CN100549177C

CN100549177C - 琼脂糖酶及其基因

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Publication number: CN100549177C
Application number: CNB028089154A
Authority: CN
Inventors: 友野润; 佐川裕章; 加藤郁之进
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 2001-02-27
Filing date: 2002-02-26
Publication date: 2009-10-14
Anticipated expiration: 2022-02-26
Also published as: EP1365025A4; WO2002068659A1; DE60226182D1; JP4346308B2; JP2008220378A; ATE392477T1; EP1624065A3; JPWO2002068659A1; EP1624065B1; EP1365025A1; US20040132036A1; EP1365025B1; KR20060053024A; CN1531595A; US7622291B2; ATE307889T1; KR20030078910A; DE60206885T2; DE60206885D1; DE60226182T2

Abstract

本发明涉及可用于有效地生产琼脂寡糖、从琼脂糖凝胶中有效地提取核酸等物质的、具有琼脂糖酶活性的多肽、所述多肽的氨基酸序列、编码所述多肽的基因、所述多肽的生产方法以及琼脂寡糖的生产方法和从琼脂糖凝胶提取核酸等物质的方法。

Description

琼脂糖酶及其基因

技术领域

本发明涉及在高温下具有琼脂糖酶活性的新型琼脂糖酶及其生产方法和应用。本发明也涉及在高温下具有琼脂糖酶活性的多肽和编码所述多肽的基因。此外，本发明涉及利用所述基因通过基因工程生产在高温下具有琼脂糖酶活性的多肽的方法。

具体地说，本发明涉及可用于从琼脂糖生产具有各种生理活性的低聚合度琼脂寡糖、在高温下具有琼脂糖酶活性的α-琼脂糖酶、以及所述酶的生产方法和应用。本发明也涉及在高温下具有可用于在琼脂糖凝胶电泳之后从琼脂糖凝胶提取核酸等的活性的β-琼脂糖酶及其生产方法、所述酶的应用以及用所述酶从琼脂糖凝胶提取核酸等的方法。

背景技术

琼脂糖是琼脂的主要组分。琼脂糖是一种其结构为D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖通过α-1，3键和β-1，4键交替连接在一起的多糖。为了从琼脂生产寡糖，人们必须将琼脂糖降解为更小的分子。为此，传统上已知化学降解琼脂糖的方法和酶促消化琼脂糖的方法。在化学降解法中，可以用酸水解琼脂糖。在这种情况下，主要切割α-1，3键。已知有两种类型的酶消化琼脂糖，即切割琼脂糖中β-1，4键的β-琼脂糖酶和切割琼脂糖中α-1，3键的α-琼脂糖酶。

通过在β-1，4键切割琼脂糖获得的寡糖称为新琼脂寡糖。新琼脂寡糖在其还原末端具有D-半乳糖，其聚合度以平均数表示。另一方面，通过在α-1，3键切割琼脂糖获得的寡糖称为琼脂寡糖。琼脂寡糖在其还原末端具有3，6-脱水-L-半乳糖，其聚合度以平均数表示。最近，已表明在其还原末端具有3，6-脱水-L-半乳糖的琼脂寡糖具有诸如以下的生理活性：细胞凋亡诱导活性、制癌活性、各种抗氧化活性、免疫调节活性、抗变态反应活性、抗炎活性和抑制α-糖苷酶的活性(WO99/24447，日本专利申请11-11646号)。基于生理活性，可以提供含有所述琼脂寡糖作为其有效成分的药用组合物和功能食品或饮料。

在化学降解琼脂糖的方法中控制所生产的寡糖的大小是困难的。具体地说，选择性生产具有低聚合度的较小的寡糖相当困难(例如T.Tokunaga等，Bioscience & Industry，49：734(1991))。如果使用β-琼脂糖酶，由于这种酶仅切割β-1，4键，所以仅可以获得不具有上述生理活性的新琼脂寡糖。

预期使用具有切割α-1，3键的活性的α-琼脂糖酶，生产具有生理活性的琼脂寡糖。已知的α-琼脂糖酶包括由海洋革兰氏阴性菌菌株GJ1B产生的酶(Carbohydrate Research，66：207-212(1978)；在EuropeanJournal of Biochemistry，214：599-607(1993)中提出该菌株为解琼脂交替单胞菌(Alteromonas agarlyticus)GJ1B)，以及由弧菌属(Vibrio)细菌生产的酶(JP-A 7-322878；菌株JT0107-L4)。然而，利用解琼脂交替单胞菌GJ1B来源的α-琼脂糖酶，不可能生产具有重要的生理活性琼脂二糖，因为这种酶不能消化己糖或更短的寡糖。此外，所述弧菌属细菌来源的α-琼脂糖酶不能用来用琼脂糖作为原料生产琼脂寡糖，因为该酶仅对己糖和更短的寡糖表现出其活性，而对琼脂糖根本不起作用。

本发明人进行深入的研究，以便获得切割琼脂糖中α-1，3键并且产生具有重要生理活性的琼脂寡糖的酶，发现了产生具有适合于此目的的特性的酶的两种微生物。分离由这些微生物产生的酶，并且指明其理化特性以及酶特性。此外，本发明人还分离出所述两种酶的基因，发现了用所述基因(WO 00/50578)通过基因工程便捷地生产具有α-琼脂糖酶活性的多肽的方法。如果人们想通过用所述两种α-琼脂糖酶之一处理溶解的琼脂糖而获得琼脂寡糖，则反应温度需要低于约40℃，因为所述酶的最适反应温度约为40℃。在这种情况下，如果琼脂糖浓度高，则琼脂糖可能固化，可能妨碍所述酶促反应。因此，如果使用这样一种酶，则需要用低浓度的琼脂糖进行所述处理。因而不能处理高浓度的琼脂糖，琼脂寡糖的生产率低。因此，需要在即使琼脂糖以高浓度溶解时琼脂糖也不会固化的高温下具有活性的热稳定α-琼脂糖酶。

另一方面，在基因工程领域广泛进行在琼脂糖凝胶电泳之后从琼脂糖中提取已经过限制性酶处理或者扩增反应的核酸等。对于所述程序，常规上使用最适温度约37℃的β-琼脂糖酶。又是在这种情况下，根据所述酶的最适温度，需要降低反应温度，并且必须通过将含有待处理核酸等的琼脂糖凝胶溶于大体积的水中降低琼脂糖浓度，以防止琼脂糖固化。这样，待回收的核酸等的浓度也不可避免地被降低。浓度的降低产生问题，因为这导致回收率降低、琼脂糖消化效率降低和程序延长。为了解决这些问题，可以在高于常规温度的温度下进行反应所用的琼脂糖酶是必不可少的。美国专利第5,869,310号中描述的黄杆菌(Flavobacterium sp.)菌株NR19来源的β-琼脂糖酶可以被认为是这样一种琼脂糖酶，虽然其最适温度并不是如此高，并且热稳定性不足。因此，需要在高浓度的琼脂糖不会固化的高温下具有活性的热稳定β-琼脂糖酶。

如上所述，现有技术在琼脂寡糖生产和从琼脂糖凝胶提取诸如核酸的物质方面存在问题。

发明目的

本发明的主要目的是提供具有琼脂糖酶活性、可以用于有效生产琼脂寡糖、从琼脂糖凝胶有效提取诸如核酸的物质等的多肽；所述多肽的氨基酸序列；编码所述多肽的基因；生产所述多肽的方法；生产琼脂寡糖的方法以及从琼脂糖凝胶提取诸如核酸的物质的方法。

发明概述

鉴于上述问题，本发明人已经进行了深入的研究和探索，以便获得在高温下切割琼脂糖中α-1，3键并且可用于生产具有重要生理活性的琼脂寡糖的酶、以及在高温下切割琼脂糖中β-1，4键并且可用于从琼脂糖凝胶有效提取核酸等的酶。结果，本发明人成功地发现了产生具有适合于所述相应目的的特性的两种酶的微生物。从所述微生物中分离出所述酶，并且指出其理化特性和酶特性。

此外，本发明人成功地分离出编码所述酶的基因，并且发现了用所述基因通过基因工程便捷地生产本发明的具有α-琼脂糖酶活性的多肽和具有β-琼脂糖酶活性的多肽的方法。因而完成了本发明。

本发明概述如下。本发明的第一方面涉及新型琼脂糖酶，所述琼脂糖酶含有选自以下的氨基酸序列或者在所述氨基酸序列中一个或多个氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列：

(1)由SEQ ID NO：22的氨基酸序列中第21号氨基酸至第437号氨基酸的417个残基组成的氨基酸序列；或者

(2)由SEQ ID NO：23的氨基酸序列中第318号氨基酸至第1089号氨基酸的772个残基组成的氨基酸序列。

所述琼脂糖酶的示例为具有水解D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖之间的β-1，4键的活性的酶、或者具有水解3，6-脱水-L-半乳糖和D-半乳糖之间的α-1，3键的活性的酶。

本发明的第二方面涉及编码具有琼脂糖酶活性的多肽的基因。所述基因编码第一方面的琼脂糖酶。所述基因的示例为含有由SEQ IDNO：20的核苷酸序列中第61号核苷酸至第1311号核苷酸的1251个核苷酸组成的核苷酸序列或者在所述由1251个核苷酸组成的核苷酸序列中一个或多个核苷酸被取代、缺失、添加和/或插入的核苷酸序列的基因、或者含有由SEQ ID NO：21的核苷酸序列中第952号核苷酸至第3267号核苷酸的2316个核苷酸组成的核苷酸序列或者在所述由2316个核苷酸组成的核苷酸序列中一个或多个核苷酸被取代、缺失、添加和/或插入的核苷酸序列的基因。

本发明的第三方面涉及在严谨条件下可与第二方面的基因杂交并且编码第一方面的具有琼脂糖酶活性的多肽的基因。

本发明的第四方面涉及含有第二或第三方面的基因的重组DNA分子。

本发明的第五方面涉及带有第四方面的重组DNA分子的转化子。

本发明的第六方面涉及具有琼脂糖酶活性的多肽的生产方法，所述方法包括：培养能够产生琼脂糖酶的微生物(例如属于微生物NAB2-1-1(FERM BP-7855)所属属的微生物)，并且从培养物中收集第一方面的琼脂糖酶。

本发明的第七方面涉及具有琼脂糖酶活性的多肽的生产方法，所述方法包括培养第五方面的转化子，并且从培养物中收集第一方面的琼脂糖酶。

本发明的第八方面涉及琼脂寡糖的生产方法，所述方法包括用第一方面的琼脂糖酶消化琼脂糖，并且从消化物中收集琼脂寡糖。

本发明的第九方面涉及从琼脂糖凝胶中提取物质的方法，所述方法包括用第一方面的琼脂糖酶消化琼脂糖凝胶。

本发明的第十方面涉及用于第九方面的从琼脂糖凝胶提取物质的方法的试剂盒，所述试剂盒含有第一方面的琼脂糖酶。

本发明的第十一方面涉及改进第一方面的琼脂糖酶热稳定性的方法，所述方法包括从N末端缺失构成所述琼脂糖酶的至多30％的多肽。

发明详述

此中所用的寡糖是指由2个或2个以上、10个或10个以下的单体组成的糖。琼脂寡糖是指其结构为D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖通过α-1，3键和β-1，4键交替连接在一起并且在其还原末端具有3，6-脱水-L-半乳糖的寡糖。新琼脂寡糖是指其结构为D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖通过α-1，3键和β-1，4键交替连接在一起并且在其非还原末端具有3，6-脱水-L-半乳糖的寡糖。

多糖是指除单糖和寡糖之外的糖类。

本发明的琼脂糖酶是含有由SEQ ID NO：22的氨基酸序列中第21号氨基酸至第437号氨基酸的417个残基组成的氨基酸序列、或者含有由SEQ ID NO：23的氨基酸序列中第318号氨基酸至第1089号氨基酸的772个残基组成的氨基酸序列的琼脂糖酶。在一个实施方案中，它是一种含有在上述氨基酸序列中一个或多个氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列的多肽。例如，包括具有与所述氨基酸序列至少70％或更高、优选80％或更高、更优选90％或更高的同源性的区的多肽。可以依照已知方法，利用用于这类计算的任何计算机程序如DNASIS(Takara Shuzo)来计算同源性。

本发明的琼脂糖酶既可以作用于多糖(例如琼脂糖)，也可以作用于寡糖(例如琼脂寡糖和新琼脂寡糖)。例如，最适反应温度为45℃或更高。对于本发明的酶并无具体限制，只要它们具有这样的特性。其实例包括由海洋微生物NAB2-1-1(FERM BP-7855)生产的琼脂糖酶。

对于本发明的琼脂糖酶的切割模式并无具体限制。例如，所述琼脂糖酶可以是水解3，6-脱水-L-半乳糖和D-半乳糖之间的α-1，3键的α-琼脂糖酶，或者是水解D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖之间的β-1，4键的β-琼脂糖酶。

本发明的α-琼脂糖酶是水解3，6-脱水-L-半乳糖和D-半乳糖之间的α-1，3键并且既可以作用于多糖(例如琼脂糖)也可以作用于寡糖(例如琼脂己糖)的酶。对于本发明的所述酶并无具体限制，只要它具有这样的特性。其实例包括琼脂糖酶II，即由海洋微生物NAB2-1-1(FERMBP-7855)生产的α-琼脂糖酶。

由微生物NAB2-1-1生产的琼脂糖酶II是一种水解多糖或寡糖中3，6-脱水-L-半乳糖和D-半乳糖之间的α-1，3键的酶。所述酶作用于琼脂糖、琼脂己糖和比琼脂己糖长的琼脂寡糖(例如琼脂辛糖)以及新琼脂己糖和比新琼脂己糖长的新琼脂寡糖。

本发明的β-琼脂糖酶是水解D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖之间的β-1，4键并且既可以作用于多糖(例如琼脂糖)也可以作用于寡糖(例如琼脂己糖)的酶。对于本发明的所述酶并无具体限制，只要它具有这样的特性。其实例包括琼脂糖酶I，即由海洋微生物NAB2-1-1(FERMBP-7855)生产的β-琼脂糖酶。

由微生物NAB2-1-1生产的琼脂糖酶I是一种水解多糖或寡糖中D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖之间的β-1，4键的酶。所述酶作用于琼脂糖、新琼脂己糖和比新琼脂己糖长的新琼脂寡糖(例如新琼脂辛糖)以及琼脂己糖和比琼脂己糖长的琼脂寡糖。

以下描述测定上述酶的活性以及所述酶的理化特性和酶特性的方法。

(1)酶学测定方法

通过用Agarose LO3(Takara Shuzo)作为底物进行酶促反应，然后用高效液相色谱定量测定所得的琼脂四糖或新琼脂四糖，测定本发明琼脂糖酶的活性。具体地说，此中所用的用于测定纯化酶制剂的活性或者纯化过程中酶的活性的酶活性测定方法如下。

制备在含有10mM氯化钠的20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.2)(就琼脂糖酶I而言)中或者在含有10mM氯化钙和10mM氯化钠的20mMTris-HCl缓冲液(pH 7.2)(就琼脂糖酶II而言)中含有0.2％(w/v)或0.5％(w/v)浓度的琼脂糖的溶液。将作为底物的180μl该溶液与20μl酶溶液混合。让混合物于50℃反应5-30分钟，优选反应10分钟，然后在沸水中或于75℃加热1分钟以终止反应。让30μl所述反应混合物经过TSKgelα-2500柱(内径：7.8mm；长度：300mm；Tosoh)。用70％乙腈溶液作为洗脱液，以0.8ml/分钟的流速，定量测定以约25分钟的保留时间洗脱出的琼脂四糖或者以约24分钟的保留时间洗脱出的新琼脂四糖。一个单位(1U)定义为在10分钟内产生1μmol琼脂四糖的酶量。

(2)最适pH

让酶作用于用乙酸缓冲液(pH 4.5)、苹果酸缓冲液(pH 5.5)、乙酸缓冲液(pH 6.0、6.5)或Tris-HCl缓冲液(pH 7.0、7.5、8.8)制备的反应混合物中作为底物的琼脂糖。结果，证明琼脂糖酶I和琼脂糖酶II都在弱酸性至弱碱性条件下表现出其消化琼脂糖的活性。

(3)最适温度

本发明的琼脂糖酶II在范围为45-55℃的温度下表现出高酶活性，在约50℃下表现出最高活性。本发明的琼脂糖酶I在范围为45-70℃的温度下表现出高酶活性，在约55-65℃下表现出最高活性。

(4)热稳定性

在48℃、50℃、55℃、60℃或65℃下处理给定的时间之后，测定酶制剂的剩余活性。结果，琼脂糖酶II在55℃处理10分钟之后表现出40％的其活性。琼脂糖酶I在60℃处理10分钟之后，表现出100％的其活性；在60℃处理20分钟之后，表现出100％的其活性；在60℃处理30分钟之后，表现出98％的其活性；在65℃处理10分钟之后，表现出100％的其活性；在65℃处理20分钟之后，表现出95％的其活性；在65℃处理30分钟之后，表现出90％的其活性；而在65℃处理60分钟之后，表现出90％的其活性。

(5)钙离子需求

已知的琼脂糖酶需要钙以表现出其活性。检查本发明的相应琼脂糖酶的钙离子需求。结果，在无钙离子时，琼脂糖酶II的活性为存在钙离子时所表现出的活性的60％。在无钙离子时，琼脂糖酶I的活性为存在钙离子时所表现出的活性的100％。因此，琼脂糖酶II和琼脂糖酶I在不加入钙离子的情况下都表现出其活性。

本发明的琼脂糖酶II在CaCl₂存在下被稳定化，而它不受锰离子或镁离子的影响。

(6)分子量

用10-20％聚丙烯酰胺梯度凝胶，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定，估计琼脂糖酶II和琼脂糖酶I的分子量分别为约117,000和约48,000。

(7)依照Edman降解法测定氨基酸序列

依照Edman降解法测定的琼脂糖II和琼脂糖酶I的N末端氨基酸序列分别为Glu-Thr-Ile-Val-Leu-Gln-Ala-Glu-Ser-Phe和Ala-Asp-Xaa-Asp-Gly-Val-Pro-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly。琼脂糖酶II和琼脂糖酶I的N末端氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：1。

如下所述，分离出编码琼脂糖酶II的基因和编码琼脂糖酶I的基因。也测定了由这些基因所编码的氨基酸序列。由琼脂糖酶II基因和琼脂糖酶I基因编码的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：23和SEQ IDNO：22。由SEQ ID NO：23的氨基酸序列中第318号氨基酸至第1089号氨基酸的772个氨基酸组成的多肽表现出本发明的α-琼脂糖酶的活性，而由SEQ ID NO：22的氨基酸序列中第21号氨基酸至第437号氨基酸的417个氨基酸组成的多肽表现出本发明的β-琼脂糖酶的活性。

可以从通过培养微生物NAB2-1-1(FERM BP-7855)所获得的培养物中，纯化本发明的琼脂糖酶。NAB2-1-1从海水中作为同化琼脂的细菌分离出。它具有以下微生物学特性。

[微生物学特性]

(1)形态学

制备人工海水(商品名：Jamarin S；Jamarin Laboratory)。向其中加入0.3％(w/v)浓度的蛋白胨(Difco)和0.02％(w/v)浓度的酵母膏(Difco)。然后用3M碳酸钠将pH调至7.8。向其中加入0.1％(w/v)浓度的AgaroseLO3(Takara Shuzo)。在高压灭菌器中灭菌后，将上述微生物接种到所述混合物中，于37℃以120rpm培养过夜。在所述培养物中生长的微生物是革兰氏阴性杆菌，所述杆菌为游动的，有极生鞭毛，为需氧菌，并且需要盐。

(2)生长

制备人工海水(商品名：Jamarin S；Jamarin Laboratory)。向其中加入0.3％(w/v)浓度的蛋白胨(Difco)和0.02％(w/v)浓度的酵母膏(Difco)。然后用3M碳酸钠将pH调至7.8。向其中加入1.5％(w/v)浓度的琼脂(Nacalai Tesque)。将混合物高压灭菌，制备平板。当将上述微生物接种到平板上时，表明：

(i)它在30-40℃下生长良好；

(ii)当所述细胞生长时琼脂凝胶液化；和

(iii)它在pH 6.0-8.0下生长良好。

NAB2-1-1于2001年1月10日(原始保藏日)保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(International Patent OrganismDepositary，National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566，Japan)，保藏号为FERM BP-7855。

可以通过分析编码16S核糖体RNA(16S rRNA)的基因的核苷酸序列，获得关于上述微生物的分类学位置的信息。已知16S rRNA基因的核苷酸序列对于每种微生物菌株是特异性的。具体地说，从微生物NAB2-1-1提取染色体DNA。用可以用来扩增所述基因中一个区或其部分的引物进行PCR。测定所扩增的DNA片段的核苷酸序列。针对已测定的序列，利用GanBank数据库进行同源性搜索。则可以了解在所述区中具有相似核苷酸序列的微生物，即分类学上密切的微生物。

依照Bulletin of Japanese Society of Microbial Ecology，10：31-42(1995)中描述的方法，扩增来源于微生物NAB2-1-1的16S核糖体RNA基因的DNA片段。使用在所述文献中描述的引物27f和1492r进行PCR(引物27f和1492r的核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：32和33)。分析所得的DNA扩增片段的核苷酸序列。结果，发现了分别与产生本发明的琼脂糖酶的所述微生物在上述区中具有最高约90％同源性的以下微生物：

Pseudoalteromonas sp.KT0812A

舒氏气单胞菌(Aeromonas schubertii)

可以从NAB2-1-1以及NAB2-1-1的自发或人工突变体、或者从属于NAB2-1-1所属属并且能够产生本发明琼脂糖酶的微生物中，获得本发明的琼脂糖酶。

可以依照已知的方法，例如辐射、紫外线照射或用诱变剂处理，获得人工突变体。

已知属于同一属的微生物的16S rRNA基因的核苷酸序列之间的同源性一般为约99％或更高。因此，可以同本发明的微生物NAB2-1-1一样，使用其16S rRNA基因的核苷酸序列与微生物NAB2-1-1的所述基因的核苷酸序列具有99％或更高同源性的微生物。

可以使用含有所述微生物可以利用的氮源、无机物质等以及用琼脂、琼脂糖等作为碳源的培养基，作为所述微生物培养用的培养基。可以使用市售的琼脂或琼脂糖。氮源的实例包括肉膏、酵母膏、酪蛋白水解物、胰胨和蛋白胨。优选使用酵母膏和蛋白胨。这样的氮源也可以用作除琼脂或琼脂糖之外的碳源。此外，氯化钠、柠檬酸铁、氯化镁、硫酸钠、氯化钙、氯化钾、碳酸钠、碳酸氢钠、溴化钾、氯化锶、硼酸钠、硅酸钠、氟化钠、硝酸铵、磷酸氢二钠等可以联合用作盐。

特别是，优选使用通过向由人工海水Jamarin S组成的培养基中加入蛋白胨、酵母膏和琼脂或琼脂糖制备的培养基。优选加入0.1-2.0％浓度的琼脂或琼脂糖。通过适当改变琼脂或琼脂糖的浓度，可以制备固体或液体培养基。为了生产酶，优选使用0.1-0.3％浓度的液体培养物，而为了保存细胞，则优选使用1.2-2.0％浓度的固体培养物。如果使用低熔点琼脂糖进行液体培养，则它可以以0.1-1.0％的浓度使用。

例如，培养温度为30-40℃，培养基的pH为6.0-8.0，而培养时间为12-48小时，虽然根据培养基的组成，可以或多或少地改变培养条件。

在如上所述的培养期间所产生的本发明的α-琼脂糖酶和/或β-琼脂糖酶被分泌到细胞外。然后在培养后通过离心、过滤等除去细胞，获得培养上清液。

可以运用真空浓缩或超滤来浓缩所得的培养上清液，以制备液体酶。或者，可以将培养上清液通过冻干、喷雾干燥等转变为粉状酶，以制备粗制酶制剂。可以采用常规纯化方法，例如用硫酸铵盐析或溶剂沉淀，部分纯化本发明的α-琼脂糖酶和/或β-琼脂糖酶。此外，联合运用已知的纯化方法，例如柱色谱(例如离子交换柱和凝胶过滤柱)，可以获得在电泳时产生单一条带的纯化酶制剂。

通过将如此获得的培养物或不同纯化程度的本发明的α-琼脂糖酶，与作为底物的红藻中所含有的多糖(例如琼脂或琼脂糖)反应，可以生产琼脂寡糖，例如琼脂二糖、琼脂四糖和琼脂己糖。

琼脂糖是一种其结构为D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖通过α-1，3键和β-1，4键交替连接在一起的多糖。β-琼脂糖酶是水解琼脂糖中β-1，4键的酶。通过该酶的作用产生的在其还原末端具有D-半乳糖的寡糖称为新琼脂寡糖，它不表现出诸如用琼脂寡糖所观察到的生理活性。如果使用切割琼脂糖中α-1，3键的α-琼脂糖酶，则可以产生在其还原末端具有3，6-脱水-L-半乳糖的琼脂寡糖。来源于解琼脂交替单胞菌GJ1B和弧菌属细菌(菌株JT0107-L4)的两种酶已知是α-琼脂糖酶。然而，由解琼脂交替单胞菌GJ1B产生的α-琼脂糖酶不能作用于琼脂己糖或更短的琼脂寡糖而所述弧菌属细菌来源的α-琼脂糖酶不能消化琼脂糖。因此，用这样的α-琼脂糖酶从原料-琼脂糖有效生产琼脂二糖或琼脂四糖是不可能的。

本发明人先前发现的WO 00/50578中所述的α-琼脂糖酶是作用于琼脂糖、琼脂己糖和比琼脂己糖长的琼脂寡糖的酶。因此，它们作用于琼脂糖，产生琼脂寡糖。此外，它们还可以切割由于所述作用而产生的琼脂己糖中的单一α-1，3键。利用所述酶，有可能生产琼脂二糖和琼脂四糖，它们是依照常规方法几乎不能生产的二糖和四糖。这些酶的最适反应温度为约40℃。琼脂糖通常以1％(w/v)的浓度使用。在这一浓度下，它于50℃不固化，但于40℃固化。也就是说，如果使用常规的酶，则高浓度的琼脂糖在所述酶的最适反应温度下固化，因此可能妨碍所述酶促反应。因此，难以有效地生产琼脂二糖或琼脂四糖。

另一方面，由于本发明的α-琼脂糖酶的最适反应温度为50℃，因此，可以将其用于在琼脂糖不固化的温度下进行反应。因此，这使得能够有效地生产琼脂寡糖。

由上述理化特性可见，本发明的α-琼脂糖酶是作用于琼脂糖、琼脂己糖和比琼脂己糖长的琼脂寡糖的酶。因此，它作用于琼脂糖，产生琼脂寡糖。此外，它可以切割由于所述作用而产生的琼脂寡糖中的α-1，3键，产生诸如琼脂二糖和琼脂四糖的更小的琼脂寡糖。另外，其最适温度高，并且热稳定性非常好。因此，运用本发明的α-琼脂糖酶，有可能大量获得依照常规方法一直难以生产的二糖和四糖-琼脂二糖和琼脂四糖，而不会由于琼脂糖固化而妨碍反应。

常规α-琼脂糖酶和本发明的α-琼脂糖酶的底物特异性示于表1。在该表中，符号+和-分别代表所述酶能够和不能消化所述底物。

表1

运用本发明的α-琼脂糖酶所产生的琼脂寡糖含有琼脂二糖和琼脂四糖。所述琼脂寡糖可以含有琼脂己糖或比琼脂己糖长的琼脂寡糖，只要其存在不干扰应用目的。例如，可以用琼脂、琼脂糖或者来源于琼脂或琼脂糖的琼脂寡糖作为原料，来用本发明的α-琼脂糖酶生产琼脂二糖、琼脂四糖和琼脂己糖。所述α-琼脂糖酶作用所用的条件并无具体限制，只要所述酶在所用的条件下表现出其活性。例如，优选让琼脂糖酶II于pH 6.0-8.0、45-55℃下作用。对于所述反应混合物的组成并无具体限制，只要它适合于所述酶的作用。

如上所述，运用本发明的α-琼脂糖酶所产生的寡糖主要是低聚合度的己糖或更短的寡糖。然而，通过适当选择反应条件等，有可能任选地产生具有不同聚合度的寡糖。通过分离和纯化如此获得的寡糖，也有可能独立地获得琼脂二糖、琼脂四糖和琼脂己糖。

通过让如上所述获得的培养物或不同纯化程度的本发明β-琼脂糖酶作用于在红藻中所含有的多糖(例如琼脂或琼脂糖)，可以将琼脂或琼脂糖消化为琼脂寡糖，例如新琼脂二糖、新琼脂四糖和新琼脂己糖。

弧菌JT0107-1，4(JP-A 8-38172)和Pseudomonas altantica(Morrice，L.M.等，Eur.J.Biochem.，135，553-558(1983))来源的酶已知是β-琼脂糖酶。其最适反应温度为约30℃。如果用这样一种酶从琼脂糖凝胶中提取核酸等，则由于琼脂糖在所述酶表现出其活性的温度固化，而妨碍了所述反应。因此，它不能得到实际应用。已知黄杆菌菌株NR19(美国专利第5,869,310号)、假单胞菌(Pseudomonas sp.)N-7(JP-B 7-97987)和弧菌(Vibrio sp.)PO-303(JP-A 8-294389)来源的酶的最适反应温度高于上述酶。然而，由于其最适温度(55℃或更低)低于低熔点琼脂糖凝胶的熔点(65℃)，因此对于实际应用仍有问题。

另一方面，本发明的β-琼脂糖酶在宽范围的温度(50-70℃)下表现出高活性，并且在55-65℃表现出最高活性。因此，它使得其中琼脂糖凝胶完全熔化的反应得以进行。此外，本发明的β-琼脂糖酶的98％的活性在于65℃处理30分钟后仍得以保留，表明它的热稳定性非常好。因此，应用本发明的β-琼脂糖酶使得能够从琼脂糖凝胶中有效地提取核酸等，而不会由于琼脂糖固化受到妨碍。这样的提取依照常规方法是困难的。

本发明的α-琼脂糖酶基因是编码具有上述α-琼脂糖酶活性的多肽的基因。因此，它是指含有编码具有α-琼脂糖酶活性的多肽的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸。本发明的α-琼脂糖酶基因的实例包括含有来源于微生物NAB2-1-1(FERM BP-7855)的编码琼脂糖酶II的核苷酸序列的基因。编码琼脂糖酶II的基因的示例为具有编码由SEQ IDNO：23中第318号氨基酸至第1089号氨基酸的772个氨基酸构成的多肽的核苷酸序列的基因。

本发明的α-琼脂糖酶基因也包括含有编码具有在上述氨基酸序列中一个或多个氨基酸被取代、缺失、添加或插入的氨基酸序列并且具有α-琼脂糖酶活性的多肽的核苷酸序列的核酸。

另外，本发明的所述基因包括具有由SEQ ID NO：21中第952号核苷酸至第3267号核苷酸的2316个核苷酸组成的核苷酸序列的基因。本发明的所述基因也包括含有具有在上述核苷酸序列中一个或多个核苷酸被取代、缺失、添加或插入的核苷酸序列并且编码具有α-琼脂糖酶活性的多肽的核苷酸序列的核酸。

此外，本发明的基因包括含有在严谨条件下与上述基因杂交并且编码具有α-琼脂糖酶活性的多肽的核苷酸序列的核酸。可以依照例如T.Maniatis等(编著)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual 2nd ed.，1989，Cold Spring Harbor Laboratory中所述的方法进行杂交。所述严谨条件的示例为与探针于65℃在含有6×SSC(1×SSC：0.15M氯化钠、0.015M柠檬酸钠，pH 7.0)、0.5％SDS、5×Denhardt氏液和100mg/ml鲱精DNA的溶液中保温过夜。

本发明的β-琼脂糖酶基因是编码具有上述β-琼脂糖酶活性的多肽的基因。因此，它是指含有编码具有β-琼脂糖酶活性的多肽的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸。本发明的β-琼脂糖酶基因的实例包括含有来源于微生物NAB2-1-1(FERM BP-7855)的编码琼脂糖酶I的核苷酸序列的基因。编码琼脂糖酶I的基因的示例为具有编码由SEQ IDNO：22中第21号氨基酸至第437号氨基酸的417个氨基酸残基构成的多肽的核苷酸序列的基因。

本发明的β-琼脂糖酶基因也包括含有编码具有在上述氨基酸序列中一个或多个氨基酸被取代、缺失、添加或插入的氨基酸序列并且具有β-琼脂糖酶活性的多肽的核苷酸序列的核酸。

另外，本发明的所述基因包括具有由SEQ ID NO：20中第61号核苷酸至第1311号核苷酸的1251个核苷酸组成的核苷酸序列的基因。本发明的所述基因也包括含有在上述核苷酸序列中一个或多个核苷酸被取代、缺失、添加和/或插入的核苷酸序列并且编码具有β-琼脂糖酶活性的多肽的核苷酸序列的核酸。

此外，本发明的所述基因包括含有在严谨条件下与上述基因杂交并且编码具有β-琼脂糖酶活性的多肽的核苷酸序列的核酸。所述严谨条件的示例为如上所述的那些条件。

例如，本发明的琼脂糖酶基因可以如下克隆。

从产生琼脂糖酶的微生物中制备基因组DNA。可以依照合适的已知方法，制备基因组DNA。例如，可以联合使用已知方法，例如溶菌酶处理、蛋白酶处理、RNA酶处理、苯酚处理和乙醇沉淀，制备基因组DNA。采用合适的已知方法，例如超声处理或用限制性酶消化，降解如此获得的基因组DNA。依照构建重组DNA分子的常规方法，将所得的DNA片段掺入到载体(例如质粒载体)中。然后将所述重组DNA分子导入合适的宿主(例如大肠杆菌)中，获得转化子。可以从常规方法中选择适用于待使用的载体和宿主的用于构建重组DNA分子、转化等的方法，例如在Molecular Cloning：A Laboratory Manual 2nd ed.中描述的那些方法。因此，获得含有带有琼脂糖酶基因的转化子的基因组文库。

接着，筛选基因组文库，以选择带有所述琼脂糖酶基因的转化子。从可以所述转化子中分离出所述琼脂糖酶基因。筛选方法的实例如下。

(1)用琼脂糖酶活性的表达作为指标进行筛选

让基因组文库在琼脂平板上生长。带有琼脂糖酶基因的转化子表达具有琼脂糖酶活性的多肽。所述多肽通过其琼脂糖酶活性的作用，溶解琼脂凝胶。因此，选择在琼脂平板溶解琼脂凝胶的菌落或噬斑。

(2)用抗体进行筛选

如上所述制备粗制、部分纯化或纯化的琼脂糖酶酶制剂。用所述制剂作为抗原，依照常规方法制备抗琼脂糖酶抗体。

让基因组文库在平板上生长。将生长的菌落或噬斑转移到尼龙滤膜或硝化纤维素滤膜上。已表达的重组蛋白与所述菌落或噬斑一起被转移到所述滤膜上。让滤膜上的重组蛋白与所述抗琼脂糖酶抗体反应，以鉴定与所述抗体反应的克隆。

可以依照已知方法，例如通过使过氧化物酶缀合第二抗体与已经与所述抗琼脂糖酶抗体反应的滤膜反应，让所述滤膜与显色底物一起保温，然后检测所显现出的颜色，可以鉴定与所述抗体反应的克隆。

如果使用导致在所述载体中所掺入的DNA中的基因高表达的表达载体，来构建在上述方法(1)或(2)中使用的基因组文库，则可以容易地选择带有目标基因的转化子。

(3)通过用DNA探针杂交进行筛选

让基因组文库在平板上生长。将生长的菌落或噬斑转移到尼龙滤膜或硝化纤维素滤膜上。将DNA通过变性固定化到所述滤膜上。依照常规方法，让滤膜上的DNA与标记探针杂交，以鉴定与所述探针杂交的克隆。

用于这种筛选的探针包括基于上述琼脂糖酶的氨基酸序列的信息制备的寡核苷酸、基于另一氨基酸序列的信息制备的寡核苷酸、和用基于这样的氨基酸序列的信息制备的引物所扩增的PCR片段。用于所述探针的标记的实例包括但不限于放射性同位素标记、荧光标记、洋地黄毒苷标记和生物素标记。

富集了如下制备的带有琼脂糖酶基因的转化子的基因组文库，可以用作供所述筛选用的基因组文库。

依照常规方法，从产生琼脂糖酶的微生物中制备基因组DNA，用合适的限制性酶消化，通过琼脂糖凝胶电泳分离，然后转印到尼龙滤膜或硝化纤维素滤膜上。依照常规方法，让滤膜上的DNA与上述标记探针杂交，以检测与所述探针杂交的DNA片段。从所述琼脂糖凝胶中提取和纯化对应于所述信号的DNA片段。

依照常规方法，将如此获得的DNA片段掺入到载体(例如质粒载体)中，构建重组DNA分子。然后将所述重组DNA分子导入合适的宿主(例如大肠杆菌)中，获得转化子。可以从常规方法中选择适用于待使用的载体的转化方法，例如在Molecular Cloning：A LaboratoryManual 2nd ed.中描述的那些方法。因此，获得富集了带有琼脂糖酶基因的转化子的基因组文库。

使用这样一种基因组文库，可以更有效地进行筛选。

可以在如上所述的方法(1)-(3)中筛选转化子，克隆目标基因。通过运用PCR，可以在体外进行克隆，而无需利用转化子。

从产生琼脂糖酶的微生物中制备基因组DNA。用基因组DNA作为模板，使用基于所述琼脂糖酶的氨基酸序列的信息制备的一对引物，进行PCR。因此，可以获得含有琼脂糖酶基因的DNA片段。此外，例如通过用所述片段作为探针进行杂交，或者用基于所述片段的核苷酸序列制备的引物进行PCR，可以获得全长琼脂糖酶基因。可以依照已知方法，测定如上所述获得的基因的核苷酸序列。如果所述克隆不编码完整的琼脂糖酶多肽，则通过重复包括基于所述已测定核苷酸序列制备新探针和用所述探针筛选基因组文库获得新克隆的程序，揭示所述琼脂糖酶的完整可读框(ORF)。例如，基于如此获得的信息，可以制备含有编码所述琼脂糖酶的完整ORF的克隆。

通过基因工程，通过将如上所述获得的编码所述琼脂糖酶的基因与合适的表达载体连接，可以大量生产具有琼脂糖酶活性的多肽。

以下简述用于获得本发明的基因的方法。

用溶菌酶裂解通过培养微生物NAB2-1-1而获得的细胞，然后除去蛋白质、经过乙醇沉淀等，获得染色体DNA。NAB2-1-1染色体DNA用限制性酶完全消化。将对应于所述限制性酶的连接物与已消化的DNA连接。用所得的染色体DNA作为模板，使用基于本发明的琼脂糖酶I或II的N末端氨基酸序列或内部氨基酸序列制备的引物以及对应于所述连接物的核苷酸序列的引物，进行PCR。

通过分析如上所述获得的PCR产物的核苷酸序列，可以确定编码本发明的琼脂糖酶的核苷酸序列。如果不能测定所述完整序列，则可以重复上述程序。或者，用染色体DNA作为模板，可以进行引物步查。

基于所述琼脂糖酶的氨基酸序列设计的引物可以是混合引物。或者，用基于所述N末端氨基酸序列和内部氨基酸序列制备的引物，用NAB2-1-1染色体DNA作为模板，通过PCR获得扩增产物，可以使用基于所述扩增产物的核苷酸序列制备的新引物。

如此获得的编码琼脂糖酶II的基因具有编码由1089个氨基酸构成的多肽的ORF。所述ORF的核苷酸序列示于SEQ ID NO：21。由所述ORF的核苷酸序列所编码的氨基酸序列示于SEQ ID NO：23。在所述基因的核苷酸序列中，发现了对应于P2(琼脂糖酶II的N末端氨基酸序列)的核苷酸序列、编码具有信号肽样序列的26个氨基酸的上游核苷酸序列、和更上游区中的SD样序列。

因此，SEQ ID NO：23的氨基酸序列是本发明α-琼脂糖酶的一个实例。该氨基酸序列与先前测定的琼脂糖酶II的N末端氨基酸序列的比较表明，琼脂糖酶II是一种由SEQ ID NO：23的氨基酸序列中第27号氨基酸至第1089号氨基酸的氨基酸序列构成的多肽，并且所述氨基酸序列由SEQ ID NO：21的核苷酸序列中第79号核苷酸至第3270号核苷酸(包括终止密码子)的核苷酸序列所编码。

在所述ORF中发现了三个推定的钙结合区(171-184、271-283和987-999)。

所述编码琼脂糖酶I的基因有一个编码由438个氨基酸构成的多肽的ORF。所述ORF的核苷酸序列示于SEQ ID NO：20。由所述ORF的核苷酸序列所编码的氨基酸序列示于SEQ ID NO：22。在所述基因的核苷酸序列中，发现了对应于P1(琼脂糖酶I的N末端氨基酸序列)的核苷酸序列、编码20个氨基酸的上游核苷酸序列、和更上游区中的SD样序列。

因此，SEQ ID NO：22的氨基酸序列是本发明的琼脂糖酶的一个实例。该氨基酸序列与先前测定的琼脂糖酶I的N末端氨基酸序列的比较表明，琼脂糖酶I是一种由SEQ ID NO：22的氨基酸序列中第21号氨基酸至第438号氨基酸的氨基酸序列构成的多肽，并且所述氨基酸序列由SEQ ID NO：20的核苷酸序列中第61号核苷酸至第1314号核苷酸(包括终止密码子)的核苷酸序列所编码。

如上所述获得的琼脂糖酶I的氨基酸序列与得自黄杆菌菌株NR19的已知β-琼脂糖酶的氨基酸序列仅有33％的同源性。因此，认为本发明的琼脂糖酶I具有绝对新颖的序列。

通过将编码本发明的琼脂糖酶的基因(例如编码琼脂糖酶I或琼脂糖酶II的基因)与合适的载体连接，可以构建重组DNA分子。此外，通过将所述重组DNA分子导入合适的宿主中，可以制备转化子。用通过培养所述转化子所获得的培养物，生产本发明的琼脂糖酶。因此，有可能用所述转化子大量生产本发明的琼脂糖酶(例如琼脂糖酶I或琼脂糖酶II)。

通过依照已知方法，在编码琼脂糖酶的基因中引入突变，可以产生突变型琼脂糖酶。可以使用的用于引入突变的方法的实例包括但不限于寡核苷酸双琥珀法(Hashimoto-Gotoh，T.等，Gene，152：271-275(1995))、带缺口的双链体法(the gapped duplex method)(Kramer，W.等，Nucl.Acids Res.，12：9441(1984)；Kramer，W.等，Methods in Enzymology，154：350(1987))和Kunkel法(Kunkel，T.A.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：488(1985)；Kunkel，T.A.，Methods in Enzymology，154：367(1987))。

通过表达编码在待表达的琼脂糖酶的N末端添加信号序列的多肽的基因，可以使目标琼脂糖酶分泌到转化子外。所述信号序列并不限于具体的信号序列，其示例为由SEQ ID NO：22中第1号氨基酸至第20号氨基酸所示的琼脂糖酶I的信号序列。这一信号序列由SEQ IDNO：22中的第1号核苷酸至第60号核苷酸的核苷酸序列编码。或者，所述信号序列的示例为由SEQ ID NO：23中第1号氨基酸至第26号氨基酸所示的琼脂糖酶I的信号序列。这一信号序列由SEQ ID NO：21中的第1号核苷酸至第78号核苷酸的核苷酸序列编码。

可以用来构建重组DNA分子的载体的示例包括但不限于质粒载体、噬菌体载体和病毒载体。可以根据使用所述重组DNA的目的，选择合适的载体。如果构建重组DNA分子以生产琼脂糖酶，则优选含启动子和/或供表达控制用的其它区的载体。这样的质粒载体的实例包括但不限于pKF19k、pT7BlueT和pET16b。可以用于制备转化子的宿主包括但不限于诸如细菌、酵母和丝状真菌的微生物以及哺乳动物、鱼类、昆虫等的培养细胞。用适合于所述宿主的载体构建的重组DNA分子来构建转化子。

以下简述通过基因工程生产琼脂糖酶I的方法。

将含有编码具有例如始于SEQ ID NO：22的第21号氨基酸的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的DNA片段，插入到合适的质粒载体(例如pKF19k(Takara Shuzo)、pT7BlueT(Takara Shuzo)或pET16b(TakaraShuzo)中，构建质粒。在合适的液体培养基中，培养用这样的质粒转化的大肠杆菌(例如大肠杆菌JM109或BL21(DE3)pLysS)。如有需要，用IPTG等进行诱导。让所述质粒中所插入的DNA片段所编码的多肽表达。单位体积的培养物中由这种转化子表达的β-琼脂糖酶活性通常高于用NAB2-1-1培养物所观察到的所述活性。

对于琼脂糖酶II，用编码具有例如始于SEQ ID NO：23的第27、181或318号氨基酸的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的DNA片段，通过如上关于琼脂糖酶I所述的基因工程，可以制备表达琼脂糖酶II的转化子。所得的转化子表达α-琼脂糖酶活性，单位体积的培养物中的所述活性通常高于用NAB2-1-1培养物所观察到的所述活性。

如上所述通过基因工程生产的本发明的琼脂糖酶，可以通过常规纯化方法例如用硫酸铵盐析或溶剂沉淀进行部分纯化。此外，联合运用已知的纯化方法，例如柱色谱(例如阴离子交换柱或凝胶过滤柱)，可以获得电泳时产生单一条带的纯化酶制剂。

如果通过基因工程生产的本发明的琼脂糖酶不溶解，则可以依照已知方法将其溶解并回收。

通过让如此获得的不同纯化程度的本发明重组α-琼脂糖酶与作为底物的红藻中所含有的多糖(例如琼脂或琼脂糖)反应，可以生产琼脂寡糖，例如琼脂二糖、琼脂四糖、琼脂己糖和琼脂辛糖。

例如，通过用1％(w/v)琼脂糖作为底物，于50℃反应16小时，可以生产所述琼脂寡糖。

同样，通过让如此获得的不同纯化程度的本发明的重组β-琼脂糖酶作用于已经经过核酸等电泳的琼脂糖凝胶，可以有效地提取琼脂糖凝胶中的物质(例如核酸)。

例如，在于1％(w/v)或3％(w/v)琼脂糖凝胶上电泳的情况下，通过让本发明的重组β-琼脂糖酶于67℃作用于含有目标物质的琼脂糖凝胶达10分钟，可以有效地提取所述凝胶中的物质。

通过从N末端缺失所述ORF的至多30％，可以改进本发明的琼脂糖酶的热稳定性。待缺失区并无具体限制，只要它至多为所述ORF的30％(例如10％、20％等)。例如，通过从N末端缺失琼脂糖酶II的29.1％(即317个氨基酸)，可以改进琼脂糖酶II的热稳定性。在钙存在下观察到特别显著的热稳定性的改进。

对于用于缺失N末端部分以改进热稳定性的方法并无具体限制。它可以通过用蛋白酶处理或者通过用基因工程技术来进行。

实施例

以下实施例更详细地说明本发明，但不应解释为限制本发明的范围。

实施例1

活性测定方法

当纯化本发明的琼脂糖酶时，通过用Agarose LO3(Takara Shuzo)作为底物进行酶促反应，然后用高效液相色谱定量测定所得的琼脂四糖或新琼脂四糖，测定纯化的或者部分纯化的所述酶制剂的活性。以下详细描述所述程序。

制备在含有10mM氯化钠的20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.2)(就琼脂糖酶I而言)中或者在含有10mM氯化钙和10mM氯化钠的20mMTris-HCl缓冲液(pH 7.2)(就琼脂糖酶II而言)中含有0.2％(w/v)或0.5％(w/v)浓度的琼脂糖的溶液。将作为底物的180μl该溶液与20μl酶溶液混合。让混合物于50℃反应5-30分钟，优选反应10分钟，然后在沸水中或于75℃加热1分钟以终止反应。让30μl所述反应混合物经过TSKgelα-2500柱(内径：7.8mm；长度：300mm；Tosoh)。用70％乙腈溶液作为洗脱液，以0.8ml/分钟的流速进行洗脱。定量测定由于酶促反应产生的以约25分钟的保留时间洗脱出的琼脂四糖或者以约24分钟的保留时间洗脱出的新琼脂四糖。一个单位(1U)定义为在10分钟内产生1μmol琼脂四糖或新琼脂四糖的酶量。

实施例2

从NAB2-1-1生产琼脂糖酶

制备100ml人工海水(商品名：Jamarin S；Jamarin Laboratory)。向其中加入浓度分别为0.3％(w/v)和0.02％(w/v)的蛋白胨(Difco)和酵母膏(Difco)。然后用3M碳酸钠将pH调至7.8。将所得的混合物转移到500ml锥形瓶中。向其中加入0.4g NuSieve GTG Agarose(Takara Shuzo)。用高压灭菌器灭菌后，将NAB2-1-1接种到所述混合物中，于37℃以120rpm培养过夜。所得的培养物用作预培养物。

如下进行主培养。在5,000ml小型发酵容器中制备3,000ml人工海水(商品名：Jamarin S；Jamarin Laboratory)。向其中加入浓度分别为0.3％(w/v)和0.02％(w/v)的蛋白胨(Difco)和酵母膏(Difco)。然后将pH调至7.8。向其中加入12g NuSieve GTG Agarose(Takara Shuzo)。混合物用高压灭菌器灭菌。将30ml预培养物接种到所述混合物中，于37℃以250rpm培养18小时。然后将培养物以8,000×g离心20分钟，收集约3,000ml已经除去了细胞的上清液。

以下操作于4℃或4℃以下进行。

将上清液置于透析膜(Sanko Junyaku)中，于约500g聚乙二醇中浸泡两夜，以将其浓缩约10倍。将300ml浓缩液对缓冲液I(含有10mM氯化钙和10mM氯化钠的20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.2))透析以便脱盐。

将透析液上样至已经用所述缓冲液平衡的填充阴离子交换树脂DEAE Toyopearl 650M(Tosoh)的柱

上。柱子用约120ml缓冲液I洗涤。收集不吸附流分和洗涤流分(约400ml)，将其合并作为琼脂糖酶I级分。用10mM至1,000mM氯化钠的线性梯度(总洗脱体积：400ml)进行洗脱。收集在300mM-600mM氯化钠浓度洗脱出的约160ml的流分，作为琼脂糖酶II级分。

将琼脂糖酶I级分和琼脂糖酶II级分对缓冲液II(含有10mM氯化钙、10mM氯化钠、5％甘油和1mM PMSF的20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.2))透析以便脱盐。

如下对琼脂糖酶II级分进行进一步纯化。将经透析的琼脂糖酶II级分上样至填充25ml QAE Toyopearl 550C(Tosoh)的柱

上。在这种情况下，用10mM至800mM氯化钠的线性梯度(总洗脱体积：250ml)进行洗脱。获得于约500mM洗脱出的约70ml的流分。将该流分对缓冲液II透析，用离心超滤膜CENTRIPREP-10(Amicon)浓缩至约1ml。用以缓冲液II平衡的填充Sephadex G-100(Pharmacia)的柱

对浓缩液进行凝胶过滤。获得约20ml的琼脂糖酶II级分。再次用超滤膜将该级分浓缩至约1ml的体积。

经纯化的蛋白在含十二烷基硫酸钠(SDS)的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，表明所述蛋白被纯化至几乎均质。总活性约为150U。

如下对琼脂糖酶I级分进行进一步纯化。

让经透析的琼脂糖酶I级分(约400ml)吸附到已经用缓冲液II平衡的填充CM Toyopearl 650(Tosoh)的柱

上。用10mM至1,000mM氯化钠的线性梯度(总洗脱体积：300ml)进行洗脱。收集在至多300mM氯化钠浓度洗脱出的约90ml的琼脂糖酶I级分。将该级分对含有1.0M硫酸铵的缓冲液II透析过夜，上样至用同一缓冲液平衡的填充30ml Butyl Toyopearl 650M(Tosoh)的柱

上。用1.0M至0M硫酸铵的梯度(总洗脱体积：300ml)进行洗脱。回收300mM至0M浓度下洗脱出的琼脂糖酶I级分(约60ml)。同琼脂糖酶II一样，将所述级分对缓冲液II透析，用离心超滤膜CENTRIPREP-10(Amicon)浓缩至约1ml的体积。

经纯化的蛋白在含十二烷基硫酸钠(SDS)的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，表明所述蛋白被纯化至几乎均质。总活性约为310U。

实施例3

酶的各种特性的检查

[与琼脂糖酶I和琼脂糖酶II反应的产物的鉴定]

用琼脂糖酶I或琼脂糖酶II的纯化酶，对20μl在含有10mM氯化钠的20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.2)(就琼脂糖酶I而言)中或者在含有10mM氯化钙和10mM氯化钠的20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.2)(就琼脂糖酶II而言)中含有0.5％(w/v)浓度的琼脂糖的溶液进行消化。让消化产物经过凝胶过滤柱(Tosoh，TSKgelα-2500)，用70％乙腈作为洗脱液。结果，在约24分钟和约28分钟处观察到琼脂糖酶I的主峰。基于所观测到的标准品的保留时间，认为这些峰分别对应于新琼脂四糖和新琼脂己糖。对于使用琼脂糖酶II的消化产物，在约22分钟、约25分钟和约29分钟的保留时间处观察到主峰。基于所观测到的标准品的保留时间，认为这些峰分别对应于琼脂二糖、琼脂四糖和琼脂己糖。通过对其进行薄层色谱，使用组成为氯仿∶甲醇∶乙酸＝3∶3∶1的展开剂进行两轮展层，证实了所述反应产物。三种琼脂寡糖即琼脂二糖(Rf值＝0.76)、琼脂四糖(Rf值＝0.50)和琼脂己糖(Rf值＝0.33)以及两种新琼脂寡糖即新琼脂四糖(Rf值＝0.59)和新琼脂己糖(Rf值＝0.41)用作对照。结果，用苔黑酚-硫酸，在对应于用琼脂糖酶I获得的反应产物的新琼脂寡糖的位置上，观测到显色物质。在对应于用琼脂糖酶II获得的反应产物的琼脂寡糖的位置上，观测到显色物质。这些结果表明，琼脂糖酶I是一种水解琼脂糖分子中D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖之间的β-1，4键产生新琼脂寡糖的β-琼脂糖酶，而琼脂糖酶II是一种水解琼脂糖分子中的α-1，3键产生琼脂寡糖的α-琼脂糖酶。

[钙离子需求]

将琼脂糖酶I溶液和琼脂糖酶II溶液对无钙缓冲液(含有10mM氯化钠和1mM EDTA的20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.2))透析过夜。向其中加入在含有10mM氯化钠和1mM EDTA的20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.2)中含有0.2％(w/v)浓度的琼脂糖的溶液。让混合物于50℃反应10分钟。通过在沸水中加热1分钟(就琼脂糖酶I而言)或于75℃加热1分钟(就琼脂糖酶II而言)终止反应。然后，测量活性。将用含钙的常规缓冲液进行反应时所观测到的活性定义为100％。结果，琼脂糖酶I和琼脂糖酶II分别表现出约100％和约60％的其活性。

[最适温度]

酶失活受到抑制并且对于琼脂糖酶I和琼脂糖酶II而言反应容易进行的温度分别是50-65℃和45-55℃。

[热稳定性]

将所述酶溶液于48℃、50℃、55℃、60℃或65℃加热给定时间。然后，向所述经加热的溶液中加入在含有10mM氯化钠的20mMTris-HCl缓冲液(pH 7.2)(就琼脂糖酶I而言)中或者在含有10mM氯化钙和10mM氯化钠的20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.2)(就琼脂糖酶II而言)中含有0.2％(w/v)浓度的琼脂糖的溶液。让混合物于50℃反应10分钟。通过在沸水中加热1分钟(就琼脂糖酶I而言)或于75℃加热1分钟(就琼脂糖酶II而言)终止反应。然后，测量活性。将于50℃常规反应10分钟时所观测到的活性定义为100％。结果，琼脂糖酶I在于65℃处理60分钟之后表现出其活性的约85％，琼脂糖酶II在于55℃处理10分钟后表现出其活性的约40％。

[分子量]

用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量。依照常规方法，用含有SDS的10-20％聚丙烯酰胺梯度凝胶和分子量标记(Bio-Rad，肌球蛋白(MW 200,000)、β-半乳糖苷酶(MW 116,250)、磷酸化酶b(MW97,400)、牛血清白蛋白(MW 66,200)、卵清蛋白(MW 45,000)、碳酸酐酶(MW 31,000)、胰蛋白酶抑制剂(MW 21,500)、溶菌酶(MW 14,400))，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。根据迁移率测定，琼脂糖酶I和琼脂糖酶II的分子量分别为约48,000和约117,000。

[氨基末端的氨基酸序列]

依照Edman降解法，测定琼脂糖I和琼脂糖酶II的氨基末端氨基酸序列。用10-20％聚丙烯酰胺梯度凝胶，对含有对应于约10pmol酶蛋白的琼脂糖酶I或琼脂糖酶II的纯化酶制剂溶液进行SDS-PAGE。电泳后，将凝胶上分离的酶转印到膜ProBlot(Applied Biosystems)。用蛋白测序仪G1000A(Hewlett Packard)，分析所述膜中已经吸附有所述酶的部分。结果，所测定的琼脂糖酶I的氨基末端氨基酸序列(P1；SEQID NO：1)和琼脂糖酶II的氨基末端氨基酸序列(P2；SEQ ID NO：2)分别为Ala-Asp-Xaa-Asp-Gly-Val-Pro-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly和Glu-Thr-Ile-Val-Leu-Gln-Ala-Glu-Ser-Phe。

[部分氨基酸序列的测定]

用2nmol纯化的琼脂糖酶I或II，进行半胱氨酸残基的羧甲基化。用HPLC从通过用赖氨酰内肽酶消化所获得的消化产物中，分离和纯化肽片段。对于所述柱使用μBondasphare C8(Waters)，用溶液A(0.1％TFA)和溶液B(含0.1％TFA的80％乙腈)进行洗脱。通过将溶液B的比率在50分钟内以线性方式从0％提高至100％，以0.5ml/分钟的流速进行洗脱。于214nm进行检测，以便收集流分。对相应的肽流分进行氨基酸序列分析。对于琼脂糖酶I，测定部分氨基酸序列PI3(SEQ IDNO：3)和PI4(SEQ ID NO：4)。对于琼脂糖酶II，测定部分氨基酸序列PII5(SEQ ID NO：5)、PII6(SEQ ID NO：6)和PII7(SEQ ID NO：7)。

实施例4

琼脂寡糖的生产

向2ml反应用缓冲液(含有10mM氯化钙和10mM氯化钠的20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.2))中加入Agarose LO3，终浓度为1.0％(w/v)。再向其中加入约1.0U琼脂糖酶II的纯化制剂。让混合物于50℃反应16小时。反应后，反应混合物通过0.22μm滤膜(Millipore)过滤。用高效液相色谱，在与实施例1中测量本发明所述酶的活性所用条件相同的条件下，分析经过滤的反应混合物，以测定所产生的琼脂寡糖。结果，在反应混合物中检测到琼脂二糖、琼脂四糖和琼脂己糖。因此，证明上述酶促反应产生这些较小的琼脂寡糖。

实施例5

新琼脂寡糖的生产

向2ml反应用缓冲液(含有10mM氯化钠的20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.2))中加入Agarose LO3，终浓度为1.0％(w/v)。再向其中加入约1.0U琼脂糖酶I的纯化制剂。让混合物于65℃反应16小时。反应后，反应混合物通过0.22μm滤膜(Millipore)过滤。用高效液相色谱，在与实施例1中测量本发明所述酶的活性所用条件相同的条件下，分析经过滤的反应混合物，以测定所产生的新琼脂寡糖。结果，在反应混合物中检测到新琼脂四糖和新琼脂己糖。因此，证明上述酶促反应产生这些较小的新琼脂寡糖。

实施例6

用琼脂糖酶I从琼脂糖凝胶中回收核酸

用1μg DNA分子量标记-λHindIII(Takara Shuzo)在1.0％(w/v)SeaPlaque GTG琼脂糖凝胶上进行电泳。切割含有分离的大小约4.4kbp和约6.6kbp的DNA片段的凝胶，将其置于1.5ml Eppendorf管中。向其中加入1ml反应缓冲液(含50mM氯化钠的20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.2))。让混合物于室温静置10分钟。然后弃去缓冲液，将凝胶留在管中。将管于67℃保温5分钟，以熔化凝胶。向其中加入1.0U纯化的琼脂糖酶I。将混合物于室温保温10分钟。将Eppendorf管置于冰上，以证实琼脂糖酶凝胶完全溶解。然后依照常规方法进行乙醇沉淀，回收所述DNA片段。同样，对DNA分子量标记-100bp分子量梯式标记(Ladder Marker)(Takara Shuzo)进行从3.0％(w/v)NuSieveGTG琼脂糖凝胶回收DNA。在这种情况下，回收了400bp和500bp的DNA片段。所述DNA回收率与Pseudoaltermonas atlantica(TakaraShuzo)来源的市售β-琼脂糖酶的回收率的比较结果示于表2中。

如果使用所述市售β-琼脂糖酶，则在加入所述酶之前，应该将温度从熔化琼脂糖凝胶所用的温度降至所述酶可以作用的温度。由于反应温度低，因此需要的反应时间长，延长所述程序所用的时间。

另一方面，如果使用本发明的琼脂糖酶I，则可以在熔化琼脂糖凝胶之后立即加入所述酶。由于反应可以在高温下进行而无需降低温度，所以所述程序仅需要短时间。

表2

*DNA回收量/DNA上样量×100。

**直至乙醇沉淀所需的时间。

实施例7

从NAB2-1-1制备染色体DNA

制备1升人工海水(商品名：Jamarin S；Jamarin Laboratory)。向其中加入浓度分别为0.3％(w/v)和0.02％(w/v)的蛋白胨(Difco)和酵母膏(Difco)。然后用3M碳酸钠将pH调至7.8。向其中加入0.1％(w/v)浓度的琼脂(Nacalai Tesque)。用高压灭菌器将混合物灭菌。将10μl产琼脂糖酶的菌株NAB2-1-1的甘油储液接种到2ml所述培养基中，于37℃培养过夜。将1ml所述培养物接种到100ml同一种培养基中，于37℃培养过夜。以8,000×g离心10分钟收集细胞。将细胞悬浮于10ml缓冲液A(含有100mM NaCl和10mM EDTA(pH 8.0)的100mMTris-HCl缓冲液(pH 8.0))中。向其中加入0.25ml的溶菌酶溶液(20mg/ml)。让混合物于37℃保温1小时。然后向其中加入含有5.0％浓度的SDS的2.5ml缓冲液A。让所得混合物于60℃在振荡下保温20分钟。向其中加入1.5ml蛋白酶K溶液(20mg/ml)。让混合物于37℃保温过夜。然后向混合物中加入几乎等体积的苯酚，将所得的混合物于室温温和振荡约10分钟。将混合物以2,000×g离心10分钟。将上清液转移到冷乙醇中。用玻璃棒缠绕染色体DNA。向从中缠绕了染色体DNA的溶液中加入几乎等体积的苯酚，进行同样的程序，以再次缠绕染色体DNA。将染色体DNA悬浮于10μl缓冲液A中。向其中加入50μl RNA酶A溶液(10mg/nl)，让混合物于37℃保温10分钟。通过乙醇沉淀从溶液中回收染色体DNA，将其悬浮于5ml缓冲液B(含有140mM NaCl和1mM EDTA(pH 7.5)的20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5))中。将悬浮液对同一种缓冲液透析过夜。则获得约5.0mg染色体DNA。根据OD260nm/280nm，测定所述DNA的纯度。在每种情况下所述数值都是约1.8。用所述染色体DNA如下所述克隆琼脂糖酶I和琼脂糖酶II。

实施例8

琼脂糖酶I基因的克隆

依然实施例3中所述测定的琼脂糖酶I的N末端氨基酸序列P1(SEQ ID NO：1)，设计混合引物1和2(SEQ ID NO：8和9)，用DNA合成仪合成，并进行纯化。具体地说，SEQ ID NO：8和9所示的混合引物1和2分别对应于氨基酸序列P1中第4-10号和第4-13号氨基酸的氨基酸序列。用这些引物和LA PCR体外克隆试剂盒(Takara Shuzo)进行所述琼脂糖酶I基因的克隆。

如下进行初次PCR。在实施例7中制备的染色体DNA用限制性酶BamHI完全消化。用DNA连接试剂盒(Takara Shuzo)，将BamHI连接物连接到所述经消化的DNA的末端。将其一部分置于0.5ml PCR用试管中。向其中加入5μl 10×LA PCR缓冲液、8μl dNTP混合物、1μl混合引物1、1μl引物C1(LA PCR体外克隆试剂盒(TaKaRa Shuzo)所附的引物)、0.5μl TaKaRa LA Taq和无菌水至50μl。在溶液上铺上50μl矿物油之后，用自动基因扩增仪器热循环仪(Takara Shuzo)使所述试管进行反应。于94℃变性2分钟之后，进行30个循环的PCR。每个循环由94℃变性1分钟、引物于50℃退火2分钟和于72℃合成反应2分钟组成。

接着，用所述反应混合物作为模板进行二次PCR。除用通过初次PCR获得的1μl反应混合物作为模板以及使用混合引物2和引物C2(LA PCR体外克隆试剂盒(Takara Shuzo)所附的引物)组合之外，在与初次PCR所用条件相同的条件下进行PCR。在PCR之后，除去矿物油上层，用5μl反应混合物在1.0％琼脂糖凝胶上电泳，然后所述DNA用溴化乙锭染色，以证实扩增产物。结果，观察到约0.8kb的DNA片段。所述DNA片段被命名为βN。

将从琼脂糖凝胶上切取的扩增片段βN与载体pT7Blue连接，用来转化大肠杆菌JM109。依照双脱氧链终止法，用转化子测定扩增片段βN的所述末端区的核苷酸序列。根据所述N末端区的序列，设计引物3和4(SEQ ID NO：10和11)。根据除所述N末端区之外的末端区的序列，设计引物5和6(SEQ ID NO：12和13)。用DNA合成仪合成所述引物，然后纯化。运用这些引物和LA PCR体外克隆试剂盒(TakaraShuzo)，以相似的方式克隆βN上游和下游的DNA片段。在这种情况下，引物于55℃退火1分钟。

对于上游区，用引物3和4获得约0.6kb的DNA片段，将其命名为βUN。对于βN下游的区，用引物5和6获得约1.3kb的DNA片段，将其命名为βC。将βUN和βC两者与载体pT7Blue(Novagen)连接。依照双脱氧链终止法，测定核苷酸序列。分析DNA片段βN、βUN和βC的核苷酸序列，并进行序列比对。结果发现一个编码由438个氨基酸构成的蛋白的ORF。

所述ORF的核苷酸序列和由所述ORF的核苷酸序列所编码的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：20和22。发现在βUN中，存在一个氨基酸序列p1的核苷酸序列、一个编码氨基酸序列P1上游的20个氨基酸的核苷酸序列和更上游区中的一个SD样序列。

在实施例3中测定的N末端氨基酸序列P1对应于SEQ ID NO：22中第21-33号氨基酸的序列。在实施例3中测定的部分氨基酸序列PI3(SEQ ID NO：3)和PI4(SEQ ID NO：4)分别与SEQ ID NO：22中的第265-272号氨基酸和第367-376号氨基酸的序列匹配。

实施例9

琼脂糖酶II基因的克隆

根据如实施例3中所述测定的琼脂糖酶II的N末端氨基酸序列P2(SEQ ID NO：2)和PII6(SEQ ID NO：6)，设计混合引物7和8(SEQ IDNO：14和15)。它们与相互不同的链杂交。用DNA合成仪合成所述混合引物，并进行纯化。

具体地说，SEQ ID NO：14所示的混合引物7对应于氨基酸序列P2的第1-8号氨基酸，SEQ ID NO：15所示的混合引物8对应于编码氨基酸序列PII6中第2-10号氨基酸的DNA的互补链。

用这些引物和LA PCR体外克隆试剂盒(Takara Shuzo)进行所述琼脂糖酶II基因的克隆。

如下进行初次PCR。将在实施例7中制备的10ng NAB2-1-1染色体DNA置于0.5ml PCR用试管中。向其中加入5μl 10×LA PCR缓冲液、8μl dNTP混合物、混合引物7和8各40pmol、0.5μl TaKaRa LATaq和无菌水至50μl。在溶液上铺上50μl矿物油之后，用自动基因扩增仪器热循环仪(Takara Shuzo)使所述试管进行反应。于94℃变性2分钟之后，进行30个循环的PCR。每个循环由94℃变性1分钟、引物于50℃退火2分钟和于72℃合成反应2分钟组成。除去矿物油上层，用5μl反应混合物在1.0％琼脂糖凝胶上电泳，然后所述DNA用溴化乙锭染色，以证实扩增产物。结果，观察到约600bp的DNA片段。所述DNA片段被命名为αN。

将从琼脂糖凝胶上切取的扩增片段αN与载体pT7B1ue连接，用来转化大肠杆菌JM109。依照双脱氧链终止法，用转化子测定扩增片段αN的所述末端区的核苷酸序列。根据N末端区的序列，设计引物9和10(SEQ ID NO：16和17)。根据除所述N末端区之外的末端区的序列，设计引物11和12(SEQ ID NO：18和19)。用DNA合成仪合成所述引物，然后纯化。运用这些引物和LA PCR体外克隆试剂盒(TakaraShuzo)，以相似的方式克隆αN上游和下游的DNA片段。

在这种情况下，如下进行PCR。在实施例7中制备的NAB2-1-1染色体DNA用限制性酶BamHI完全消化。用DNA连接试剂盒(TakaraShuzo)，将BamHI连接物连接到所述经消化的DNA的末端。将其一部分置于0.5ml PCR用试管中。向其中加入5μl 10×LA PCR缓冲液、8μl dNTP混合物、1μl混合引物9、1μl引物C1、0.5μl TaKaRa LA Taq和无菌水至50μl。在溶液上铺上50μl矿物油之后，用自动基因扩增仪器热循环仪(Takara Shuzo)使所述试管进行反应。于94℃变性2分钟之后，进行30个循环的PCR。每个循环由94℃变性1分钟、引物于50℃退火2分钟和于72℃合成反应3分钟组成。

接着，用所述反应混合物作为模板进行二次PCR。除用通过初次PCR获得的1μl反应混合物作为模板以及使用引物10和引物C2组合之外，在与初次PCR所用条件相同的条件下进行PCR。除去矿物油上层，用5μl反应混合物在1.0％琼脂糖凝胶上电泳，然后所述DNA用溴化乙锭染色，以证实扩增产物。结果，观察到约500bp的DNA片段。所述DNA片段被命名为αUN。

同样，用引物11和12获得αN下游的约2 kb的DNA片段，将其命名为αC。将αUN和αC两者与载体pT7Blue(Novagen)连接。依照双脱氧链终止法，测定核苷酸序列。分析DNA片段αN、αUN和αC的核苷酸序列，并进行序列比对。结果发现一个编码由1089个氨基酸构成的蛋白的ORF。

所述ORF的核苷酸序列和由所述ORF的核苷酸序列所编码的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：21和23。发现在αUN中，存在一个氨基酸序列P2的核苷酸序列、一个编码氨基酸序列P2上游的具有信号肽样序列的26个氨基酸的核苷酸序列和更上游区中的一个SD样序列。

所述氨基酸序列P2对应于SEQ ID NO：23中第27-36号氨基酸的序列。在实施例3中测定的部分氨基酸序列PII5(SEQ ID NO：5)、PII6(SEQ ID NO：6)和PII7(SEQ ID NO：7)分别与SEQ ID NO：23中的第129-138号氨基酸、第640-649号氨基酸和第738-747号氨基酸的序列匹配。

此外，发现三个推定的钙结合区(SEQ ID NO：23中的171-184、271-283和987-999)。

实施例10

琼脂糖酶I表达用质粒的构建

引物13(SEQ ID NO：24)是一种合成DNA，它在第12-17号核苷酸处具有一个限制性酶EcoRI的识别序列，在第19-38号核苷酸处具有一个对应于SEQ ID NO：22的氨基酸序列中第21-27号氨基酸的核苷酸序列。用引物13和引物14(SEQ ID NO：25)如下进行PCR，引物14在第11-16号核苷酸处具有一个限制性酶PstI的识别序列，并且与染色体上的琼脂糖酶I读框下游约300bp的部分互补的链杂交。向0.5mlPCR用试管中，加入引物13和14各10pmol、10ng作为模板的得自NAB2-1-1的染色体DNA、5μl 10×ExTaq缓冲液、8μl dNTP混合物、0.5μl TaKaRa ExTaq和无菌水至50μl。将试管置于自动基因扩增仪器热循环仪(Takara Shuzo)中。于94℃变性2分钟之后，进行25个循环的PCR。每个循环由94℃1分钟、55℃2分钟和72℃2分钟组成。通过乙醇沉淀将PCR产物浓缩和脱盐，用限制性酶EcoRI(Takara Shuzo)和PstI(Takara Shuzo)双重消化，然后在1.0％琼脂糖凝胶上进行电泳。对EcoRI-PstI消化物进行提取和纯化。将经纯化的产物与已经用相同酶消化的pUC18(Takara Shuzo)混合，用DNA连接试剂盒(Takara Shuzo)进行连接。用10μl连接混合物转化大肠杆菌JM109。让转化子在含有浓度为1.5％(w/v)的琼脂和浓度为50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基上生长。从白色菌落制备质粒，进行DNA测序。选择正确插入所述PCR产物的质粒，将其命名为pNB101。pNB101是一种编码琼脂糖酶I的氨基酸序列(SEQ ID NO：22)中第21-437号氨基酸的氨基酸序列的质粒。用质粒pNB101转化的大肠杆菌被命名为大肠杆菌JM109/pNB101，于2001年1月10日(原始保藏日)保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(International PatentOrganism Depositary，National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566，Japan)，保藏号为FERM BP-7854。

将导入了pNB101的转化子接种到含有50μg/ml氨苄青霉素的2.5ml LB肉汤中，于37℃培养过夜。将一部分培养物接种到2.5ml相同的新鲜培养基中，于37℃培养直至其达到指数生长期。此时，向其中加入IPTG，终浓度为1.0mM。再于20℃继续培养2小时，以诱导所述目标蛋白的表达。然后离心收集细胞，将其重悬于150μl细胞破碎溶液(含有10mM氯化钠的20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.2))中。通过超声处理破碎细胞。通过离心将作为上清液的提取物和沉淀相互分离，用作用琼脂糖作为底物测量β-琼脂糖酶活性用的样品。然后，观察作为上清液的提取物的活性。在100ml所述培养物中所含有的活性为野生型菌株NAB2-1-1的活性的约25倍。

实施例11

利用pET16b的琼脂糖酶I的表达系统

用引物15(SEQ ID NO：26)和引物16(SEQ ID NO：27)，用NAB2-1-1染色体DNA作为模板，在实施例10中所述的条件下进行PCR。引物15是一种在第20-39号核苷酸处具有一个对应于琼脂糖酶I氨基酸序列(SEQ ID NO：22)中第21-27号氨基酸的核苷酸序列以及在第14-19号核苷酸处具有一个限制性酶NdeI的识别序列的引物。引物16是一种在第12-17号核苷酸处具有一个限制性酶XhoI的识别序列并且与染色体上琼脂糖酶I读框下游约300bp的一个部分互补的链杂交的引物。通过乙醇沉淀浓缩所述扩增片段，用NdeI(Takara Shuzo)和XhoI(Takara Shuzo)消化，进行提取和纯化。将所述产物与已经用相同的酶消化的pET16b(Takara Shuzo)连接。所得的质粒被命名为pNB201。pNB201是一种编码琼脂糖酶I氨基酸序列(SEQ ID NO：22)中第21-437号氨基酸的氨基酸序列的质粒。

用pNB201转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，用所得的转化子，如以上实施例10中所述测定β-琼脂糖酶活性。然后，观察所述提取物的活性。在100ml所述培养物中所含有的活性约NAB2-1-1的活性的约50倍。

实施例12

琼脂糖酶II表达用质粒的构建

引物17(SEQ ID NO：28)是一种合成DNA，它在第10-15号核苷酸处具有一个限制性酶EcoRI的识别序列，在第17-37号核苷酸处具有一个对应于琼脂糖酶II氨基酸序列(SEQ ID NO：23)中第27-33号氨基酸的核苷酸序列。用引物17和引物18(SEQ ID NO：29)如下进行PCR，引物18在第11-16号核苷酸处具有一个限制性酶BamHI的识别序列，并且与染色体上的琼脂糖酶II读框下游约250bp的部分杂交。在采用ExTaq的反应系统(Takara Shuzo)中，使用引物17和18各10pmol以及10ng得自野生型菌株NAB2-1-1的染色体DNA作为模板进行PCR。于94℃变性2分钟之后，进行30个循环的PCR。每个循环由94℃1分钟、50℃2分钟和72℃3分钟组成。通过乙醇沉淀浓缩PCR产物，用限制性酶EcoRI(Takara Shuzo)和BamHI(Takara Shuzo)双重消化，然后在1.0％琼脂糖凝胶上进行电泳。对EcoRI-BamHI消化物进行提取和纯化。如实施例10中所述，用pUC18构建杂种质粒，用其转化大肠杆菌JM109。所述杂种质粒被命名为pNA101。pNB101是一种编码琼脂糖酶II的氨基酸序列(SEQ ID NO：23)中第27-1089号氨基酸的氨基酸序列的质粒。

用质粒pNA101转化的大肠杆菌被命名为大肠杆菌JM109/pNA101，于2001年1月10日(原始保藏日)保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(International PatentOrganism Depositary，National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566，Japan)，保藏号为FERM BP-7853。

除了在细胞破碎产物中包含10mM氯化钙之外，如实施例10中所述，对导入了pNA101的转化子测定α-琼脂糖酶活性。观察所述提取物的活性。在100ml所述培养物中所含有的活性为野生型菌株NAB2-1-1的活性的约15倍。

实施例13

具有缺失的琼脂糖酶II蛋白的活性

如下所述，通过基因工程制备经修饰的蛋白。测定所述经修饰的蛋白的α-琼脂糖酶活性。

引物19(SEQ ID NO：30)是一种在第19-40号核苷酸处具有一个对应于琼脂糖酶II氨基酸序列(SEQ ID NO：23)中第181-188号氨基酸的核苷酸序列且在第12-17号核苷酸处具有一个限制性酶EcoRI的识别序列的引物。

用引物19和引物18(SEQ ID NO：29)以及用NAB2-1-1的染色体DNA作为模板进行PCR。将产物与pUC18连接，如实施例12中所述转化大肠杆菌JM109。通过证实连接位点的DNA序列而获得的杂种质粒被命名为pNA201d。从pNA201d表达的蛋白是其中琼脂糖酶II氨基酸序列(SEQ ID NO：23)中直至第180号氨基酸的部分缺失的蛋白。换句话说，pNA201d是一种编码琼脂糖酶II的氨基酸序列(SEQ IDNO：23)中第181-1089号氨基酸的氨基酸序列的质粒。在用IPTG诱导表达之后，如实施例10中所述进行活性的测量，只是在所述细胞破碎产物中包含10mM氯化钙。观察所述提取物的α-琼脂糖酶活性。在100ml所述培养物中所含有的活性为NAB2-1-1的活性的约2倍。

引物20(SEQ ID NO：31)在第19-40号核苷酸处具有一个对应于琼脂糖酶II氨基酸序列(SEQ ID NO：23)中第318-325号氨基酸的核苷酸序列，且在第12-17号核苷酸处具有一个限制性酶EcoRI的识别序列。用引物20和引物18(SEQ ID NO：29)以及用NAB2-1-1的染色体DNA作为模板进行PCR，用pUC18构建一个杂种质粒-pNA301d。从导入了pNA301d的大肠杆菌JM109表达了一种其中琼脂糖酶II氨基酸序列(SEQ ID NO：23)中直至第317号氨基酸的肽缺失的蛋白。换句话说，pNA301d是一种编码琼脂糖酶II的氨基酸序列(SEQ ID NO：23)中第318-1089号氨基酸的氨基酸序列的质粒。如实施例10中所述进行活性的测量，只是在所述细胞破碎产物中包含10mM氯化钙。观察所述提取物的α-琼脂糖酶活性。在100ml所述培养物中所含有的活性为NAB2-1-1的活性的约15倍。此外，得自导入了pNA301d的转化子的提取物，对无钙缓冲液(含有10mM氯化钠和1mM EDTA(pH 7.2)的20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.2))透析，然后与在含有10mM氯化钠和1mM EDTA(pH 7.2)的20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.2)含有0.2％浓度的琼脂糖的溶液反应。结果观察到与用含钙缓冲液所观察到的活性相似的消化活性。

实施例14

与AgarACE酶(Promega)的比较

[最适温度]

将本发明的琼脂糖酶I的酶学特性与Promega出售的海洋黄杆菌来源的β-琼脂糖酶-AgarACE酶的所述特性进行比较。

向通过在20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.3)中加热溶解的40μl 1.0％(w/v)NuSieve GTG Agarose(FMC)中，加入10μl琼脂糖酶I或AgarACE酶(Promega；依照所附的数据单，相当于0.29单位)。让混合物于45℃、50℃、55℃、60℃或65℃反应10分钟。依照实施例1中所述的方法，预先测量两种酶的活性。然后，加入所述酶，使得在各个反应中包括相同的酶活性。反应后，如实施例1中所述计算酶活性。将最高酶活性定义为100％，以相对值表示的结果示于表3中。由所述结果可见，琼脂糖酶I的最适温度是50-65℃，而AgarACE酶的最适温度是45-50℃。

表3

[热稳定性]

将10μl琼脂糖酶I或AgarACE酶(依照所附的数据单，相当于0.29单位)于60℃或65℃保温给定的时间，然后加入到通过在20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.3)中加热溶解的40μl 1.0％(w/v)NuSieve GTGAgarose(FMC)中。如上所述，加入所述酶，使得在各个反应中包括相同的酶活性。让混合物于55℃反应10分钟(就琼脂糖酶I而言)或于45℃反应10分钟(就AgarACE酶而言)。如实施例1中所述计算酶活性。将未经加热而观测到的所述活性定义为100％，以相对值表示的结果示于表4中。由所述结果可见，几乎100％的琼脂糖酶I活性在于65℃保温10分钟后得以保留，而AgarACE酶在于65℃保温10分钟后完全被失活。

表4

实施例15

钙引起的酶热稳定性的改变

将用pNA101(实施例11)或pNA301d(实施例13)转化的大肠杆菌JM109接种到含有50μg/ml氨苄青霉素的2.5ml LB肉汤中，于37℃培养过夜。将一部分培养物接种到100ml相同培养基中，于37℃培养直至其达到指数生长期。此时，向其中加入IPTG，终浓度为1.0mM。再于20℃继续培养2小时，以诱导所述目标蛋白的表达。然后离心收集细胞，将其悬浮于5ml细胞破碎溶液(含有10mM氯化钠和1mM氯化钙的20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.2))中。通过超声处理破碎细胞。通过离心收集上清液。测量上清液中的α-琼脂糖酶活性。用细胞破碎溶液稀释上清液，使得在单位体积的每种样品中含有相同的酶活性。将如此获得的每种酶的提取物对含钙的缓冲液A(含有10mM氯化钠和10mM氯化钙的20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.2))或者不含钙的缓冲液B(含有10mM氯化钠和1mM EDTA(pH 7.2)的20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.2))透析过夜。将20μl所述酶溶液于55℃或50℃保温10分钟，然后与180μl在含10mM氯化钠的20 mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.2)中含有0.2％浓度的琼脂糖的溶液反应。依照实施例1中所述的方法，测定残留的α-琼脂糖酶活性。结果示于表5中。

用得自NAB2-1-1的天然琼脂糖酶II作为对照。

表5

*每种酶在缓冲液A中于50℃处理后的残留活性被定义为100。

实施例16

具有缺失的琼脂糖酶II蛋白的活性

引物21(SEQ ID NO：34)在第19-40号核苷酸处具有一个对应于琼脂糖酶II氨基酸序列(SEQ ID NO：23)中第290-297号氨基酸的核苷酸序列，且在第12-17号核苷酸处具有一个限制性酶EcoRI的识别序列。

用引物21和引物18(SEQ ID NO：29)以及用NAB2-1-1的染色体DNA作为模板进行PCR，将产物与pUC18连接，如实施例12中所述转化大肠杆菌JM109。通过证实连接位点的DNA序列而获得的杂种质粒被命名为pNA401d。从pNA401d表达的蛋白是其中琼脂糖酶II氨基酸序列(SEQ ID NO：23)中直至第289号氨基酸的部分缺失的蛋白。换句话说，pNA401d是一种编码琼脂糖酶II的氨基酸序列(SEQ IDNO：23)中第290-1089号氨基酸的氨基酸序列的质粒。将用实施例13中获得的pNA301d或如上所述获得的pNA401d转化的大肠杆菌JM109，接种到含有50μg/ml氨苄青霉素的2.5ml LB肉汤中，于37℃培养过夜。将一部分培养物接种到100ml相同培养基中，于3-7℃培养直至其达到指数生长期。此时，向其中加入IPTG，终浓度为1.0mM。再于20℃继续培养2小时，以诱导所述目标蛋白的表达。然后离心收集细胞，将其悬浮于5ml细胞破碎溶液(含有10mM氯化钠和1mM氯化钙的20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.2))中。通过超声处理破碎细胞。通过离心收集上清液。测量上清液中的α-琼脂糖酶活性。用细胞破碎溶液稀释上清液，使得在单位体积的每种样品中含有相同的酶活性。将20μl所述酶溶液于55℃或60℃保温10分钟，然后与180μl在含10mM氯化钠的20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.2)中含有0.2％浓度的琼脂糖的溶液反应。依照实施例1中所述的方法，测定残留的α-琼脂糖酶活性。结果示于表6中。这些结果表明，pNA401d的产物的热稳定性等于或高于pNA301d的热稳定性。

用得自NAB2-1-1的天然琼脂糖酶II作为对照。

表6

*每种酶于50℃处理后的残留活性被定义为100。

此外，在用IPTG于37℃诱导过夜后，通过离心收集上清液，然后如上所述通过超声处理破碎细胞。定量测定上清液的蛋白含量。对上清液进行SDS-PAGE，使得蛋白的上样量相同。另外，将收集上清液时获得的沉淀悬浮于细胞破碎溶液中，以相似的方式进行SDS-PAGE。结果发现，经过诱导的用pNA401d获得的上清液中目标蛋白的量高于用天然型或pNA301d获得的上清液中的目标蛋白的量。因此，表明通过诱导从用pNA401d转化的大肠杆菌JM109表达的突变型α-琼脂糖酶容易被溶解。

工业应用性

本发明提供了新型琼脂糖酶。本发明的琼脂糖酶的最适温度高于常规琼脂糖酶的最适温度，并且所述琼脂糖酶的热稳定性非常好。因此，它可以用来在高温下进行反应。因而，本发明的琼脂糖酶非常有效，因为它能够使反应在存在高浓度琼脂糖时在不固化的情况下反应。

利用本发明的琼脂糖酶，可以有效地从琼脂糖直接有效地生产具有低聚合度、在其还原末端具有3，6-脱水-L-半乳糖的琼脂寡糖(例如琼脂二糖和琼脂四糖)或者在其非还原末端具有3，6-脱水-L-半乳糖的新琼脂寡糖(例如新琼脂二糖和新琼脂四糖)。

利用本发明的琼脂糖酶，可以从琼脂糖凝胶中有效地提取核酸等。

用本发明的琼脂糖酶生产的琼脂寡糖具有生理活性，例如细胞凋亡诱导活性、制癌活性、各种抗氧化活性、免疫调节活性和抗变态反应活性。因此，它们可用于药用组合物、食品和饮料领域。

本发明首次公开了所述琼脂糖酶的氨基酸序列和核苷酸序列。因此，有可能提供具有琼脂糖酶活性的多肽的编码基因。本发明也提供一种用于利用所述基因通过基因工程生产具有琼脂糖酶活性的多肽的工业上有利的方法。

此外，在利用所述基因通过基因工程的所述生产方法中，并不需要向培养基中加入琼脂糖来诱导所述琼脂糖酶的产生。因此，认为在培养时节省了工作量，并且容易纯化所述酶。

另外，基于本发明首次提供所述琼脂糖酶基因这一事实，本发明基于所述基因的信息，提供了由所述基因编码的重组多肽、与所述多肽或其片段特异性结合的抗体、以及与所述琼脂糖酶特异性杂交的探针或引物。

序列表的独立文本

SEQ ID NO：1：琼脂糖酶I的N末端氨基酸序列。

SEQ ID NO：2：琼脂糖酶II的N末端氨基酸序列。

SEQ ID NO：3：琼脂糖酶I的部分氨基酸序列。

SEQ ID NO：4：琼脂糖酶I的部分氨基酸序列。

SEQ ID NO：5：琼脂糖酶II的部分氨基酸序列。

SEQ ID NO：6：琼脂糖酶II的部分氨基酸序列。

SEQ ID NO：7：琼脂糖酶II的部分氨基酸序列。

SEQ ID NO：8：PCR引物1

SEQ ID NO：9：PCR引物2

SEQ ID NO：10：PCR引物3

SEQ ID NO：11：PCR引物4

SEQ ID NO：12：PCR引物5

SEQ ID NO：13：PCR引物6

SEQ ID NO：14：PCR引物7

SEQ ID NO：15：PCR引物8

SEQ ID NO：16：PCR引物9

SEQ ID NO：17：PCR引物10

SEQ ID NO：18：PCR引物11

SEQ ID NO：19：PCR引物12

SEQ ID NO：20：琼脂糖酶I中ORF的核苷酸序列。

SEQ ID NO：21：琼脂糖酶II中ORF的核苷酸序列。

SEQ ID NO：22：琼脂糖酶I的氨基酸序列。

SEQ ID NO：23：琼脂糖酶II的氨基酸序列。

SEQ ID NO：24：PCR引物13

SEQ ID NO：25：PCR引物14

SEQ ID NO：26：PCR引物15

SEQ ID NO：27：PCR引物16

SEQ ID NO：28：PCR引物17

SEQ ID NO：29：PCR引物18

SEQ ID NO：30：PCR引物19

SEQ ID NO：31：PCR引物20

SEQ ID NO：32：设计的寡核苷酸引物，用于从16S核糖体扩增

DNA片段

SEQ ID NO：33：设计的寡核苷酸引物，用于从16S核糖体扩增

DNA片段

SEQ ID NO：34：PCR引物21

<110>宝酒造株式会社(Takara Shuzo Co.，Ltd.)

<120>琼脂糖酶及其基因

<130>663033

<150>JP 2001-052315

<151>2001-02-27

<150>JP 2001-325796

<151>2001-10-24

<160>34

<210>1

<211>13

<212>PRT

<213>未知

<220>

<223>琼脂糖酶I的N末端氨基酸序列

<400>1

Ala Asp Xaa Asp Gly Val Pro Ile Pro Ala Pro Ala Gly

1 5 10

<210>2

<211>10

<212>PRT

<213>未知

<220>

<223>琼脂糖酶II的N末端氨基酸序列

<400>2

Glu Thr Ile Val Leu Gln Ala Glu Ser Phe

1 5 10

<210>3

<211>8

<212>PRT

<213>未知

<220>

<223>琼脂糖酶I的部分氨基酸序列

<400>3

Pro Thr Pro Ala Glu Leu Ala Asp

1 5

<210>4

<211>10

<212>PRT

<213>未知

<220>

<223>琼脂糖酶I的部分氨基酸序列

<400>4

Ala Thr Ser Asn Gly Ala Asn Ile Val Gln

1 5 10

<210>5

<211>10

<212>PRT

<213>未知

<220>

<223>琼脂糖酶II的部分氨基酸序列

<400>5

Pro Ser His Ser Val Thr Leu Pro Ala Gly

1 5 10

<210>6

<211>10

<212>PRT

<213>未知

<220>

<223>琼脂糖酶II的部分氨基酸序列

<400>6

Leu Met Phe Asp Thr Gln Thr Asn Ser Thr

1 5 10

<210>7

<211>10

<212>PRT

<213>未知

<220>

<223>琼脂糖酶II的部分氨基酸序列

<400>7

Phe Gly Glu Val Leu Asp Tyr Ile Arg Gln

1 5 10

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物1

<400>8

gayggngtnc cnathccngc 20

<210>9

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物2

<400>9

gayggngtnc cnathccngc nccngcngg 29

<210>10

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物3

<400>10

gcattgatat aactatcgtt ccaacg 26

<210>11

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物4

<400>11

cgtctgatat ggattgcaat tgcc 24

<210>12

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物5

<400>12

gccgctgcac attattattg atatgg 26

<210>13

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物6

<400>13

caacaccagc tgagcttgca gaccc 25

<210>14

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物7

<400>14

garacnathg tnytncargc nga 23

<210>15

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物8

<400>15

gtnswrttng tytgngtrtc raacat 26

<210>16

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物9

<400>16

ctcaatgtca tattcccccc cttcagcg 28

<210>17

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物10

<400>17

cgcgttttgt ccatttacgc tgtatatcg 29

<210>18

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物11

<400>18

acccgcagcc gcattatgtg caaacac 27

<210>19

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物12

<400>19

gcatgacctt tatgggttac ttgtcgc 27

<210>20

<211>1314

<212>DNA

<213>未知

<220>

<223>琼脂糖酶I基因中ORF的核苷酸序列

<400>20

atgcttcaga aaatcacact atgcgcgtct ctagttttaa ctagtacaac tgtttttgcc 60

gcagattggg atggcgtacc aatcccagca ccagcgggtc aaaataaaac ttggcaattg 120

caatccatat cagacgactt taactacaca gcttcagcaa ataacaaacc aagcgctttt 180

acaagccgtt ggaacgatag ttatatcaat gcatggaaag ggcctggcga tacagaattt 240

agctcaggtc actcgtacac aaattcaggt aaactggctt tgcaagcagc tgaaaaacct 300

ggcacagata aggtttatgc aggtattatt tcttcaaaac aaacattcac ttatccgttg 360

tatatagaag cacgcgcaaa atcgaccaat aatacgatgg ccaatgcagt ttggatgtta 420

agtgccgatt caacgcaaga attagatgca atggaagctt acggcagtga tagaccgggc 480

caagaatggt tcgatcgccg tatgcatgta agccatcacg tatttattcg cgaaccattc 540

caagactatc aacccaaaga tgcgggttct tggatatata atgaacaagc gccttggcgc 600

gttgcctatc ataactatgg gatgcattgg aaagatcctt ggaatgttga ttactacata 660

gatggtgtgc ttgttagaag tgtttccggt caacaaatga tcgatccaca caactacacc 720

aacggtacgg gtgtaaacaa gccgctgcac attattattg atatggaaca ccaagactgg 780

cgtgatgtta aaccaacacc agctgagctt gcagaccctg cgagaagtat tttttatgta 840

gattggatcc gagtatacaa gccaactgat tcagcagctt cagcacccac accccctaca 900

ggtgcaacat ctcttaaggc tagacatagc aacaaatgct tagatttatc tgctggtaat 960

tctgcgaatg gtgcaaacat gcaacaatgg aattgcaacg cgacgaacac aaaccaagat 1020

ataacctttg tcgccaaagg tgctggttat tacgaaatga aaaccaaaca caataaatgt 1080

ttagatgttg cgggtaaagc aaccagcaat ggcgcgaata tagtgcagtg gaattgttac 1140

aacgggacta accagcaatt taaattacta gacaaaggca atggttggtt ccaactacaa 1200

gcaaaacata gtggcaagtg tttagaaatt gcaaattctg caaccaccaa tggtgccaac 1260

gtgcaacagt gggcgtgtgg aaatagcaac aatcagcagt ggaaattcca gtaa 1314

<210>21

<211>3270

<212>DNA

<213>未知

<220>

<223>琼脂糖酶II基因中ORF的核苷酸序列

<400>21

atgtttaaaa ctaaacgttc tctgctgagc tctagtattg cgctttcact ggctttactc 60

ggcactaaag cgcatgcaga gactatagtc ttgcaagctg aatcgtttga taactccggc 120

ggtacgtatg atgacggcca acccaaccct gtcacgatat acagcgtaaa tggacaaaac 180

gcgattaatt ttgttaacgc gggtgatttt gtcgatttta atattaacgc tgaagggggg 240

gaatatgaca ttgagtattt agtcggcaca agtgtccaat caggtcctag tattgaagtg 300

ctcgttaata ctaatggtgc atgggaaagc caaggcacag tcgctgtacc gttaaccagt 360

tgggacgatt tccagcctct caaacccagc cattccgtaa ctttgccagc aggtgcttca 420

accattcgtt tgcacgcaat tggttcgact tggcaatgga acatggagtc tttttcttta 480

acacaagttg taccgcttga gccagaaaca cccgttgatg tagacgatat tgttattaac 540

ctagaaaact ttatctttac agacaaagaa ggagcagcta tttcaggtga taccatcgtc 600

ggttttggtg taacaaactc aggtataaat tttaatacgg tcggcgatta tgccgactac 680

acagtaaact ttactgaagc aggtacatac aacgcgacac tggctgctgg ttcacccatg 720

acaggtcaaa tcggtgcaca aattatcatg gataattcgg ttgccgcgtc atcgttactt 780

gcatctacag gtggctggga taattatgtc gactttgatc tcagtggcga cattgttata 840

ccaacgcccg gtacttacac tgtacgatta caaagttatg gtagcgcgaa ttggcagtgg 900

aacgcagata cactaacgct tagttatata tctggagaaa ccggcgacgg caatccaagt 960

ccaccacaag aaggtgattt gattgttgaa ttagaagatt tcgttaatac aggtacaacc 1020

ggccgcgttg gaggcgatag cgttgaaggc tttggcgcaa cagcaactgg cgtgaactgg 1080

gtgaccaatg gtgattatgg tgactacaac ataacctttg cagagcctgg tacctatcgt 1140

gcctttttta cctattcagc cgccagtgca ggtagttacg gcgctcgtgt agatgtaaat 1200

ggtgaacccg tagcatgggg ctattttgct gaaacaggca gttgggatgt tgcgtctgaa 1260

gttgagcttt atggtggata ctttgttatt gaccaagcag gccaagcgaa tttgcgcgta 1320

gaagcaattg gtggatcaga ttggcagtgg ggcggtgata aactgcggat aacccgtgta 1380

ggtgatgttt catatgtccc tgaacgtcac tataatccga acgatcacta cgtggaagaa 1440

gttgaaggac cacaaacaca aattacctat ctaaaaccac caattgacat tcctaccaat 1500

aaaaaagttc taaaatcaga cgtttggtat acgtatccac aaaaccggga actggaaggt 1560

tttgatgatt ttggcgcaac tggcgcattc tggggacatc cgccagagca tgatttttat 1620

gaagaaaccg ttattatgga ttgggcagtc aatgtcgttg atacgttcca aagtgaaggt 1680

tttgagtata ctgctcgcgg cgaatttgac tggggttatg gttggttcac cgagtacgtg 1740

acaaacccgc agccgcatta tgtgcaaaca cttgacgatc gcaatgtgcg catgaccttt 1800

atgggttact tgtcgcacaa cggttataat aacaactggt taagtaatca tagtccagca 1860

tttgtacctt tcatgaaatc acaggttgat caaatattga aagcgtatcc ggacaagctg 1920

atgtttgata cacaaaccaa ctcaacccgt tcaaccgaca tgcgtacctt tggtggtgac 1980

ttctcgccat atgccatgga aaacttccgc atttggttag ataaaaaata cagtagtaac 2040

gagttggcca atatgggtat taataatatt caaacgtttg attacaaaca gcacttgtta 2100

aatgccggtg tgacacatca atcattcatg aatgcggcag atacattatc tggaaacgta 2160

ccattacttg aagatttcat ttattttaat cgtgatgtat ggaaccaaaa atttggtgaa 2220

gtattagatt atattcgcca gcaacgtcca gacatagaaa ttggtgcgag cacacatttg 2280

tttgaatctc gtggttatat atttaacgag aatatcacct tcttatcagg tgagctcaac 2340

ttaggtgcga gaaccactat ctctgaacta ccaacgaata tccttgtaca cttaaaaggg 2400

gcgcaggcag tagataaaac gttagcatac ttcccgtatc cttgggagtt tgacgaactt 2460

cgtttgcaag acgcaccgcg ttttggccgt ggttgggtcg cgcaagctta tgcttacggt 2520

ggtttattct cgattccggc taatgtttgg gttggtggtg aagtttggac ttggtctccg 2580

ggcgctgata actatcgtga tatttaccag tttgtacgag cgcaagcaga cttgttagac 2640

ggttatacct catattcaaa agtaggtctt gtgcacgcga tgttctcatc gatgaaagcg 2700

ggctttattg atgggggtaa ccaaattcaa tcaagcgtta aattactgac tgaagataat 2760

attaactttg atttattggt gtttggtgat gcgggttatc ctgttgtccc acgagctgaa 2820

gactttgata aattcgaaca tatcttcttc gatggtgatc aacaatactt aaccgctgaa 2880

caacaagcta tattagatgc acaaggtagc aaagtaagac acattggcca gcgcggtact 2940

ttaagcggta tcgaaataga tgtcagtatc aatggtagtg tttctaacga aacagtatct 3000

gcggtatctc gcattcatga aaccaatgca aatgcgccat atgttgtgca cttggttaat 3060

cgtccatttg caggcggtgt aacgccaaca ttaaatggcg tagaagtggc aattccgcaa 3120

ggttatttcc cggatacagt aacatcggcg acattacact taccggatgg taccagtacc 3180

aacttaagtg tttcgacaaa cgccgaaggt gatgctgtcg ttacggtaaa taacttagaa 3240

gtttggggta ttttagaatt agcgcactaa 3270

<210>22

<211>437

<212>PRT

<213>未知

<220>

<223>琼脂糖酶I的氨基酸序列

<400>22

Met Leu Gln Lys Ile Thr Leu Cys Ala Ser Leu Val Leu Thr Ser

1 5 10 15

Thr Thr Val Phe Ala Ala Asp Trp Asp Gly Val Pro Ile Pro Ala

20 25 30

Pro Ala Gly Gln Asn Lys Thr Trp Gln Leu Gln Ser Ile Ser Asp

35 40 45

Asp Phe Asn Tyr Thr Ala Ser Ala Asn Asn Lys Pro Ser Ala Phe

50 55 60

Thr Ser Arg Trp Asn Asp Ser Tyr Ile Asn Ala Trp Lys Gly Pro

65 70 75

Gly Asp Thr Glu Phe Ser Ser Gly His Ser Tyr Thr Asn Ser Gly

80 85 90

Lys Leu Ala Leu Gln Ala Ala Glu Lys Pro Gly Thr Asp Lys Val

95 100 105

Tyr Ala Gly Ile Ile Ser Ser Lys Gln Thr Phe Thr Tyr Pro Leu

110 115 120

Tyr Ile Glu Ala Arg Ala Lys Ser Thr Asn Asn Thr Met Ala Asn

125 130 135

Ala Val Trp Met Leu Ser Ala Asp Ser Thr Gln Glu Leu Asp Ala

140 145 150

Met Glu Ala Tyr Gly Ser Asp Arg Pro Gly Gln Glu Trp Phe Asp

155 160 165

Arg Arg Met His Val Ser His His Val Phe Ile Arg Glu Pro Phe

170 175 180

Gln Asp Tyr Gln Pro Lys Asp Ala Gly Ser Trp Ile Tyr Asn Glu

185 190 195

Gln Ala Pro Trp Arg Val Ala Tyr His Asn Tyr Gly Met His Trp

200 205 210

Lys Asp Pro Trp Asn Val Asp Tyr Tyr Ile Asp Gly Val Leu Val

215 220 225

Arg Ser Val Ser Gly Gln Gln Met Ile Asp Pro His Asn Tyr Thr

230 235 240

Asn Gly Thr Gly Val Asn Lys Pro Leu His Ile Ile Ile Asp Met

245 250 255

Glu His Gln Asp Trp Arg Asp Val Lys Pro Thr Pro Ala Glu Leu

260 265 270

Ala Asp Pro Ala Arg Ser Ile Phe Tyr Val Asp Trp Ile Arg Val

275 280 285

Tyr Lys Pro Thr Asp Ser Ala Ala Ser Ala Pro Thr Pro Pro Thr

290 295 300

Gly Ala Thr Ser Leu Lys Ala Arg His Ser Asn Lys Cys Leu Asp

305 310 315

Leu Ser Ala Gly Asn Ser Ala Asn Gly Ala Asn Met Gln Gln Trp

320 325 330

Asn Cys Asn Ala Thr Asn Thr Asn Gln Asp Ile Thr Phe Val Ala

335 340 345

Lys Gly Ala Gly Tyr Tyr Glu Met Lys Thr Lys His Asn Lys Cys

350 355 360

Leu Asp Val Ala Gly Lys Ala Thr Ser Asn Gly Ala Asn Ile Val

365 370 375

Gln Trp Asn Cys Tyr Asn Gly Thr Asn Gln Gln Phe Lys Leu Leu

380 385 390

Asp Lys Gly Asn Gly Trp Phe Gln Leu Gln Ala Lys His Ser Gly

395 400 405

Lys Cys Leu Glu Ile Ala Asn Ser Ala Thr Thr Asn Gly Ala Asn

410 415 420

Val Gln Gln Trp Ala Cys Gly Asn Ser Asn Asn Gln Gln Trp Lys

425 430 435

Phe Gln

<210>23

<211>1089

<212>PRT

<213>未知

<220>

<223>琼脂糖酶II的氨基酸序列

<400>23

Met Phe Lys Thr Lys Arg Ser Leu Leu Ser Ser Ser Ile Ala Leu

1 5 10 15

Ser Leu Ala Leu Leu Gly Thr Lys Ala His Ala Glu Thr Ile Val

20 25 30

Leu Gln Ala Glu Ser Phe Asp Asn Ser Gly Gly Thr Tyr Asp Asp

35 40 45

Gly Gln Pro Asn Pro Val Thr Ile Tyr Ser Val Asn Gly Gln Asn

50 55 60

Ala Ile Asn Phe Val Asn Ala Gly Asp Phe Val Asp Phe Asn Ile

65 70 75

Asn Ala Glu Gly Gly Glu Tyr Asp Ile Glu Tyr Leu Val Gly Thr

80 85 90

Ser Val Gln Ser Gly Pro Ser Ile Glu Val Leu Val Asn Thr Asn

95 100 105

Gly Ala Trp Glu Ser Gln Gly Thr Val Ala Val Pro Leu Thr Ser

110 115 120

Trp Asp Asp Phe Gln Pro Leu Lys Pro Ser His Ser Val Thr Leu

125 130 135

Pro Ala Gly Ala Ser Thr Ile Arg Leu His Ala Ile Gly Ser Thr

140 145 150

Trp Gln Trp Asn Met Glu Ser Phe Ser Leu Thr Gln Val Val Pro

155 160 165

Leu Glu Pro Glu Thr Pro Val Asp Val Asp Asp Ile Val Ile Asn

170 175 180

Leu Glu Asn Phe Ile Phe Thr Asp Lys Glu Gly Ala Ala Ile Ser

185 190 195

Gly Asp Thr Ile Val Gly Phe Gly Val Thr Asn Ser Gly Ile Asn

200 205 210

Phe Asn Thr Val Gly Asp Tyr Ala Asp Tyr Thr Val Asn Phe Thr

215 220 225

Glu Ala Gly Thr Tyr Asn Ala Thr Leu Ala Ala Gly Ser Pro Met

230 235 240

Thr Gly Gln Ile Gly Ala Gln Ile Ile Met Asp Asn Ser Val Ala

245 250 255

Ala Ser Ser Leu Leu Ala Ser Thr Gly Gly Trp Asp Asn Tyr Val

260 265 270

Asp Phe Asp Leu Ser Gly Asp Ile Val Ile Pro Thr Pro Gly Thr

275 280 285

Tyr Thr Val Arg Leu Gln Ser Tyr Gly Ser Ala Asn Trp Gln Trp

290 295 300

Asn Ala Asp Thr Leu Thr Leu Ser Tyr Ile Ser Gly Glu Thr Gly

305 310 315

Asp Gly Asn Pro Ser Pro Pro Gln Glu Gly Asp Leu Ile Val Glu

320 325 330

Leu Glu Asp Phe Val Asn Thr Gly Thr Thr Gly Arg Val Gly Gly

335 340 345

Asp Ser Val Glu Gly Phe Gly Ala Thr Ala Thr Gly Val Asn Trp

350 355 360

Val Thr Asn Gly Asp Tyr Gly Asp Tyr Asn Ile Thr Phe Ala Glu

365 370 375

Pro Gly Thr Tyr Arg Ala Phe Phe Thr Tyr Ser Ala Ala Ser Ala

380 385 390

Gly Ser Tyr Gly Ala Arg Val Asp Val Asn Gly Glu Pro Val Ala

395 400 405

Trp Gly Tyr Phe Ala Glu Thr Gly Ser Trp Asp Val Ala Ser Glu

410 415 420

Val Glu Leu Tyr Gly Gly Tyr Phe Val Ile Asp Gln Ala Gly Gln

425 430 435

Ala Asn Leu Arg Val Glu Ala Ile Gly Gly Ser Asp Trp Gln Trp

440 445 450

Gly Gly Asp Lys Leu Arg Ile Thr Arg Val Gly Asp Val Ser Tyr

455 460 465

Val Pro Glu Arg His Tyr Asn Pro Asn Asp His Tyr Val Glu Glu

470 475 480

Val Glu Gly Pro Gln Thr Gln Ile Thr Tyr Leu Lys Pro Pro Ile

485 490 495

Asp Ile Pro Thr Asn Lys Lys Val Leu Lys Ser Asp Val Trp Tyr

500 505 510

Thr Tyr Pro Gln Asn Arg Glu Leu Glu Gly Phe Asp Asp Phe Gly

515 520 525

Ala Thr Gly Ala Phe Trp Gly His Pro Pro Glu His Asp Phe Tyr

530 535 540

Glu Glu Thr Val Ile Met Asp Trp Ala Val Asn Val Val Asp Thr

545 550 555

Phe Gln Ser Glu Gly Phe Glu Tyr Thr Ala Arg Gly Glu Phe Asp

560 565 570

Trp Gly Tyr Gly Trp Phe Thr Glu Tyr Val Thr Asn Pro Gln Pro

575 580 585

His Tyr Val Gln Thr Leu Asp Asp Arg Asn Val Arg Met Thr Phe

590 595 600

Met Gly Tyr Leu Ser His Asn Gly Tyr Asn Asn Asn Trp Leu Ser

605 610 615

Asn His Ser Pro Ala Phe Val Pro Phe Met Lys Ser Gln Val Asp

620 625 630

Gln Ile Leu Lys Ala Tyr Pro Asp Lys Leu Met Phe Asp Thr Gln

635 640 645

Thr Asn Ser Thr Arg Ser Thr Asp Met Arg Thr Phe Gly Gly Asp

650 655 660

Phe Ser Pro Tyr Ala Met Glu Asn Phe Arg Ile Trp Leu Asp Lys

665 670 675

Lys Tyr Ser Ser Asn Glu Leu Ala Asn Met Gly Ile Asn Asn Ile

680 685 690

Gln Thr Phe Asp Tyr Lys Gln His Leu Leu Asn Ala Gly Val Thr

695 700 705

His Gln Ser Phe Met Asn Ala Ala Asp Thr Leu Ser Gly Asn Val

710 715 720

Pro Leu Leu Glu Asp Phe Ile Tyr Phe Asn Arg Asp Val Trp Asn

725 730 735

Gln Lys Phe Gly Glu Val Leu Asp Tyr Ile Arg Gln Gln Arg Pro

740 745 750

Asp Ile Glu Ile Gly Ala Ser Thr His Leu Phe Glu Ser Arg Gly

755 760 765

Tyr Ile Phe Asn Glu Asn Ile Thr Phe Leu Ser Gly Glu Leu Asn

770 775 780

Leu Gly Ala Arg Thr Thr Ile Ser Glu Leu Pro Thr Asn Ile Leu

785 790 795

Val His Leu Lys Gly Ala Gln Ala Val Asp Lys Thr Leu Ala Tyr

800 805 810

Phe Pro Tyr Pro Trp Glu Phe Asp Glu Leu Arg Leu Gln Asp Ala

815 820 825

Pro Arg Phe Gly Arg Gly Trp Val Ala Gln Ala Tyr Ala Tyr Gly

830 835 840

Gly Leu Phe Ser Ile Pro Ala Asn Val Trp Val Gly Gly Glu Val

845 850 855

Trp Thr Trp Ser Pro Gly Ala Asp Asn Tyr Arg Asp Ile Tyr Gln

860 865 870

Phe Val Arg Ala Gln Ala Asp Leu Leu Asp Gly Tyr Thr Ser Tyr

875 880 885

Ser Lys Val Gly Leu Val His Ala Met Phe Ser Ser Met Lys Ala

890 895 900

Gly Phe Ile Asp Gly Gly Asn Gln Ile Gln Ser Ser Val Lys Leu

905 910 915

Leu Thr Glu Asp Asn Ile Asn Phe Asp Leu Leu Val Phe Gly Asp

920 925 930

Ala Gly Tyr Pro Val Val Pro Arg Ala Glu Asp Phe Asp Lys Phe

935 940 945

Glu His Ile Phe Phe Asp Gly Asp Gln Gln Tyr Leu Thr Ala Glu

950 955 960

Gln Gln Ala Ile Leu Asp Ala Gln Gly Ser Lys Val Arg His Ile

965 970 975

Gly Gln Arg Gly Thr Leu Ser Gly Ile Glu Ile Asp Val Ser Ile

980 985 990

Asn Gly Ser Val Ser Asn Glu Thr Val Ser Ala Val Ser Arg Ile

995 1000 1005

His Glu Thr Asn Ala Asn Ala Pro Tyr Val Val His Leu Val Asn

1010 1015 1020

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1025 1030 1035

Val Ala Ile Pro Gln Gly Tyr Phe Pro Asp Thr Val Thr Ser Ala

1040 1045 1050

Thr Leu His Leu Pro Asp Gly Thr Ser Thr Asn Leu Ser Val Ser

1055 1060 1065

Thr Asn Ala Glu Gly Asp Ala Val Val Thr Val Asn Asn Leu Glu

1070 1075 1080

Val Trp Gly Ile Leu Glu Leu Ala His

1085

<210>24

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物13

<400>24

ctgtttttgc cgaattcggc agattgggat ggcgtacc 38

<210>25

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PGR引物14

<400>25

gctgaaccct ctgcagtatt caacaacaac tgttgagc 38

<210>26

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物15

<400>26

caactgtttt tgccatatgg cagattggga tggcgtacc 39

<210>27

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物16

<400>27

gctgaaccct cctcgagtat tcaacaacaa ctgttg 36

<210>28

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物17

<400>28

gcgcatgcag aattcggaga ctatagtctt gcaagctg 38

<210>29

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物18

<400>29

ccaaagtatt ggatcctagg ttgttgataa acaacattg 39

<210>30

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物19

<400>30

ttgttattaa cgaattcgct agaaaacttt atctttacag 40

<210>31

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物20

<400>31

ccggcgacgg cgaattcgaa tccaagtcca ccacaagaag 40

<210>32

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于16S rRNA分析的PCR引物

<400>32

agagtttgat cctggctcag 20

<210>33

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于16S rRNA分析的PCR引物

<400>33

ggctaccttg ttacgactt 19

<210>34

<211>40

<212>DNA

<213>人工DNA

<220>

<223>PCR引物21

<400>34

acactgtacg agaattcgtt acaaagttat ggtagcgcga 40

Claims

1.一种琼脂糖酶，所述琼脂糖酶含有由SEQ ID NO：22的氨基酸序列中第21号氨基酸至第437号氨基酸的417个残基组成的氨基酸序列。

2.依照权利要求1的琼脂糖酶，所述琼脂糖酶可得自保藏号为FERM BP-7855的微生物NAB2-1-1。

3.一种基因，所述基因编码权利要求1所限定的琼脂糖酶。

4.依照权利要求3的基因，所述基因可得自保藏号为FERMBP-7855的微生物NAB2-1-1。

5.依照权利要求3的基因，所述基因含有由SEQ ID NO：20的核苷酸序列中第61号核苷酸至第1311号核苷酸的1251个核苷酸组成的核苷酸序列。

6.一种载体，所述载体含有以下的基因：

编码琼脂糖酶的基因，所述琼脂糖酶含有由SEQ ID NO：22的氨基酸序列中第21号氨基酸至第437号氨基酸的417个残基组成的氨基酸序列。

7.一种转化子，所述转化子带有权利要求6所限定的载体。

8.一种权利要求1所限定的琼脂糖酶的生产方法，所述方法包括培养保藏号为FERM BP-7855的微生物NAB2-1-1，并且从所述培养物中收集所述琼脂糖酶。

9.琼脂糖酶的生产方法，所述方法包括培养权利要求7所限定的转化子，并且从所述培养物中收集琼脂糖酶。

10.从琼脂糖凝胶中提取物质的方法，所述方法包括用权利要求1所限定的琼脂糖酶消化琼脂糖凝胶。

11.用于权利要求10所限定的从琼脂糖凝胶提取物质的方法的试剂盒，所述试剂盒含有权利要求1所限定的琼脂糖酶。

12.一种琼脂糖酶，所述琼脂糖酶是由保藏号为FERM BP-7855的NAB2-1-1获得的琼脂糖酶，且具有水解D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖之间的β-1，4键的活性，最适反应温度为55-65℃，且通过SDS-PAGE测定的分子量为48,000。