液酶活进行测定，其优化结果如图3所示，沸石添加1％、2％、3％、4％、5％(w/v)，该菌株的产酶量均可以提高，当沸石添加量为30g/L时，其促进效果最佳，酶活可达到2.0IU/mL，是优化前的3倍，是目前报道的解朊金黄杆菌9670^T酶活的10倍。

在原始发酵培养基中添加30g/L沸石，30℃，200r/min摇床培养12h，得到发酵液，并测定发酵液的菌浓度、氨浓度(及pH)。结果如表2所示。

表2解朊金黄杆菌(Chryseobacterium proteolyticum)YF810菌株发酵培养基优化

该类型多孔pH稳定剂的优点在于，材料的多孔性可以使菌体吸附在孔内，从而促进菌体生长，进而使发酵液单位酶活得到提高；材料的pH稳定作用可以使发酵液的pH维持在适于菌株生长和产酶的范围。

实施例7蛋白质谷氨酰胺酶的纯化

第一步：超滤浓缩

发酵液经过离心初步除去菌体，上清液用大小为0.22μm的滤膜在压滤机中进行压滤除去不溶性杂质。使用Quixstand^TM超滤系统浓缩2-6倍，截留分子量为3000-5000Da，料液流速0.5L/min，最大压力差0.2MPa。

第二步：乙醇沉淀

浓缩液用1-4倍体积4℃预冷的无水乙醇沉淀后，10000r/min，4℃离心20min，得到的蛋白沉淀用ddH₂O复溶后再次离心去除不溶性杂质，得到蛋白质谷氨酰胺酶粗提液。

第三步：脱盐

粗提液经0.45μm滤膜过滤后，用HiPrep 26/10Desalting脱盐柱进行脱盐处理。在280nm有吸收峰的位置收集蛋白组分。

第四步：阳离子交换

经脱盐收集的蛋白组分，用HiPrep 16/10SP Sepharose阳离子交换层析柱进行阳离子交换层析。在280nm有吸收峰的位置收集组分。

第五步：浓缩

离子交换后的得到含有酶活力的组分，用PEG 20000透析浓缩，得到含酶活力的浓缩液。

第六步凝胶过滤层析

经浓缩得到的含酶活力的浓缩液，经过0.45μm的滤膜过滤之后，用HiPrep 26/60Sephacryl S-100HR凝胶过滤层析柱进行凝胶过滤层析，在280nm有吸收峰的位置收集组分，得到蛋白质谷氨酰胺酶。

在本发明中，通过这一纯化步骤，蛋白质谷氨酰胺酶比酶活力不低于130U/mg，总酶活回收率不低于32％。

实施例8蛋白质谷氨酰胺酶在蛋糕制作中的应用

在蛋糕的制作过程中需要通过蛋清发泡包裹空气从而在烘焙的过程中能够使蛋糕松软可口，蛋清经脱酰胺作用，可以有效提高其乳化性和起泡性，增加蛋糕的松软程度。将纯化后的蛋白质谷氨酰胺酶应用于蛋清的脱酰胺作用，以提高其乳化性和起泡性。

(1)称取蛋清40g，加入100mL 200mM酸缓冲液置于装料杯中，添加不同比例的蛋白质谷氨酰胺酶，37℃水浴锅中温育2h后，离心后取上清，测定其中的氨含量。同时，在相同的蛋清溶液中加硫酸至1M，经100℃反应4h，然后测定上清中的氨含量，为总氨含量。样品中氨含量与总氨含量的百分比即为脱酰胺度。

(2)称取蛋清40g，加入100mL水置于装料杯中，与100mL大豆色拉油，添加不同比例的蛋白质谷氨酰胺酶，37℃水浴锅中温育2h后，在高速组织捣碎机中以1000r/min的速度搅打30s，1500r/min离心5min，记录乳化层的体积，乳化层的体积即表示蛋清的乳化度值。

(3)称取蛋清40g，加入100mL水置于装料杯中，添加不同比例的蛋白质谷氨酰胺酶，作用30min后，在高速组织捣碎机中搅打1min，迅速倒入500mL的量筒中，泡沫体积即表示蛋清的起泡度值。

表3不同蛋白质谷氨酰胺酶添加量对蛋清脱酰胺度、乳化度和起泡度、蛋糕松软度、回缩程度的影响

随着蛋白质谷氨酰胺酶添加量的增加，蛋清的脱酰胺度、乳化度和起泡度都不断增加，蛋糕的松软度、回缩程度也得到明显改善。

实施例9蛋白质谷氨酰胺酶在大豆蛋白功能饮料开发中的应用

在大豆蛋白功能饮料开发过程中，需要通过一定的方法改善大豆蛋白的溶解度，达到功能饮料蛋白含量高、澄清度高的需求，同时可以消除由于大豆蛋白含量增加带来的不良风味。将纯化后的蛋白质谷氨酰胺酶应用于大豆蛋白的脱酰胺作用，以提高其溶解度，消除不良风味。

分别称取1g和2g大豆分离蛋白装于不同的水解管，用200mM酸缓冲液定容至100mL，得到10g/L以及20g/L的大豆蛋白悬浊液。分别向不同大豆分离蛋白悬浊液中加入蛋白质谷氨酰胺酶，使酶与底物的比达到20单位/克蛋白及50单位/g蛋白，然后将混合液置于37℃水浴锅中温育18h。

(1)取不同反应时间的样品，离心后取上清，测定其中的氨含量。同时，在相同体积的10g/L以及20g/L大豆分离蛋白悬浊液中加硫酸至1M，经100℃反应4h，然后测定上清中的氨含量，为总氨含量。样品中氨含量与总氨含量的百分比即为脱酰胺度。

(2)取不同反应时间的样品，加入CCl3COOH晶体使CCl3COOH浓度到达12％，沉淀蛋白后，测定上清中的蛋白含量。同时，在相同体积的大豆分离蛋白悬浊液中加硫酸至1M，经100℃反应4h，然后测定上清中的蛋白含量，为总蛋白含量。样品沉淀后上清中蛋白含量与总蛋白含量的百分比即为水解度。

表4不同蛋白质谷氨酰胺酶添加量对含有不同浓度大豆蛋白功能饮料的澄清度及风味的影响

在大豆蛋白水溶液中添加蛋白质谷氨酰胺酶，可以大幅度地提高其溶解度，使溶液的澄清度大大提高，增加饮品中的大豆蛋白含量，也能够满足消费者对大豆蛋白功能饮料的外观需求。同时，蛋白质谷氨酰胺酶的脱酰胺作用也极大程度的消除了豆腥味，满足了消费者对大豆蛋白功能饮料的口感需求。

实施例10蛋白质谷氨酰胺酶在一种蛋白质稳定剂中的应用

大豆多糖是一种常用的蛋白质稳定剂，在各种蛋白质饮品以及酸乳饮料的开发中广泛应用。将蛋白质谷氨酰胺酶与大豆多糖复配，可以增加蛋白质饮品中蛋白质的溶解度及稳定性，且使得口感更加细腻清爽。

(1)制作大豆分离蛋白含量为0.5％和1％的功能饮品：分别向含0.5％和1％大豆分离蛋白的功能饮品中加入不同复配比例的蛋白质谷氨酰胺酶和大豆多糖混合物，然后将混合液置于37℃水浴锅中温育2h。将温育后的样品分别静置10d、20d、30d、40d、60d。

(2)沉淀率测定：取静置不同时间的样品，摇匀后，取50mL，3000r/min，离心15min，去除上清液并计算沉淀率。沉淀率＝(离心后沉淀和管的质量-空管质量)/(样品和管的质量-空管的总质量)。

(3)随机在学校、展会、商场让消费者品尝不同处理的含1％大豆分离蛋白的功能饮品，并记录消费者对不同处理后饮品的口感评定。

表5蛋白质谷氨酰胺酶和大豆多糖的复合作用对蛋白质沉淀率的影响

与现有报道中功能饮品中大豆蛋白添加0.5％相比，在将蛋白质谷氨酰胺酶与大豆多糖复配后添加到饮品中，可以在饮品中大豆蛋白的添加量增加至1％时，依旧可以达到很好的蛋白质稳定作用，因此，蛋白质谷氨酰胺酶的添加可以协同大豆多糖稳定蛋白质，减少大豆多糖的用量，提高饮品中蛋白质的含量，增强其营养价值。

表6消费者对不同处理的功能饮品口感的评价结果

蛋白质谷氨酰胺酶与大豆多糖复配作为蛋白质稳定剂添加到饮品中，可以改善饮品的口感，使饮品清爽细腻，更受消费者欢迎。

在本发明中，仅需要较少的蛋白质谷氨酰胺酶用量以及较短的酶作用时间，就能达到较高的脱酰胺度。而较高的脱酰胺度能使蛋白质的溶解度、起泡性、乳化性和稳定性得到较大改善，且能消除不良风味，这对蛋白质在食品工业中的运用非常重要。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。

Claims

1.一种蛋白质谷氨酰胺酶产生菌解朊金黄杆菌(Chryseobacterium proteolyticum)YF810菌株，其特征在于，所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.10532，其16S rDNA序列如Seq ID No.3所示。

2.如权利要求1所述的蛋白质谷氨酰胺酶产生菌解朊金黄杆菌(Chryseobacteriumproteolyticum)YF810菌株，其特征在于，所述菌株能分泌蛋白质谷氨酰胺酶，即PG，所述酶的DNA序列如Seq ID No.10所示，氨基酸序列如Seq ID No.14所示。

3.如权利要求2所述的蛋白质谷氨酰胺酶产生菌解朊金黄杆菌(Chryseobacteriumproteolyticum)YF810菌株，其特征在于，编码所述蛋白质谷氨酰胺酶的信号肽的DNA序列如Seq ID No.11所示；所述信号肽的氨基酸序列如Seq ID No.15所示；编码所述蛋白质谷氨酰胺酶的前肽的DNA序列如Seq ID No.12所示；所述前肽的氨基酸序列如Seq ID No.16所示；编码所述蛋白质谷氨酰胺酶的成熟酶的DNA序列如Seq ID No.13所示；所述成熟酶的氨基酸序列如Seq ID No.17所示。

4.如权利要求1所述的蛋白质谷氨酰胺酶产生菌解朊金黄杆菌(Chryseobacteriumproteolyticum)YF810菌株，其特征在于，所述菌株在种子培养基中生长，所述菌株生长的温度为20-40℃，pH为6.0-9.0。