JPH05500309A - 新規のポリガラクツロナーゼ遺伝子および利用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ？−一 １雫−−シ ｂｔｕプより↑芒フク゛ン０フー１≧七３ボシンｆ阜陽七５へ本発明は分子生物 学の分野に関し、より詳しくは、組換え遺伝学および遺伝子工学の分野に関する 。本発明は更に、ポリガラクッロナーゼ酵素をコードするエルウィニア・力ロト ボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ　ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）由来のＤＮＡ配列に関する。

本発明は、本発明の配列を含んで成るベクター、例えばプラスミド、およびその ようなベクターにより形質転換された宿主細胞に関する。本発明の追加の観点は 、本発明の配列、本発明のベクターまたは形質転換宿主を使ったタンパク質の生 産方法に関する。本発明により、多量のポリガラクツロナーゼ酵素を純粋な形で 生産することができる。

関連技術の記載 ペクチン分解酵素の使用は食品工業において非常に重要である。伝統的には、例 えばアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　）または 他の真菌由来の酵素の混合物が使われているけれども、種々のペクチナーゼか異 なる反応を触媒するので、所望の量で個々の酵素の純粋調製物を使用するのが一 層経済的であり且つ効率的である。

ペクチンポリマーは１．４−結合したα−Ｄ−ガラクツロン酸とメトキシル化誘 導体の鎖を含む。それらのポリマーは植物の中層と一次細胞壁の重要な構造要素 である。

ペクチナーゼ酵素は、ペクチンポリマーの骨格および側鎖結合の開裂を触媒する 能力のため、果実および野菜ジュースの製造、ワイン製造、醸造およびパン焙焼 において商業的に重要なものである。ペクチンメチルエステラーゼは、ペクチン 酸を与えるペクチンからのメタノールの脱離を触媒する。

ポリガラクツロナーゼはガラクツロン酸鎖中のグリコシド結合を加水分解する。

ペクテートリアーゼはβ−説離によるガラクツロノシル結合を開裂し、ペクチン リアーゼは高度にメチル化されたペクチンのガラクッロノシル結合を開裂する（ Ｃｏ１．１ｍｅｒおよびＫｅｅｎ、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｐｈｙｔｏｌ）ａｔ ｈ、２４：３８３−４０９（１９８６））。天然のペクチンの効率的分解は、ペ クチンメチルエステラーゼとポリガラクッロナーゼまたはペクテートリアーゼを 使うことによって達成され得る。

例えば、柑橘系果実の細胞壁中に天然に存在するペクチンメチルエステラーゼは 、柑橘ジュース中に形成される「雲り」を不安定にする。ポリガラクッロナーゼ の添加はこの問題を改善することができる。しかしながら、オレンジジュースの ような曇り安定性着色ジュースを所望する場合には、ポリガラクッロナーゼ調製 物は他の酵素を含むべきではない。果肉を含まないレモンジュースや他のジュー スを製造するためには、ポリガラクッロナーゼはペクチンエステラーゼと共に添 加しなければならない（ＲｏｍｂｏｕｔｓおよびＰｉｌｎｉｋ、　Ｓｙｍｂｉｏ ｓｉｓペクチナーゼの他のグループである細菌性ベクテートリアーゼは、果実お よび野菜加工に通常必要な酸性ｐＨでは低い活性を有するので、直接的には実用 性がない。

ペクテートリアーゼ、ポリガラクツロナーゼおよびエンドセルラーゼをコードす る遺伝子はクローニングされている。

しかし、ペクチナーゼであるエルウィニア・クリサンセミ（Ｅｒｗｉｎｉａ　ｃ ｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）　Ｂ５７４のペクチンメチルエステラーゼのヌクレオ チド配列が報告されているだけである（Ｐｌａｓｔｏｗ、　Ａ、Ｓ、、Ｍｏ１． 　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　２：２４７−２５４　（１９８８））。

果実および野菜加工で使われるｐＨ範囲において活性である商業的に有用な量の 精製ペクチナーゼを生産する方法に対する要望かある。そのような方法は、それ らのペクチナーゼをコードする精製され且つ特徴づけられたヌクレオチド配列の 使用を要求する。しかしながら、主要なペクチナーゼ、ペクテートリアーゼおよ びポリガラクツロナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列は今までに報告 されていない。

情報開示の陳述 ３７Ｃ，Ｆ、Ｒ，６１，５６の要件に従って、下記のものは、３７Ｃ，Ｆ。

Ｒ，！ｉ　９１．９７および１．９８に従って提示された出願人またはその代理 人に既知である書類の説明である。

出願人は、３７Ｃ，Ｆ、Ｒ，！）１．９８に従って書類のコピーと一緒に、それ らの書類のリストを様−弐ＰＴＯ−１４４９において下記に提出願人は列挙され た書類に関する特許性を確立するための適当な行為に対するいかなる権利をも放 棄しない。

この陳述は、より具体的な情報か存在しないとかまたは関連技術の徹底調査を行 ったという陳述であると解釈すべきではない。

それらの書類の検討、およびここに列挙される書類の様式ＰＴＯ−１４４９およ びコピーの提出時に本出願の遂行の記録と全く同じものを作製することを慎んで 要請する。

Ｐｌａｓｔｏｗら、鉦ｍｌ山狙ｉｓ　２：１１５−１２２　（１９８６）は、エ ルウィニア由来の４つのベクテートリアーゼ遺伝子と１つのポリガラクツロナー ゼ遺伝子の分子クローニングを記載している。プラスミドを使って、該遺伝子を Ｅ、コリ細胞中に形質転換せしめ、ポリガラクツロナーゼ活性を測定することが できた。

ＴｓｕｙｕｍｕおよびＭｉｙａｍｏｔｏ、　５ｙ３Ｑ山匹国影１０３−１１０　 （１９８６）は、エルウィニア由来のベクテートリアーゼ遺伝子を用いてＥ。

コリ細胞を形質転換せしめ、そして形質転換細胞から分泌された遺伝子生産物を 検出した。

Ｋｏｔｏｕ　ｊａｎｓｋｙ　ら、ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ　４ニア８１−７８５ 　（１９８５）は、Ｅ。

コリ細胞を形質転換せしめるのにλフアージベクターを使った、エルウィニア由 来の４つのベクテートリアーゼ遺伝子と１つのエンドセルロース遺伝子のクロー ニングを記載している。

ＲｉｅｄおよびＣｏｌｌｍｅｒ、　Ａ　１．　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎ、　Ｍｉ ｃｒｏ、　５０：６１５−６２２　（１９８５）は、ペクチン酵素を検出しそし て特徴づける方法を記載している。該方法は、エルウィニア遺伝子を含むＥ６コ リクローンのベクテートリアーゼイソ酵素の分布を分析するのに使用された。

Ｋｏｔｏｕｊａｎｓｋｙ、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｐｈ　ｔｏｐａｔｈｏｌ、、 　２５：４０５−４３０　（１９８７）は、エルウィニアによる病原のペクチナ ーゼ依存を論じている。ポリガラクツロナーゼに関する情報の簡単な概説は４１ ０頁に見つかる。

ＣｏｌｌｍｅｒおよびＫｅｅｎ、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｐｈ　ｔｏ　ａｔｈｏ ｌ、、　２４：３８３−４０９　（１９８６）は、植物病原論におけるペクチン 酵素の役割の一般的概説を含む。ペクテートリアーゼ遺伝子のクローニングおよ びＥ、コリ細胞中での発現か論じられている。

Ｄａｎｉｅｌｓ　ら、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｐｈ　ｔｏ　ａｔｈｏｌ、、２６：２８ ５−３１２　（１９８８）は、細菌病原性遺伝子の概説を含む。

ＲＯｍｂＯＵｔＳおよびＰｉｌｎｉｋ、　針可山狙口彩７９−９０　（１９８６ ）は食品産業におけるペクチナーゼの役割を論じており、そしてＧＲＡＳ状態の 微生物中にペクチナーゼ遺伝子を導入する可能性を言及している。

Ｐｌａｓｔｏｗ、　Ｍｏ１．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　影２４７−２５４　（１ ９８８）は、エルウィニアのペクチンメチルエステラーゼ遺伝子のクローニング およびヌクレオチド配列を記載している。該遺伝子はＥ、コリ中で発現された。

本発明者らは、エルウィニア・カロトボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａｃａｒｏｔｏｖｏ ｒａ）においてポリガラクツロナーゼ酵素をコードする遺伝子を発見し、単離し 、クローニングし、そして配列決定した。該遺伝子は、ＧＲＡＳ　（一般に安全 と認められる）状態の宿主を含む異種宿主細胞を使って商業的に有用な量のポリ ガラクツロナーゼを生産するのに使用される。一般に、伝統的に既知の食品の醗 酵に関与する微生物由来の酵素だけが食品工業において使用することができる。

しかしながら、本明細書において開示されるポリガラクツロナーゼ遺伝子による ＧＲＡＳ微生物の形質転換および該遺伝子の発現はこの制限を回避することがで きる。

一態様では、本発明は、ポリガラクツロナーゼ酵素をコードする新規ヌクレオチ ド配列を包含する。この配列を使ってプラスミドおよび発現ベクターを作製する ことができる。それらのプラスミドおよびベクターを使って、グラム陰性菌とダ ラム陽性菌の両方を含む様々な宿主細胞中で該遺伝子を発現させることができる 。

本発明の重要な局面は、特に、本発明が商業的に有用な量のエルウィニアボリガ ラクツロナーゼの生産方法を提供することである。このエルウィニア酵素は、現 在入手可能な真菌由来のポリガラクツロナーゼに対比して、中性ｐＨで高い活性 を有する。従って、本発明のタンパク質は、サトウダイコン、ニンジンおよびリ ネンといった中性の植物および野菜材料の工業加工において通常認められるｐＨ 範囲で活性である。

本発明はまた、新規性質、特にポリガラクツロナーゼを合成および分泌する能力 を有する細菌の生産手段を提供する。

そのような細菌は飼料生産において有用である。

それらの態様並びに本発明の追加の局面は、下記の本発明の詳細な説明を参照す ることにより、当業者に一層明白になり容易に理解されるであろう。

図面の簡単な説明 ９１　ｐＨ３Ｋのポリガラクツロナーゼコード領域の位置決定。

太線は記載の制限部位を存するｐＨ３Ｋ２４中の４．１ｋｂ挿入断片を表す。存 在する制限酵素開裂部位を使うことにより（欠失体２４−２〜２４−６）または エキソヌクレアーゼ■により（消化欠失体２４−１．２４−７〜２４−９）部分 的に欠失体を作製した。細線は各欠失誘導体中に存在する４、１ｋｂ挿入断片の セグメントを表す。

左側の多重クローニング部位（ｍｃｓ）はＨｉｎｄＩＩ　ｌ−３ｐｈＩ−Ｐｓｔ 　ｌ−３ａｌ　Ｉ−ＸｂａＩ部位を含み、右側はＳｍａ　Ｉ−Ｋｐｎ　ｌ−３ａ ｃ　Ｉ−ＥｃｏＲＩをそれぞれ含む。ポリガラクツロン酸（ＰＧＡ）に対する欠 失誘導体のペクチン分解活性（＋または−）を右側に示す。

＠２　ｐｅｈＡ遺伝子の配列決定手順。挿入断片中および隣接の多重クローニン グ部位中のマツピングされた制限部位を使って、ポリガラクツロン酸ゼをコード する領域をＭｌａ中にサブクローニングした（図１の説明文を参照のこと）。配 列決定反応は、Ｓａｎｇｅｒのジデオキシチェーンターミネーション法（Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ　８０：３９６３−３９６ ５　（１９７７）　）と５ｅｑｕｅｎａｓｅ　ＴＭ（ＵＳＢ）を使って、指摘し た出発点と配列決定方向において精製一本鎖鋳型から行った。

図３ａ、ｂおよびｃ　ｐｅｈＡ遺伝子のＤＮＡ配列。ｌ也Ａ遺伝子のＤＮＡ配列 およびそれのタンパク質生産物の推定アミノ酸配列を示す。精製ポリガラクツロ ン酸ゼのＮＨ２−末端配列分析により決定したアミノ酸配列は下線で示される。

プロセシング部位は縦の矢印により示される。翻訳開始点の前のリポソーム結合 部位（ＲＢＳ）は、ＤＮＡ配列の下側に示される。３′末端のところの可能な転 写終結ループは矢印により示される。

鳳」　ポリガラクツロナーゼの活性に対するｐ）ｆの効果。

［Ｊ５　ポリガラクツロナーゼの活性に対する温度の効果。

［Ｎ６　エルウィニア・力ロトボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ　ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ ）の培地の逆相ＨＰＬＣ，ポリガラクッロナーゼ含有ピークは矢印により示され ている。

１１１７　オリゴヌクレオチドプライマーであるオリゴ３０７と３０８のヌクレ オチド配列。オリゴ３０８の推定アミノ酸配列も示されている。矢印はアミラー ゼシグナル配列の３′末端および成熟ペクチナーゼのＮ末端をコードする領域を 示す。

好ましい実施態様の記載 次の記載では、分子遺伝学および生物学の分野の当業者に既知である種々の方法 論への参照を行う。参照するそのような既知の方法論を記載している刊行物およ び他の資料は、あたかも全部が記載されたかのようにそっくりそのまま参考とし て本明細書中に組み込まれる。

組換えＤＮＡ技術の一般原理を記載している標準的参考研究としては、Ｗａｔｓ ｏｎ、　Ｊ、Ｄ、ら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅＧｅ ｎｅ、　Ｉおよび（Ｉ巻、出版社Ｔｈｅ　Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ ＰｕｂｌＣｕｍｍ１ｎ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｉｎｃ。、　Ｍｅｎｌｏ　Ｐａｒｋ 、　ＣＡ　（Ｉ９８７）　；Ｄａｒｎｅｌｌ、　Ｊ、Ｅ、ら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａ ｒ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、出版社５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａ ｎ　Ｂｏｏｋｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ｎ、Ｙ、　（Ｉ９８６） ；Ｌｅｗｉｎ、　Ｂ、Ｍ、、　Ｇｅｎｅｓ　ＩＩ、出版社Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ 　＆　５ｏｎｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。

Ｎ、Ｙ、（１９８５）　；　Ｏｌｄ、　Ｒ，Ｗ、ら、Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ｏ ｆ　ＧｅｎｅＭａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ：　Ａｎ　Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　 ｔｏ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ。

第２版、出版社Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ　Ｐｒｅｓ ｓ、　Ｂｅｒｋｅｌｅｙ。

ＣＡ　（１９８１）　；およびＭａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、ら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａ ｒ　Ｃｌｏｎｉｇ：　ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、出版社Ｃｏ１ｄ 　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ　（１９８２）が挙げられる。

微生物学の一般原理は、例えば、Ｄａｖｉｓ、　Ｂ、Ｄ、ら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏ ｌｏｇｙ、第３版、出版社Ｈａｒｐｅｒ　＆　Ｒｏｗ、　Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈ ｉａ、　ＰＡ　（１９８０）中に記載されている。

「クローニング」とは、特定の遺伝子または他のＤＮＡ配列をベクター分子中に 挿入するための試験管内組換え技術の使用を意味する。所望の遺伝子をうまくク ローニングするためには、ＤＮＡ断片を作製し、該断片をベクター分子に連結せ しめ、複合ＤＮＡ分子をそれが複製できる宿主細胞中に導入し、そして受容体宿 主細胞の中から標的遺伝子を有するクローンを選択する方法を使うことが必要で ある。好ましい態連結せしめ、そしてそれを使ってＥ、コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ　 ）を形質転換せしめる。ポリガラクツロナーゼをコードするＤＮＡを含むクロー ンのスクリーニングは公知の方法、例えば好ましくはＬＰＧＡ　Ａｐプレート上 での複製平板培養によって達成することができる。

「ベクター」とは、その中にＤＮＡの断片を挿入したりまたはクローニングした りすることができるプラスミドまたはバクテリオファージ由来のＤＮＡ分子を意 味する。ベクターは１または複数のユニーク制限部位を含み、そしてクローニン グされた配列が複製できるように限定された宿主またはビヒクル生物中で自己複 製することができるだろう。よって、ｒＤＮＡ発現ベクター」とは、追加のＤＮ Ａ配列が自律性要素のゲノム中に組み込まれた後、宿主の染色体とは無関係に宿 主中で複製することができる自律性要素を意味する。そのようなりＮＡ発現ベク ターとしては、細菌プラスミドおよびファージが挙げられる。しかしながら、本 発明の目的上好ましいのは、本出願人の１９８９年２月ｌＯ日出願の同時係属出 願第３０８、８６１号中に記載されたようなり、アミロリクエファシェンス（Ｂ 、　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｃｅ　）のα−アミラーゼ遺伝子に基づ く発現ベクターを含んで成るプラスミドである。その明細書はあたかも完全に記 載されたかのようにそっくりそのまま参考として本明細書中に組み込まれる。

「実質的に純粋な」とは、他のタンパク質もしくは遺伝子、または通常天然に見 出されるかもしれない他の汚染物を本質的に全く含まず、そしてそれ自体は天然 では見出されない形態で存在する本発明のタンパク質、またはそのようなタンパ ク質をコードする遺伝子を意味する。

２つの分子中のアミノ酸の配列か実質的に同じである場合、ある分子がもう一方 の分子と「実質的に類似」していると言われる。実質的に類似したアミノ酸分子 は類似した生物活性を有するだろう。よって、２つの分子が類似した活性を有す るとすれば、たとえ一方の分子が他方の分子中には見出されない追加のアミノ酸 残基を含むとしても、またはアミノ酸残基の配列か同一でなくても、その用語を 本明細書中で使用する時は、それらの分子は変異形とみなれる。かくして、アミ ノ酸配列から成るポリペプチドがポリガラクツロナーゼの触媒特性を有するなら ば、そのアミノ酸配列はポリガラクツロナーゼタンパク質のアミノ酸配列と「実 質的に類似」している。

本明細書中て使用する時、ある分子が、通常その分子の一部ではない追加の化学 成分を含む時、その分子を他の分子の「化学的誘導体」であると言う。そのよう な成分は分子の溶解性、吸収、生物学的半減期等を改善するかもしれない。ある いは、その成分が分子の毒性を減らすか、または望まし゛くない副作用を削除も しくは軽減することかある。そのようなＥａｓｔｏｎ、　Ｐｅｎｎ、　（１９８ ０）中に開示されている。

同様に、本発明のタンパク質の遺伝子の「機能的誘導体Ｊとは、ヌクレオチド配 列が「実質的に類似」であることがてきそして類似の活性を有する分子をコード する、該遺伝子の「断片」、「変異体」または「類似体」を含む意味である。

本明細書中で使用する時、ポリガラクツロナーゼ遺伝子の「機能的誘導体」は、 ポリガラクツロナーゼの触媒特性を有するポリペプチドをコードするだろう。

好ましい態様では、導入される配列は受容体宿主中で自己複製することができる ベクター中に組み込まれるだろう。種々様々なベクターのいずれもこの目的に使 用することができる。特定のプラスミドベクターを選択する際の重要な要因とし ては、ベクターを含む受容細胞を認識できそしてベクターを含まない受容細胞か ら選択できる簡便性；特定の宿主中で所望されるベクターのコピーの数；および 異なる種の宿主細胞間でベクターを「シャトル」することができるかどうか、が 挙げられる。好ましい原核ベクターとしては、プラスミド、例えばＥ、コリ中で 複製可能なもの（例えばｐＵｃ１８　）が挙げられる。そのようなプラスミドは 、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、ら（ｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　： 　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ ｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ　（１９ ８２）中〕により開示されている。特に好ましい本発明に係るベクターは、Ｅ。

コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）　、Ｂ、サブチリス（Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ　）　 、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｃｓ）およびラクトバシラス（Ｌａｃ ｔｏ−ｂａｃｉｌｌｕｓ）中で複製することができるものである。

構成物を含むベクターまたはＤＮＡ配列が発現用に調製されれば、種々の適当な 手段、例えば形質転換、トランスフェクション、接合、プロトプラスト融合、リ ン酸カルシウム沈澱およびジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）デキストランのよ うなポリカチオンの適用といった生化学的手段、並びにエレクトロポレーション 、直接マイクロインジェクションおよび入射微粒子衝撃ＣＪｏｈｎｓｔｏｎら、 ５ｃｉｅｎｃｅ　２４０：１５３８　（１９８８））といった機械的手段のいず れかにより、ベクターまたはＤＮＡ構成物を適当な宿主細胞中に導入することが できる。　本発明の好ましい態様では、プラスミドｐＨ３Ｋ２４からのポリガラ クッロナーゼ遺伝子をグラム陽性ベクターと一緒にしてダラム陽性菌を形質転換 せしめる。好ましいグラム陽性宿主としては、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）　 、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉ　ｌ１ｕｓ）およびラクトコッカス（Ｌ ａｃｔｏｃｏｃｃｕｃｓ）が挙げられる。本発明の別の好ましい態様では、ポリ ガラクツロナーゼのＤＮＡ配列を含むプラスミドｐＨ３Ｋ２４を用いてグラム陰 性宿主細胞を形質転換せしめる。

ベクターの導入後、受容細胞を選択培地中で増殖させ、ベクター含有細胞の増殖 について選択する。クローニングされた遺伝子配列の発現は、所望の非相同もし くは相同タンパク質の生産、またはこのタンパク質の断片の生産をもたらす。

発現されたタンパク質は、常用条件に従って、例えば抽出、沈澱、クロマトグラ フィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動等によって単離・精製す ることができる。例えば、細胞を遠心によりまたは適当な緩衝液を使って収集し 、溶解し、そして例えばＤＥＡＥ−セルロース、ホスホセルロース、ポリリボシ チジル酸−アガロース、ヒドロキシアパタイト上でのクロマトグラフィーにより 、または電気泳動もしくは免疫沈澱により、タンパク質を単離することができる 。好ましい態様では、発現されたタンパク質は、本発明の配列またはプラスミド を分泌ベクターと一緒に使用した時、宿主細胞から分泌されるだろう。これは単 離および精製が簡易化されるという利点を有する。

別の好ましい態様では、プラスミドｐＨ３Ｋ２４を修飾し、そしてＢ、アミロリ クエファシェンス（Ｂ、　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｃｅ　）のα−ア ミラーゼ遺伝子に基づ（バシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉ ｌｉｓ　）発現ベクターであるプラスミドｐＫＴＨ３９と組み合わせ、ハイブリ ッド発現単位を形成せしめた。この発現ベクターを含むプラスミドを用いてＢ、 サブチリス細胞を形質転換せしめ、クローンを増殖させ、そしてスクリーニング した。クローンＢＲＢ６７９は、上清中のポリガラクツロナーゼ活性により証明 されるように、該遺伝子を発現しそして遺伝子生産物を分泌した。

本発明を実施する様式および方法は、下記の実施例への参照により当業者に十分 に理解されるだろう。この実施例は本発明の範囲およびそれに向けられる請求の 範囲を限定するものではない。

実施例Ｉ Ｅ、コリ　（五」匪Ｌ）からのプラスミドＤＮＡの迅速な単離は、Ｈｏｌｍｅｓ およびＱｕｉｇｌｅｙ　（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１３４：１９３−１９ ７（１９８０））に従って行った。制限酵素消化およびサブクローニング用のＤ ＮＡは、ＢｉｒｎｂｏｉｍおよびＤｏｌｙ　（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

７二１５１３−１５２３　（１９７９））の方法により、２００　ｒＩＬｌの液 体培養物から調製した。Ｂ、サブチリス（Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ）からのプラ スミドＤＮＡの単離は、Ｇｒｙｃｚａｎら（、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１ ３４：　３１８−３２９　（１９７８））に従って行った。

エルウィニア・カロトボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ　ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）由来の 染色体ＤＮＡは次のようにして単離した。まず細胞を２０−のし培地中で２８° Ｃにて一晩、インキュベートし、収得し、そして４−の５０ｍＭグルコース−１ ０ｍＭ　ＥＤＴＡ　−２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ８，０中に再懸濁した。次い で１■のリゾチームを添加し、懸濁液を室温で２０分間インキュベートした。０ ．４ｍｌの１０％ＳＤＳを添加し、混合し、次いで２００μｇのＲＮアーゼを添 加し、穏やかに振盪しながら２８°Ｃて４０分間インキュベートした。次に、２ ．５■のプロテイナーゼＫを添加し、同温度てインキュベーションを６０分間続 けた。次いて、懸濁液を同容のフェノールで２回、フェノール−クロロホルム（ １：］、）で１１回そしてクロロホルムで１回抽出した。１／１０容の３Ｍ酢酸 ナトリウムと２．５容のエタノールを添加し、混合した。ＤＮＡ沈澱を超遠心管 に移し、この管をエタノールで満たし、ＤＮＡ沈澱をペレット化した。上清を捨 て、ペレットを乾燥し、更にｌ　ＯｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ−１ｍＭ　ＥＤＴＡ、 　ｐＨ８，０中に再懸濁して１ｍｇ／ｒｎＩ！のＤＮＡ７１度にし、そして４° Ｃで保存した。

製造業者（ＩＢＩ、　Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）の教示に従って制限酵素消化を行 った。制限断片を０．８％アガロースゲル中での電気泳動により分離した（Ｍａ ｎｉａｔｉｓら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎ ｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ ｂｏｒ、　Ｎ、Ｙ。

１９８２）　。選択した制限断片をＢｅｎ５ｏｎ、”　ｕｅ　２：６６−６８　 （１９８４）により記載されたようにして低融点ゲルから単離した。

ＤＮＡ断片の５′−リン酸化末端の脱リン酸には、子ウシ腸ホスファターゼ（Ｃ ＩＰ）　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を使った。

エキソヌクレアーゼＩ［（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を使ってクローン化ＤＮＡ断 片中に欠失を造成した。

ＤＮＡ断片の末端をＴ４　ＤＮＡリガーゼ（ＩＢＩ）により連結した。

ＤＮＡ修飾酵素は全て製造業者により与えられた教示に従っＥ、コリ　（Ｅ　ｃ ｏｌｉ）　ＨＢＩＯＩ細胞の形質転換は、ＭａｎｉａｔｉＳら、前掲において記 載されたＣａＣ１ｚ法を使って行った。Ｂ、サブチリス（ｕｂｔｉｌｉｓ）細胞 はＧｒｙｃｚａｎらの方法（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉ−ｏｌ、　１３４：３１８− ３２８　（１９７８））により形質転換した。

ＵＳＡ　８０：３９６３−３９６５　（１９７７）　）に基づいて５ｅｑｕｅｎ ａｓｅ　ＴＭ（ＵＳＢ）合成オリゴリボヌクレオチドプライマーは、３８１Ａ型 Ａｔ）ｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ合成装置を使ってホスホアミダイト法 により合成した。

ｅ、プラスミドｐＫＴＨ３９の作製 本出願人の同時係属出願第３０８．８６１号に詳細に記載されているプラスミド ｐＫＴＨ２９から出発して、下記のようにしてｐＫＴＨ３９を調製した。エキソ ヌクレアーゼで処理した乾燥ｐＫＴＨ２９調製物を、本出願人の同時係属出願第 ３０８．８６１号に記載されたリン酸化ＥｃｏＲＩ−リンカー分子を含む溶液５ μｌ中に溶解した。その溶液に０．５ｕｌ！の１０ｍＭ　ＡＴＰ、　０．５　ｕ 　Ｉ！の１ｍＭスペルミジンおよび０．５１．ｔｌのＴ、−ＤＮＡリガーゼ（２ Ｗｅｉｓｓ単位）を添加した。この溶液を２３°Ｃで３時間インキュベートし、 その後それを４０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ　−１００ｍＭ　ＮａＣ１−１０ｍＭ 　ＭｇＣＬｚ緩衝液（ｐＨ７，６）中に２０μｌに希釈した。１５単位のＥｃｏ ＲＩ酵素（ＢｉｏｌａｂＳ）を添加し、溶液を３７°Ｃて１２時間インキュベー トした。６５°Ｃで１０分間のインキュベーションにより反応を停止させた。Ｅ ｃｏＲＩて処理した調製物を１ｍｌの５ｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂカラムを通して 濾過した。この濾過における溶出緩衝液として２ｍＭＴｒｉｓ　ＨＣｌ−０，１ ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ７，５）を使った。濾液を３５ｕｌ画分において収集し 、そしてそれらの放射能によりプラスミド含存画分を同定し、収集し、乾燥した 。乾燥したＤＮＡを２０μｌの６６ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ　−６，６ｍＭ　Ｍ ｇＣｌ２−１０ｍＭジチオトレイトール緩衝液（１）８８．０）中に溶解し、そ れに１．５μｉの１０ｍＭ　ＡＴＰと０．３μｌのＴ４−ＤＮＡリガーゼを添加 した。溶液を２３℃で３時間インキュベートし、その後コンピテントＢ、サブチ リス（Ｂ。

５ｕｂｔｉｌｉｓ）　ＩＨＯ６０６４株をプラスミド調製物により形質転換せし め、そしてカナマイシンを含む細菌プレート上で培養した。

Ｇｒｙｃｚａｎら、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１３４：３１８−３２９　（ １９７８）により記載された方法により形質転換体からプラスミドを単離し、該 プラスミドをまずゲル電気泳動により特徴づけ、その後ＥｃｏＲｒリンカ−分子 の両末端のところのＤＮＡ塩基配列を決定した。

こうして、プラスミドｐＫＴＨ２９からプラスミドｐＫＴＨ３８とｐＫＴＨ３９ を得た。

プラスミドｐＫＴＩ（３８ては、ＢｃｏＲｉ　リンカ−分子はα−アミラーゼ構 造遺伝子の領域中の分泌シグナルの開裂部位の９０ヌクレオチド対後方に位置す る。プラスミドｐＫＴＨ３９では、ＥｃｏＲＩ　リンカ−分子はシグナル配列の 領域中のα−アミラーゼ遺伝子の開始メチオニンの１６ヌクレオチド対後方に位 置する。

分泌シグナルの連結部位のところでまたはそのすぐ近隣でリンカ−分子を連結す るために、プラスミドｐＫＴＨ３８をＥｃｏＲＩで開裂せしめた。開裂したプラ スミド１０μｇの３つの部分を各々　１１５μＲの２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　６０ ０ｍＭ　ＮａＣ１，１２ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、　１２ｍＭＣＵＣ１２，１ｍＭ　Ｅ ＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８，１）中に懸濁した。１０ｕｌのＢＡＬ−３１酵素（Ｂｅ ｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　ＢＲＬ、　４ ０ｕｌｍＪ）を各プラスミド部分に添加し、そして試験管を３０°Ｃの水浴中で ５，６および７分間インキュベートした。１２ｍＭの最終濃度を与えるように０ ．５Ｍ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ８，０を添加することにより反応を停止させた。ＢＡ Ｌ−３１で処理されたＤＮＡ部分を一緒にし、フェノールで２回抽出し、エタノ ール沈澱させた。エタノール沈澱物を７５μ！の６３ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　６．３ ｍＭ　ＭｇＣｌ□緩衝液（１））ｆ８．０）中に懸濁し、この溶液に５μｊ２の １ｍＭ　ｄＡＴＰ、　１ｍＭ　ｄＧＴＰ、　１ｍＭｃｌｃＴＰおよび１ｍＭ　ｄ ＴＴＰを添加し、最後に５μ！のＴ４ポリメラーゼ（ＰＬ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ ａｌｓ、　５Ｕ／　μｌ　）を添加した。該溶液を１１°Ｃで８０分間インキュ ベートした。上記と同様に０．５Ｍ　Ｅｌ）ＴＡを添加することにより反応を停 止させ、溶液をフェノールで抽出し、そしてＤＮＡをエタノール沈澱させた。エ タノール沈澱物を２５０μｆの１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　１ｍＭ　ＥＤＴＡ緩衝液 （ｐＨ８，０）中に溶解した。この溶液の５５μｌに５０μｌのリン酸化旧ｎｄ ＩＩＩ　リンカ−分子（ＢＲＬ、　７５ピコモル）、５μｆの６６０ｍＭ　Ｔｒ ｉｓ、　１００ｍＭＭｇＣ１２，５０ｍＭジチオトレイトール緩衝液（ｐＨ７， ５）および１０μｌのＴ４　ＤＮＡリガーゼ（ＢＲＬ、　２１／μｌ）を添加し た。得られた混合物を１５°Ｃて１５時間および６５°Ｃで１０分間インキュベ ートした。イソプロパツールの添加によりＤＮＡを沈澱させ、ＤＮＡ沈澱物を７ ０％エタノールで洗浄し、真空乾燥した後、１００μｉの１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、 　５０ｍＭ　ＮａＣ１，５ｍＭ　ＭｇＣｌ２．５ｍＭジチオトレイトール緩衝液 （ｐＨ８，０）中に懸濁した。この懸濁液に３μｌのＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素（ ＢＲＬ、　１０　Ｕ／μｆｆ　）を添加し、３７°Ｃで４時間および６５°Ｃで １０分間インキュベートした。０．８％ＬＧＴアガロースゲル（Ｍａｒｉｎｅ　 Ｃｏ１１ｏｉｄｓ　Ｉｎｃ、）中での３０Ｖ、１５時間の電気泳動によりＤＮＡ を精製した。直鎖状プラスミド領域をゲルから切す取り、ＤＮＡを６５°Ｃにて フェノール抽出し、そしてエタノール沈澱させた。エタノール沈澱物を３５μｌ の６６ｍＭＴｒｉｓ、１０ｍＭ　ＭｇＣ１，５ｍＭジチオトレイトール緩衝液（ ｐＨ７，５）に溶解し、これに１，５ａ（！の１０ｍＭ　ｒＡＴＰと１．５μｉ のＴ４　ＤＮＡリガーゼ（ＢＲＬ、　２Ｌｌ／μｌ）を添加した。この混合物を ２２°Ｃて３時間インキュベートした後、コンピテントＢ、サブチリスＱ工５ｕ ｂｔｉｌｉｓ）ＩＨＯ６１３５株中に形質転換せしめ、該細胞をカナマイシン含 有栄養培地プレート上で培養した。上述した方法に従って形質転換体からプラス ミドを単離し、そしてＤＮＡ配列決定によりプラスミド中のＨｉｎｄｌｌＩ　リ ンカ−分子の位置を決定した。こうして、ＨｉｎｄＩＩＩ　リンカ−分子が分泌 シグナルの直後に位置するかまたはα−アミラーゼ構造遺伝子領域中の分泌シグ ナルの開裂部位の後ろの種々の位置に位置する一系列のプラスミドが得られた。

プラスミドｐＫＴＨ３９に関しては、リンカ−分子をシグナル配列の連結部位の ところまたはそのすぐ近くで連結するために、プラスミドｐＫＴＨ３８について 上述したのと同様のアプローチを使った。Ｂ、アミロリクエファシェンス（Ｂ、 　ａｍｙｌｏ−１ｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）のα−アミラーゼ遺伝子の欠失シグ ナル配列を含むプラスミドｐＫＴＨ３９を使う場合、所望の構造遺伝子はＥｃｏ Ｒ１部位のところ、または例えば本出願人の出願第３０８．８６１号の実施例３ に記載されたような試験管内変異部位を使って同じ部位に、または公知の方法に より開始コドン（−ｍｅ　ｔ　）とＥｃｏＲ１部位の間の任意の中間部位のとこ ろに挿入することができる。所望の位置における新規連結部位の造成は、部位特 異的試験管内突然変異誘発、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含むかそれらに 限定されない当業者に既知の方法により、または必要なプロモーター断片を試験 管内で合成することにより、達成することかできる。これらは全て、本発明の教 示によって日常の技術を使って行うことができる。

プラスミド産生タンパク質は、５ａｎｃａｒらのマキシ細胞法（Ｊ、　Ｂａｃｔ ｅｒｉｏｌ、　１３７：６９２−６９３　（１９７９））により生産した。ある いは、製造業者（Ａｍｅｒｓｈａｍ）により提供された教示に従ってＤＮＡ指令 試験管内転写−翻訳システムによってプラスミド産生タンパク質を生産した。２ ５Ｓ−標識タンパク質生産物をＬａｅｍｍｌｉ　（Ｎａｔｕｒｅ　２２７：６８ ０−６８５　（１９７０）　）に従ったドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリル アミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離し、そして染色し乾燥した ゲルのオートラジオグラフィーにより可視化した。

ｇ、ｐｃ活性のアッセイ ペクチン分解活性は、０．７％ポリガラクツロン酸を含むし寒天プレート上で検 出した。ペクチン分解コロニーの周りに白色帯の出現をもたらすＩＭ　ＣａＣＬ でプレートを染色することにより、活性を明らかにした。

ポリガラクッロナーゼ活性は、０．５％（Ｗ／Ｖ）ポリガラクツロン酸、　５０ ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ６，０）、　１００ｍＭ　ＮａＣ１，２ｍＭＥＤＴＡ および適当量の精製ポリガラクツロン酸ゼを含む反応混合物中で還元基の遊離を 測定することにより決定した。反応混合物を３０°Ｃで１時間インキュベートし 、そしてどこかに記載されたｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド法（Ｌｅｖｅｒ 。

ｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　４７：２７３−２７９　（１９７２））を使ッテ 、遊離シタ還元基をアッセイした。このアッセイにおける標準としてＤ−ガラク ツロン酸を使用した。１単位のポリガラクツロナーゼは、上記の条件下で１マイ クロモルの生成物の遊離を触媒する酵素活性の量として定義された。

ｈ、ポリガラクツロン酸ゼの精製およびＮ末端アミノ酸配地からゲル濾過により ポリガラクツロナーゼを精製した。清澄化した培地０．５ｍｌをＢｌｏ−Ｇｅ１ 　Ｐ−１００（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。

Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ）カラム（１，ＯＸ　２８ｃｍ　）上に適用し、そし て５０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣ１，ｐＨ７，５，１００ｍＭ　ＮａＣ１で５−７時間 の流速で溶出させた。ポリガラクツロナーゼを含む画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｌ ａｅｍｍｌｉ、　）Ｊ４旦ｒｅ　２２７：６８０−６８５　（１９７０））によ り検出し、プールし、そしてＵＮＩＳＥＰ　Ｍｉｎｉｃｅｎｔ−１０限外濾過器 （Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使って濃縮した。精製したタンパク質をポリガラクツロナ ーゼアッセイに使用した。タンパク質量はＢｒａｄｆｏｒｄの方法（Ａｎａｌ、 　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　７２：２４８　（１９７６））により決定した。

Ｎ末端配列分析用に、ポリガラクツロナーゼを逆相高性能液体クロマトグラフィ ー（ＨＰＬＣ）により精製した。清澄化した培地０．５−を、０．１％（ｖ／ｖ ）　トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で平衡化されたＴＳＫ　ＴＭＳ　２５０逆相カ ラム（０，４６Ｘ４　ｃｍ）に注入した。

０．１％ＴＦＡ中のアセトニトリルの増加直線勾配（６０分間で０〜１００％） を使って、結合しているタンパク質を１ｍｔ’／分の流速で溶出させた。タンパ ク質は２８０　ｎｍで検出した。タンパク質含有ピークを収集し、５ＤＳ−ＰＡ ＧＥにより分析した。

Ｎ末端配列分析のために、精製したＰＧを気相／液相シークエンサー（Ｍｏｄｉ ｆｉｅｄ　Ｂｅｃｋｍａｎ　８９００）中で分解した（Ｋａｌｋｋｉｎｅｎおよ びＴｉｌｇｍａｎｎ、　Ｊ、　Ｐｒｏｔ、　Ｃｈｅｍ、　７：２４２−２４３（ １９８８））。約６μｇの精製ＰＧを、２■のボリブレン（Ｐｏｌｙｂｒｅｎ） で前処理したグラスファイバーフィルター上にのせた。分解には、０３ＣＰＴＨ プログラム（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、そしてＢｒｏ ｗｎ　ＭｉｃｒｏＧｒａｄｉｅｎｔ　ＬＣポンプ、Ｊｏｎｅｓクロマトグラフィ ーオーブン、５ｐｅｃｔｒａ　Ｐｈｙｓｉｃｓ　ＳＰ　８４５０検出器およびＭ ｅｒｅｋ　Ｈｉｔａｃｈｉ　Ｄ−２０００積分ブロー、ト器から成る系を使って 遊離したアミノ酸誘導体をオンラインで検出した。ＰＴＨアミノ酸の分離は、５ ３°Ｃにおいて２５ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ３，７，５％テトラヒドロフラン 中のアセトニトリル勾配を使うことにより０．２　Ｘ２１ｃｍの逆相カラム（Ａ ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で行った。

菌株 株　参考文献または入手源 エルウィニア・力ロトボーラ　Ｐｉｒｈｏｎｅｎ　Ｍ、ら、（Ｅｒｗｉｎｉａ　 ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）　ＳＣＣ３１９３Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｐａｔｈｏ　。

力ロトボーラ亜種（Ｅｃｃ）　上３５９−３６７エシエリキア・コリ　１３ｏｙ ｅｒ　ｅｔ　Ｒｏｕｌｌａｎｄ−（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｋ１ ２　ＨＢＩＯＩ　Ｄｕｓｓｏｉｘ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ。

肚：４５９−４７２　（１９６９） エシェリキア・コリ　Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら、（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ ｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｋ１２　ＪＭ１０９　Ｇｅｎｅ　３３：１０３−１１９　（ １９８５）エシェリキア・コリ　Ｈａｎａｈａｎ、　Ｊ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｔ。

Ｅ、コリ、Ｂ、サブチリスおよびエルウィニア・カロトボーラ菌株は、それぞれ ＋３７°Ｃまたは＋２８°Ｃ（エルウィニア）においてＬブロスまたはＬ培地（ Ｍｉｌｌｅｒ　Ｊ、、　１９７２゜Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃ ｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂ ｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ）中で増殖 させた。プラスミド維持のため、アンピシリン（Ａｐ）およびカナマイシン（Ｋ ｍ）をそれぞれ１５０μｇ／−および１０μｇ／ｍＡ’において培地に添加した 。

出発プラスミド ｐＵｃ９　Ｖｉｅｒａ　＆　Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｇｅｎｅ　１９：ｐＵｃ１８　 Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ　ら、ＧｅｎｅＭ１３　ｍｐ１８／１９　Ｙａｎ ｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ　ら、Ｇｅｎｅ競：１．０３−１１９　（１９８５） 実施例■ カロトポーラＳＣＣ３１９３からのゲノムＤＮＡライブラリーをプラスミドｐＵ ｃ１８中で作製した。ＳＣＣ３１９３からの染色体ＤＮＡを単離し、５ａｕ３Ａ で部分消化し、そして生じた制限断片を電気泳動により分離し、１．５ｋｂ〜５ 　ｋｂの断片をゲルから単離した。それらの断片を、予めＢａｍ旧で消化され脱 リン酸されているｐｌＪｃ１８と連結せしめた。連結混合物を用いてコンピテン トＥ、コリＨＢＩＯＩ細胞を形質転換せしめた。１５０μｇ／ｒｎｌのアンピシ リンを含むしプレート上に形質転換混合物を塗布することにより、形質転換体を 選択した。ＬＰＧＡ　Ａｐプレー・ト上で複製平板培養することによりポリガラ クッロナーゼをコードするクローンをスクリーニングし、陽性クローンを更なる 分析のため単離した。

ｐＨ５Ｋ２４と命名したそれらのクローンの１つは、細胞抽出物からのエンザイ ムアッセイにより測定すると、ポリガラクッロナーゼを産生じた。

ｂ、　ｐＨ３Ｋ２４中の挿入断片の特徴づけプラスミドｐＨ５Ｋ２４中のＤＮＡ 挿入断片を制限マツピングにより特徴づけた（図１）。挿入断片は４．１ｋｂの サイズであっ伝子を位置決定するために、ｐＨ３Ｋ２４の欠失誘導体を作製した 。

ＰＣ活性に影響を及ぼすことなく最も右の１．７　ｋｂ　Ａｖａｌ−３ｍａＩ断 片を削除することができた（２４−２．３ｍａｒ部位は１）ＵＣｌ３の多重クロ ーニング部位（ｍｃｓ）中に存在する〕。同様に、酵素活性に影響を及ぼすこと なく該挿入断片の左端から約ｓｏｏ　ｂｐをエキソヌクレアーゼ■消化により除 去することができた。このことは、１丸遺伝子か最も左のＥｃｏＲＩ−Ａｖａ　 Ｉ断片からの１，６ｋｂ断片中に存在することを示唆する（図１）。

ｃ、ｐｅｈＡ遺伝子のヌクレオチド配列ｐｅｈＡを有する１、６ｋｂ断片のヌク レオチド配列を決定した。

配列決定方法は図２に記載されており、対応する配列は推定アミノ酸配列と一緒 に図３に記載されている。該配列は、１位のＭｅｔで出発し、そして適当な位置 の典型的なリポソーム結合部位ＧＡＧＧ　（ＳｈｉｎｅおよびＤａｌｇａｒｎｏ 、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ″７１：１３４２−１３４６　（１９７４））により先行され る唯一の長い転写解読枠を含んだ。翻訳終結コドンは１２０７位に位置する。

Ｐｅｈタンパク質の計算分子量Ｍｒは４２．８４９であった。

ｄ、ＰＧタンパク質の同定 ３５３で標識されたプラスミド産生タンパク質を５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し 、Ｍｒｖ−カー（Ｓｉｇｍａ　ＭＷ−ＳＤＳ−７Ｌ）との比較により分子量を決 定した。

ｐＨ３Ｋ２４を含有するマキシ細胞からのプラスミド産生タンパク質の分析は、 Ｌ山Ａ遺伝子が見かけＭＷ　４２．０００のポリペプチドをコードすることを示 した。

プラスミド産生タンパク質をＤＮＡ依存性試験管内転写翻訳により分析した時、 ４５．０００の見かけＭｒを有するポリペプチドが得られ、これは匹屏遺伝子産 物が前駆体として合成されることを示唆している。

ｅ、ＰＣの単離およびそれのＮ末端アミノ酸配列の決定ＰＧが実際に前駆体とし て合成されることを確証するために、成熟ＰＧのＮ末端アミノ酸配列を決定した 。これを行うために、プラスミドｐＨ３Ｋ２４をバクテリオファージＴ４と共に エルウィニア°カロトボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ　ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）亜種力 ロトポーラ５ＣＣ３１９３中に形質導入し、Ａｐ′形質導入体を選択した。それ らの形質導入体は、５ＣＣ３１９３と比較して数倍のＰＧを過剰生産した。この 過剰生産は、５ＣＣ３１９３により通常生産される別の細胞外酵素の合成または 分泌の抑制をもたらした。

５ＣＣ３１９３（１）Ｈ５Ｋ２４）（７）培養上清中のタンパク質の約９０％が ＰＣであった。

５ＣＣ３１９３（ｐＨ３Ｋ２４）の−晩培養物からの培養上清を単離し、方法の 部に記載したようにしてポリガラクッロナーゼを精製した。

精製したタンパク質は５ＤＳ−ＰＡＧＥにおいて４２．０００の見かけ分子量を 有する一本のバンドとして移動した。該酵素の比活性は５００　Ｕ／■タンパク 質であった。該酵素の最適ｐＨは約５．５であり（図４）、最適温度は３５〜４ ５°Ｃの範囲てあった（図５）。

ポリガラクッロナーゼを逆相ＨＰＬＣにより精製しく図６）、アミノ酸配列分析 にかけた時、単一のＮ末端アミノ酸配列５ｅｒ−Ａｓ　ｐ−３ｅｒ−Ａｒｇ−Ｔ ｈｒ−Ｖａ　ｌ−３ｅｒ−Ｇ　１ｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−３ｅ　 ｒ−３ｅ　ｒ　−か得られた。この配列はヌクレオチド配列（１３９−１８０， 図３）から推定されるものと同一であり、プロセシングされた成熟ＰＧのＮ末端 を決定する。

鋳型としてプラスミド１）Ｈ３Ｋ２４を使ってＰＣＲ反応ＣＭｕｌｌｉｓら、Ｍ ｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　ｌｊｉ：３３５−３５０　（１９８７）　） により脂肪遺伝子を合成し、変更された５′および３′末端構造物を作製した。

３′末端は４つの追加の制限酵素部位（ＥｃｏＲＩ、　ＢａｍＨＩ。

ＳｍａＩおよびＮａｒＩ）を含むように変更した。オリゴヌクレオチドプライマ ー（オリゴ３０７）は図７に示される。５′末端は、成熟ＰＧのＮ末端の上流に 、Ｂ、アミロリクエファシェンス（Ｂ、ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｃｅ ）　ａ−アミラーゼ遺伝子ノシクナル配列の２２個のＣ末端アミノ酸残基を含む ように合成した。

前記シグナル配列構造を追加のクローニング部位を含むようにわずかに変更した 。オリゴヌクレオチドプライマー（オリゴ３０８）は図７に示される。

ＰＣＲ反応混合物は１０μｍ１の緩衝液、１６ａｌの１．２ｍＭ　ｄＮＴＰ混合 物、０．１ナノモルのオリゴ３０７．０．１ナノモルのオリゴ３０８．１００　 ｎｇのｐＨ３Ｋ２４．０．５μｍの酵素、全量１００μｌの水を含んだ。ＰＣＲ 反応はＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　ＰＣＲ装置中で２５サイクル間続けた。各サ イクルは９２°Ｃで１分、５５°Ｃで１分および７２℃で１分のインキュベーシ ョン期間から成った。

反応混合物をフェノールで２回抽出し、エタノール沈澱せしめ、そして３０μｌ のＴＥ中に溶解した。ｌＯμ！試料を全量２０μｌにおいてＥｃｏＲＩで消化し た。フェノール抽出後、１μｌをＥｃｏＲＩ消化されＣＩＰ処理されたプラスミ ドｐＵＣ９に連結せしめた。

連結混合物を用いてＥ、コＩＪ　ＤＨ５αＦ′細胞を形質転換せしめ、Ｌ　Ｘ− ｇｅｌ、　ＩＰＴＧ、　Ａｐｐ−レート上平板培養した。４つのコロニーからＤ ＮＡを単離し、１つのクローン（＃５）か正しいサイズの断片を含むことかわか った。２００　ｎｇのＥｃｏＲＩ消化したクローン＃５を７μｌの容量でＥｃｏ ＲＩ消化したｐＫＴＨ３９と連結せしめた。ｐＫＴＨ３９は、Ｂ、アミロリクエ ファシェンス（Ｂ、ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｅｅ）　ａ−アミラーゼ 遺伝子に基づくバシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ） 発現ベクターであり、プロモーター−３Ｄ領域に加えてα−アミラーゼシグナル 配列の８個のＮ末端アミノ酸残基を含む。オリゴ３０７によりコードされる２２ 個のＣ末端アミノ酸残基に連結すると、完全な機能性α−アミラーゼシクナル配 列が形成される。上述したように、ｐＫＴＨ−３９プラスミドの詳細な記載は、 本出願人の同時係属出願第３０８．８６１号に見つかる。連結混合物を用いてＢ 、サブチリス　５ｕｂｔｌ’　）　ＢＲＢＩを形質転換せしめ、Ｌ　Ｋｍプレー ト上に塗布した。

アガロースゲルを使って挿入断片の存在についてクローンをスクリーニングした 。正しい方向てＥｃｏＲＩ断片を含むＢＲＢ６７９　（ＢＲＢ６７９＝　ＢＲＢ Ｉ［ｐＫＴＨ１８９２］）と命名した１つのクローンを培養用に選択した。

クローンＢＲＢ６７９を、０．１Ｍリン酸カリウムｐｉ（７，０，５％グルコー スおよびＫｍが補足された二重緊縮しブロス中で増殖させた。−晩培養物を２０ −の増殖培地中に１．：ｌｏｏ希釈した。

Ｋｌｅｔｔｅｇ　１００　＋４時間の時点で試料を採取した。この試料からＰＧ 活性を測定すると、上清か１０．００００／ｍｆのポリガラクツロナーゼ活性を 含むことかわかった。

宿主細胞中でのポリガラクツロナーゼの分泌を獲得する現在最良の方法は、完全 な機能性シグナル配列をポリガラクッロナーゼ遺伝子と結合することである。本 出願人の同時係属出願第３０８．８６１号において開示されたｐＫＴＨ５Ｑ−５ ９ベクターがこの目的に最も好ましい。成熟ポリガラクッロナーゼをコードする 変更銀山遺伝子をｐＫＴＨ５０−５９の群から選択されたベクターと融合し、そ の融合体を使って宿主細胞を形質転換せしめる。ポリガラクッロナーゼ遺伝子の 発現は、宿主に適する増殖培地中での培養後の細胞外ポリガラクッロナーゼ活性 として検出される。

本明細書中に記載のベクターを使って、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌ ｌｕｓ　）およびラクト）ッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）宿主細胞中でポリ ガラクッロナーゼ遺伝子を発現させる。方法は１９８９年７月１０日出願の本出 願人の同時係属出願第３７７゜４５０号の実施例Ｖ、■および■に詳細に記載さ れている。その明細書はあたかも全部が記載されたかのように本明細書にそっく りそのまま参考として組み込まれる。

簡単に言えば、ｐＫＴＨ１７９７，ｐＫＴＨ１７９８，ｐＫＴＨ１７９９，ｐＫ ＴＨ１８０１゜ｐＫＴＨ１８０５，ｐＫＴＨ］、８０６．　ｐＫＴＨＩ８０７お よびｐＫＴＨ１８０９により例示されるプラスミドは、プロモーターと分泌促進 シグナルを含む。

それらのプラスミドのプロモーターと分泌促進シグナルは、ラクトバシラスおよ びラクトコッカスといったグラム陽性宿主細胞中での異種遺伝子の発現および遺 伝子産物の分泌を指令することができる。

ポリガラクツロナーゼ遺伝子の発現および遺伝子産物の分泌を得るために、ラク トバシラスおよびラクトコッカスといった宿主細胞を、上記のプロモーターおよ び分泌促進シグナル並びに本明細書に記載の成熟ＰｅｈＡタンパク質をコードす る遺伝子を含むプラスミドにより形質転換せしめる。該タンパク質の発現を許容 する条件下で適当な培地中で宿主細胞を増殖させ、そして該タンパク質を培地か ら回収する。

本発明を今まで十分に記載してきたか、後述されるような本発明の精神および範 囲を逸脱することなく多くの変更および改良を行い得ることは当業者に明白であ ろう。

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Claims (28)

【特許請求の範囲】
1. １．ポリガラクツロナーゼタンパク質をコードするヌクレオチド配列、またはそ れの機能的もしくは化学的誘導体。
2. ２．エルウィニア・カロトボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）菌か ら単離される請求項１のヌクレオチド配列、またはそれの機能的もしくは化学的 誘導体。
3. ３．図３ａ，ｂおよびｃに示されるような実質的に純粋なヌクレオチド配列、ま たはそれの機能的もしくは化学的誘導体。
4. ４．請求項１〜３のいずれか一項のヌクレオチド配列を含んで成るプラスミド。
5. ５．請求項４のプラスミドにより形質転換された宿主細胞。
6. ６．前記細胞がバシラス（ＢａＣＩｌｌｕｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃ ｏｃｃｕｓ）およびラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉ１１ｕｓ）から成る群 から選択される、請求項５の宿主細胞。
7. ７．前記細胞がＢＲＢ６７９である、請求項６の宿主細胞。
8. ８．請求項４のプラスミドおよび分泌ベクターを含んで成るハイブリッド発現単 位。
9. ９．前記分泌ベクターがプラスミドｐＫＴＨ３９を含んで成る、請求項８のハイ ブリッド発現単位。
10. １０．宿主細胞中でポリガラクツロナーゼを生産せしめる方法であって、請求項 ４のプラスミドを用いて前記宿主細胞を形質転換せしめ、形質転換された宿主細 胞を適当な増殖培地中で前記タンパク質の発現を許容する条件下で培養し、そし て前記宿主細胞または前記培地から発現されたタンパク質を回収することを含ん で成る方法。
11. １１．プラスミドｐＨＳＫ２４またはそれの機能的もしくは化学的誘導体。
12. １２．前記宿主細胞がグラム陰性菌である、請求項１１のプラスミドにより形質 転換された宿主細胞。
13. １３．請求項１１のプラスミドおよび分泌ベクターを含んで成るハイブリッド発 現単位。
14. １４．前記分泌ベクターがｐＫＴＨ３９を含んで成る、請求項１３のハイブリッ ド発現単位。
15. １５．図３ａ，ｂおよびｃに示されるような実質的に純粋なヌクレオチド配列に よりコードされるポリペプチド、またはそれの機能的もしくは化学的誘導体。
16. １６．図３ａ，ｂおよびｃに示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプ チド、またはそれの機能的もしくは化学的誘導体。
17. １７．請求項４のプラスミドにより形質転換された宿主細胞により合成される、 図３ａ，ｂおよびｃのアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド、またはそれの機 能的もしくは化学的誘導体。
18. １８．前記宿主細胞がＢＲＢ６７９である、請求項１８のポリペプチド。
19. １９．請求項８のハイブリッド発現単位により形質転換された宿主細胞により合 成される、図３ａ，ｂおよびｃに示されるような実質的に純粋なヌクレオチド配 列によりコードされるポリペプチド、またはそれの機能的もしくは化学的誘導体 。
20. ２０．請求項８のハイブリッド発現単位により形質転換された宿主細胞により合 成される、図３ａ，ｂおよびｃのアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド、また はそれの機能的もしくは化学的誘導体。
21. ２１．前記宿主細胞がＢＲＢ６７９である、請求項１９のポリペプチド。
22. ２２．前記宿主細胞がＢＲＢ６７９である、請求項２０のポリペプチド。
23. ２３．請求項４のプラスミドにより形質転換された宿主細胞により合成される、 図３ａ，ｂおよびｃに示されるような実質的に純粋なヌクレオチド配列によりコ ードされるポリペプチド、またはそれの機能的もしくは化学的誘導体。
24. ２４．前記宿主細胞がＢＲＢ６７９である、請求項２３のポリペプチド。
25. ２５．請求項１３のハイブリッド発現単位により形質転換された宿主細胞により 合成される、図３ａ，ｂおよびｃに示されるような実質的に純粋なヌクレオチド 配列によりコードされるポリペプチド、またはそれの機能的もしくは化学的誘導 体。
26. ２６．請求項１３のハイブリッド発現単位により形質転換された暗主細胞により 合成される、図３ａ，ｂおよびｃのアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド、ま たはそれの機能的もしくは化学的誘導体。
27. ２７．前記宿主細胞がグラム陰性菌である、請求項２５のポリペプチド。
28. ２８．前記宿主細胞がグラム陰性菌である、請求項２６のポリペプチド。