JPH11514219A - 好アルカリ性で好熱姓の微生物およびそれから得られる酵素 - Google Patents
好アルカリ性で好熱姓の微生物およびそれから得られる酵素Info
- Publication number
- JPH11514219A JPH11514219A JP9511624A JP51162497A JPH11514219A JP H11514219 A JPH11514219 A JP H11514219A JP 9511624 A JP9511624 A JP 9511624A JP 51162497 A JP51162497 A JP 51162497A JP H11514219 A JPH11514219 A JP H11514219A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amylase
- polypeptide
- pullulanase
- bacteria
- enzyme
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2451—Glucanases acting on alpha-1,6-glucosidic bonds
- C12N9/2457—Pullulanase (3.2.1.41)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2411—Amylases
- C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
- C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2451—Glucanases acting on alpha-1,6-glucosidic bonds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01041—Pullulanase (3.2.1.41)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Paper (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
本発明は、好熱姓で好アルカリ性のバクテリア、およびそれから得られる熱安定性アルカリポリペプチドを提供する。本発明は、さらに、該ポリペプチドを製造する方法、該ポリペプチドをコードする核酸、および該ポリペプチドを含む組成物を提供する。また、本発明は、該新規微生物から得られる酵素を洗剤産業、紙およびパルプ産業、および繊維産業に利用することに関する。
Description
【発明の詳細な説明】
好アルカリ性で好熱姓の微生物およびそれから得られる酵素
発明の属する技術分野
本発明は、新規な好アルカリ性で好熱姓の微生物、およびそれから得られる新
規な酵素に関する。
発明の背景
好アルカリ性微生物は、多数の分類学上の群にわたって存在し、アルカリ性の
pH環境(一般的にはpH8以上)において最適な生育を示す異種群の微生物で
ある(Jones,B.E.他、(1994)好アルカリ性微生物:多様性と同定(Alkaliphile
s : diversity and identification)「微生物の多様性と同定(Microbial Divers ity and Identification)
」(F.G.Priest 他編)から、Plenum Press社発行、Ne
w YorkおよびLondon,195-230 頁)。偏性の好アルカリ性微生物は、一般にpH
9からpH10の間に最適生育pHを有し、中性pHにおいては生育することがで
きない。アルカリ耐性(すなわち、通性的に好アルカリ性)微生物は、それほど
厳しくなく、そしてアルカリpH値においても生育することはできるが、その最
適値は中性から酸性域に存する。
好熱姓微生物もまた、極めて異なる集団にわたって存在する微生物であり、50
℃以上において最適生育温度を有するものを指す。中位の好熱姓微生物における
最高生育温度は通常70℃より低い。最低生育温度が40℃以上、最適温度が65℃以
上で、最高生育温度が70℃以上の微生物は、高度好熱姓微生物と定義される(Cow
an,D.A.(1992)。高度好熱姓の原始バクテリアにおける生化学と分子生物学(B
iochemistry and molecular biology of extremely thermophilic archeaobacte
ria)、「高度好熱姓微生物の分子生物学とバイオテクノロジー(Molecular Biolo gy and Biotechnology of Extremophiles)
」から(R.A.Herbert およびR.J.
Sharp編集)、Blachie & sons社発行、Glasgow およびLondon,1-43頁)。
好アルカリ性と好熱姓を組み合わせた表現型が見られるのはきわめて稀のよう
である。そのような微生物の2種類のみ(いずれも下水道処理設備から単離され
た)が詳細に検討され、いずれもグラム陽性バクテリアのクロストリジム(Clost ridium
)属として帰属された。その微生物の一方、すなわち、クロストリジウム
・パラドクサム(Clostridium paradoxum)は、pH7.3 からpH11.0において生
育し最適値がpH10近傍にある偏性好アルカリ微生物である。しかしながら、こ
の微生物は、最適生育温度が55℃で最高温度が63℃である点において中位の好熱
姓微生物に分類され得るものにすぎない(Youhong Li 他(1992)Int.J.Syst.Ba
cteriol. 43,450-460)。第2の微生物、すなわち、クロストリジウム・テルモ
アルカリフィラム(Clostridium thermoalcaliphilum)は、pH7からpH11の間
で生育し、最適値がpH9.5 からpH10にある通性好アルカリ性ないしはアルカ
リ耐性生物である。最適生育温度50℃であり最高温度が57℃であるので、このバ
クテリアは、非常に中位の好熱姓微生物または耐アルカリ性微生物として分類さ
れ得るものにすぎない(Youhong Li 他(1994)Int.J.Syst.Bacteriol. 44,11
1-118)。
既知の好熱姓バクテリアのうち、数種がテルモトガレス(Thermotogales)目に
属する。主として高度好熱姓バクテリアから成るこの群は、リボソームRNA遺
伝子の配列決定により他のすべてのバクテリアから系統発生学的に遠いものであ
ることが示され、また、バクテリア界の中で最も深い分派にあり且つ最も進化の
遅いものの1種であることが示されている。テルモトゲラスに属するバクテリア
の特徴は、グラム陰性、棒状(杆状)、嫌気性、発酵性バクテリアであることに
あり、さや状の外膜(「トガ(toga)」)を有し、そして、その生育は分子状水素
によって阻害される(Huber,R.およびStetter,K.O.(1992)テルモトガレス
目(The order Thermotogales)「原核生物(The Prokarvotes)」から、(A.Balows
他編集)、Springer-Verlag 社発行、New York,3809-3815 頁)。
現在、テルモトガレスは5つの属によって表されている。テルモトガ(Thermot oga)
属、テルモシフォ(Thermosipho)属およびフェルビドバクテリウム(Fervidob acterium)
属は既知の高度好熱性種を構成し、一方、(16S rRNA分析によれば)
互いの類縁性の高いゲオトガ(Geotoga)属およびペトロトガ(Petrotoga)属はさら
に中熱性の種を構成している。既知の種はいずれも、顕著な好アルカリ性を示さ
ない。高度好熱姓テルモトガレスに属する現存種の多くは、浅海または深海熱水
システムのような活動中の地熱水環境、または低塩の硫黄噴気泉から単離さ
れたものである。最近、好熱姓の低い菌株、特にゲオトガ属およびペトロトガ属
の菌株が地表下の深油田から単離されている。(Huber,R.およびStetter,K.
O.(1992)同上、Davey,M.E.他、(1993)Syst.Appl.Microbiol.16,191-200
;Ravot,G.他、(1995)Int.J.Syst.Bacteriol.45,308-314)。
テルモトガレスのいろいろな微生物は、生育を可能にする温度、pHおよびN
aCl範囲のような表現型の特性によっても区別し得る(表1、Ravot,G他(199
5)Int.J.Syst.Bacteriol, 45,308-314)が、それらの分類は、主として、1
6S rRNA遺伝子によるヌクレオチド配列間の類似性比較およびDNA−DN
Aハイブリダイゼーション実験に基づく。Stackebrandt およびGoebelは、16S
rRNA配列の同一性が97%以上の微生物菌株は、その他の基準も満たしていれ
ば、同一の種のものであると考えることができると提示している(Int.J.Syst
.Bacteriol.44,846-849,1994)。フェルヒドバクテリウム・アイランディカ
ム(Fervidobacterium islandicum)とフェルビドバクテリウム・ノドスム(Fervid obacterium nodosum)
の16S rRNA配列は95.3%の類似性を有することが示さ
れており、この値は同一属内の異なる種に典型的なものである(Huber,R 他、(1
990)Arch.Microbiol.154, 105-111)が、テルモトガおよびテルモシフォに属す
る菌株とは10〜15%相違する。テルモトガレス(Thermotogales)目内で、一般的
に配列の相違が約8%以下であると同一の属にあるものと判定されている。16S
rRNA配列の相違が約10%であり且つ表現型に相違があると、多くの場合、別
の属にある異なるテルモトガレス単離物であると主張される(Huber,R.他、(19
89)Syst.Appl.Microbiol.12,32-37;Davey,M.E.他(1993)Syst.Appl.Mic
robiol.16,191-200;Ravot,G.他、(1995)Int.J.Syst.Bacteriol.45,30
8-314)。
発明の概要
本発明は、新しい属であるテルモパリウム(Thermopallium)属、詳述すれば、
新しい種テルモパリウム・ナトロノフィラム(Thermopallium natronophilum)に
属する新規な好熱姓で好アルカリ性のバクテリア、およびこれらのバクテリアか
ら得られるペプチドを提供する。別の態様として、本発明は、これらの新規なバ
クテリア由来の新規なアルカリプルラナーゼおよびアミラーゼ製剤を提供する。
第3の態様として、本発明は、本発明に従う新規なポリペプチドを含む組成物
を提供する。
第4の態様として、本発明は、本発明に従うポリペプチドをコードする単離さ
れたDNAフラグメント、そのようなDNAフラグメントを含む組換えDNA、
そのような組換えDNAで形質転換された宿主細胞、およびそのような宿主細胞
の培養物を提供する。
さらに、別の態様として、本発明は、本発明に従うポリペプチド、好ましくは
酵素を製造するための方法を提供する。
図面の簡単な説明
図1は、テルモトガレス目について、新規なバクテリアであるテルモパリウム
・ナトロノフィラム(Thermopallium natronophilum)と他のバクテリアの関係を
示すための16S rDNA配列に基づく系統分類図である。
図2は、テルモパリウム・ナトロノフィラムTg9Aから得られた未精製アミ
ラーゼの温度と酵素活性(%相対値)との関係(pH8.5 で20分後に測定)を示
す。
図3は、テルモパリウム・ナトロノフィラムTg9Aから得られた未精製アミ
ラーゼのpHと酵素活性(%相対値)との関係(80℃のおいて20分後に測定)を
示す。
図4は、アミラーゼA−1の温度と酵素活性(%相対値)との関係(pH8.5
で20分後に測定)を示す。
図5は、アミラーゼA−1のpHと酵素活性(%相対値)との関係(80℃にお
いて20分後に測定)を示す。
図6は、アミラーゼA−IIの温度と酵素活性(%相対値)との関係(pH8.5
において20分後に測定)を示す。
図7は、アミラーゼA−IIのpHと酵素活性(%相対値)との関係(80℃にお
いて20分後に測定)を示す。
発明の詳細な説明微生物
本発明の新規微生物は、炭酸塩(および関連アニオン)が溶けているためにア
ルカリpHを有するが(導電率測定(表2)によると)溶解塩の濃度は低い温泉
およびその流水から分離された。該温泉は、アフリカ大陸東部のリフトバレー(R
ift Valley)の地域にある。その代表的な炭酸塩アニオン濃度は1g/lを超え
ており、したがって、通常の硫黄噴気孔ではない。単離された微生物の純水培養
物は、テルモパリウム・ナトロノフィラムTg9Aと命名され、1994年9月21日
に、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に従い、寄
託番号DSM9460として、DSM-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen un
d Zellkulturen GmbH(Mascheroder Weg 1b,D-38124 Braunschweig,ドイツ)に
寄託している。
本発明の微生物は、内生胞子を形成しない厳密に嫌気性の棒状(杆状)バクテ
リアである。このバクテリアの細胞は、特徴的な外部構造、すなわち「トガ(tog
a)」で覆われ、細胞の両極がふくらんでいる。この細胞は、通常、単一の細胞と
して、または3個の細胞から成る短い鎖状で存在する。増殖期に、該細胞は曲が
ったり不規則な形状をとることがあり、また、凝集体を形成することがある。定
常増殖期に、この細胞は球状となり、1ヶまたはそれ以上の細胞が大きな球状体
内部に含まれる。この微生物は、アルカリ栄養寒天もしくはGelrite(炭酸塩を含
有)上で丸く、光沢があり、白色で半透明のコロニーを形成する。したがって、
これらの特性に基づき、該微生物テルモパリウム・ナトロノフィラムは、「テル
モトガレス(Thermotogales)」目のバクテリアであると帰属することができる(H
uber,R.およびStetter,K.O.(1992)“テルモトガレス(Thermotogales)”目
:「原核生物(The Prokaryotes)」から、(A.Barlows 他、編集)、Springer-Ver
lag 社発行、New York,3809-3815 頁)。
自然から単離した本発明の微生物は、さらに以下の特性によって記述すること
ができる。
生育温度:52℃〜78℃の間で生育する。50℃または79℃においては生育しない
。最大生育速度は約70℃で観察されたが、最大の細胞産生量は約63℃から約64℃
で得られた。
生育pH:pH範囲: 7.2から>10.5で生育できる。最適pH:約8.8 から約
9.5。
NaClの影響:生育に最適なNaCl濃度は1%(w/v)であり、4〜5(w/v)
を超えると生育しない。
グラム反応性:陰性。
KOH反応性:陰性。
アミノペプチダーゼ反応性:陰性。
SODの影響:ドデシル硫酸ナトリウム1%(w/v)が存在すると、細胞および
さや状構造体のいずれも顕微鏡観察下に数秒以内で消失する。
リソチームの影響:顕微鏡観察下に細胞の懸濁液にリソチーム(10mg/ml)を添
加したが影響は殆ど認められなかった。20mg/ml のリソチームでは、杆状細胞が
球状になるものもあった。
生育性:グルコース:陽性
ガラクトース:陽性
マルトース:陽性
キシロース:弱い
リボース:陰性
ホルメート:陰性
アセテート:陽性
ラクテート:陰性
プロピオネート:陰性
ピルベート:弱い
グルタメート:陰性
グリシン:陽性
グリセロール:陽性
エタノール:陰性
セルロース:陽性
カゼイン:陽性
ゼラチン:陽性
キシラン:陽性
でん粉:陽性
オリーブ油:陽性
トリプトン:陽性。
生育に対するイオウおよび水素の影響:分子状水素(H2)によって生育が阻害
される。この阻害は、培地にイオウを添加することにより解除することができる
。
G+C含有量:36.3±0.9 モル%(n−2)(HPLC法)。微生物の分類と同定
本発明の菌株の分類は、PCRにより増幅された16S rRNA遺伝子の直接的
な配列決定による系統発生学的関係に基づいて行われた。Genbank データベース
およびEMBLデータベースからアクセスした既知の配列との配列比較を行った
。それらの配列を互いに整合させ、コンピュータプログラム(PHLIPパケッ
ジのバージョン3.4 および3.5c(Felstein,J.(1989)Cladistics 5, 164-166))
を用いて系統発生学的分析を行った。類似値を計算し(表3)、系統発生図を作
製した(図1)。
その結果、該菌株は98.7%の16S rRNA配列類似値を有し、したがって、同
一の種の単離物と考えられる。さらに、この新規微生物の菌株は、他の属のバク
テリアよりもフェルビドバクテリウム属との相関性が高いことも示されている。
しかしながら、この新規微生物菌株は、しばしば「トガ(toga)」と称され、杆状
細胞の両極をふくらませているさや状の外部構造を有する。この「トガ」は、テ
ルモトガ属、テルモシフォ属、ゲオトガ属およびペトロトガ属の微生物に共通の
特徴である(Balows 他編集、Springer-Verlag 社発行、New York,3809-3815 頁
;Ravot,G.他、(1995)International Journal of Systematic Bacteriology 4 5
,308-314)。これに対して、フェルビドバクテリウムに属する種は、端部が「
偏球(スフェロイド)」である(Huber,R.およびStetter,K.O.ibid;Huber,
R.他(1990)Archives of Microbiology 154, 105-111;Patel,B.K.C.他、(1
985)Archives of Microbiology 141, 63-69)。この事実からだけでも、本発明の
新規微生物菌株が新しい種であることが示されている。しかしながら、フェルビ
ドバクテリウムに対する配列ホモロジーの相違が殆ど10%であることはきわめて
重要である。その理由は、バクテリア界の最も深い分派の1つを表すこれらの系
統(Winkler,S. およびWoese,C.R.(1991)Systematic & Applied Microbiolo
gy 13,161-16S)は、他のバクテリア群に比べてゆっくり進化しているからであ
る(Huber,R.他、Systematic & Applied Microbilogy 12, 32-37)。このことは
、このたびの新しい微生物が、別異で、これまで知られていない族のものである
ことを示す。このことを基礎にして、該微生物は新しい属であるテルモパリウム(Thermopallium
)に帰属させられ、該微生物菌株はテルモパリウム・ナトロノフ
ィラム(Thermopallium natronophilum)種に帰属させたれた。テルモパリウム属
およびテルモパリウム・ナトロノフィラム種は、16S rRNA遺伝子のヌクレオ
チド配列(添付した配列リストのSEQ ID No.1)および本明細書に記述した表現型
特性によって同定される。
G+Cの値を既知の種と比較して相違を調べることによっても(表4)、本発
明の新規微生物菌株が新しい種に帰属させ得ることが裏付けられる。本発明の微
生物の表現型特徴は、テルモトガレスの既知の種から別異のものであることを明
示している(表1)。この新規微生物は、明らかに高度好熱姓微生物であり、大
陸内温泉(すなわち、非海洋源)から単離されたテルモトガレス種に典型的な温
度プロフィルを有している。しかしながら、既知のテルモトガレス種はすべて、
中性近傍に最適生育pHを有する。これに対して、本発明の新規微生物は、明ら
かに、偏性的に好アルカリ性であり、中性pHにおいて(表1)または炭酸塩ア
ニオンを含有する培地なしでは生育することができない。
微生物の培養
本発明の微生物は、厳密な無酸素条件下においてのみ培養することができ、例
えば、Freter型の嫌気室またはBalch 等により記載された(Microbiol.Rev.(197
9),43,260-296)厳密な嫌気技術を用いる密閉容器が使用される。好適な栄養培
地が必要であり、代表的には、同化性の炭素および窒素源とともに、その他の必
須栄養分を含む培地が使用される。好ましくは、培地の全溶解塩濃度が、約15mS
/cm の導電率を超えないようにし、そして、上記のような厳密な嫌気性条件下に
調製する。好ましくは、還元剤を添加して、当初のレドックス値が充分に低くな
るようにする。好適な培地は、当該分野で既知の手法によって調製することがで
きる。
自然から単離された本発明の新規テルモパリウム・ナトロノフィラム種から成
る新規微生物は、好アルカリ性であり、pH7.2 以下では生育できないので、培
養はアルカリpH値で実施することが好ましく、これは、生育用培地を無菌処理
した後、炭酸ナトリウム(より好ましくは、炭酸ナトリウムと重炭酸ナトリウム
の混合物)のような適当な緩衝剤を添加することによって達成され、そして、頭
部のスペースに無酸素(O2)のN2用のガス相を設けてこの操作を行うのが好まし
い。そのような培地の1例は、TMZ培地であり、これはCastenholtz 塩を用
いるサーマス(Thermus)培地を改良したものであり(Willlams,R.A.D.およびD
aCosta,M.S.(1992),サーマス属および関連微生物(The genus Thermus and re
lated microorganisms): 「原核生物(The Prokarvotes)」から、(A.Barlows
他編集)、Springer-Verlag 社発行、New York,3745頁)、当該微生物を純粋な培
養物として単離した温泉水の当初の条件に適応しているものである。他の緩衝液
、例えば、トリス/HClまたはBorax/NaCl中でも生育は可能であるが、炭
酸塩によるpH調製が必要である。NaOHを用いてアルカリ性pHに調整した
培地上では殆どまたは全く生育は起こらない。
大規模の培養を行うには、一般に、O2を含有しない窒素ガスを用いて連続的
に培地を散布することが必要である。
生育の最低温度は約40℃であった。好ましい態様においては、この新規テルモ
パリウム・ナトロノフィラム種の単離物は65℃で生育した。
培養後、当該分野で知られた手法を用いて培養ブロスから細胞を分離し、該ブ
ロスを濃縮することにより液状の酵素濃縮物を得ることができる。別の方法とし
て、細胞を適当な液体中に懸濁させて、破断、分解、もしくは溶解、またはその
他の処理を行い、適当な方法を用いて可溶性画分として酵素を分離することもで
きる。この可溶化された酵素は、塩もしくは水と混和性の溶媒を用いてまたは水
を除去することにより固体状に濃縮および/または沈殿させた後、随時、精製す
ることができる。このようにして精製された酵素は最終的に結晶状態で得ること
ができる。微生物由来の酵素
本発明の酵素は、アルカリpH(例えばpH7.5 から12.0、より好ましくはp
H8.5 から9)に維持され、炭酸塩、または炭酸塩と重炭酸塩の混合物が添加さ
れ、炭素および窒素源ならびに無機塩類を含有する適当な栄養培地中で、本発明
の微生物、(好ましくはテルモパリウム・ナトロノフィラムTg9A、DSM9
460)、またはその変異体を培養することによって得られる。
テルモパリウム・ナトロノフィラムの変異体は、自然発生、化学的操作、遺伝
子操作またはその他の方法によって得ることができ、核酸転移、環境圧の選択、
UV照射および当業者に既知の突然変異付与性化学物質の使用によって得られた
変異体が含まれる。
この酵素は、好適な宿主生物中で適当な遺伝子をクローニングする組換えDN
A技術によって得ることもできる。これは任意の好適な手段で行うことができ、
例えば、1種またはそれ以上の制限酵素を用いて染色体DNAを分解してゲノム
ライブラリーまたは或る1つの大きさのランダムDNAフラグメントを調製する
。ランダムフラグメントから成るライブラリー由来のDNAフラグメントは組換
え核酸内に挿入されることができる。そのような組換え核酸の典型がベクターで
あり、これは、例えば、プラスミド、バクテリオファージまたはその他の構造体
であって、核酸の転移または核酸の転移と発現に適するようになっているもので
ある。
当業者であれば、広く入手できる適当なベクターから、当該分野で知られた遺
伝子工学的手法、例えば、Sambrook他による「分子クローニング:実験室マニア
ル(Molecular cloning:a Laboratory Manual;1989」に記載の手法を用いて好
適なベクターを調製できるであろう。
本発明のベクターは、一般に、1つまたはそれ以上の複製起点を有することに
よって、バクテリア細胞または酵母細胞のような宿主細胞内で複製され得るよう
になっている(これによって、分子生物学の標準的な手法により、例えば、大腸
菌内で構造体が複製され処理され得る)。さらに、ベクターは、一般に(通常、
5´から3´方向に沿って)次の構成要素を含む:本発明の酵素をコードする核
酸配列の発現を支配するプロモータ;プロモータのレギュレータ(随時)、転写
開始部位、翻訳開始コドン;および本発明の酵素をコードする核酸配列。
ベクターは、さらに、1種またはそれ以上の選択マーカー遺伝子、例えば抗生
物質耐性遺伝子を含むことができる。そのようなマーカー遺伝子によって形質転
換体の同定が可能となる。必要に応じて、ベクターはプロモータのエンハンサー
を含むこともある。ベクターは、また、ポリアデニル化シグナルを含むこともあ
り、これは、一般に、本発明の酵素をコードする核酸に対して3´位にある。さ
らに、ベクターは、本発明の酵素をコードする配列に対する3´位に転写終了部
位(ターミネータ)を含むことがある。
ベクターは、さらに、例えば、対象となるポリペプチドをコードする配列に対
して3´位に1種またはそれ以上のイントロンまたは非コード配列を含むことが
ある。
典型的なベクターにおいては、本発明の酵素をコードする核酸配列は、該配列
を発現させることのできるプロモータと作動的に結合されている。「作動的に結
合(operably linked)」とは、プロモータと本発明の酵素をコードする核酸配列
とが、該プロモータの制御下に該コード配列が発現され得るような関係になるよ
うに並置されていることを意味する。したがって、プロモータとコード配列との
間に5´非コード配列のような要素が存在することもある。コード配列に対する
プロモータによる正確な制御を促進するが、損なうことがなければそのような配
列を含ませることもできる。
治療用ポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸配列を支配することが
できれば、ベクター内に任意のプロモータを含ませることができる。例えば、バ
クテリア由来、真核生物由来、またはウイルス由来のプロモータがある。これら
のプロモータは構成性または誘発性のいずれでもよい。
かくして、本発明は、本発明の組換え核酸配列の1種またはそれ以上を含む宿
主細胞を提供する。これらの細胞は、一般に、組換え核酸により形質転換または
トランスフェクションされる。宿主細胞内に組換え核酸を導入するには任意の好
適な手段が用いられる。例えば、本発明の酵素をコードする配列を感染性ウイル
ス粒子にパッケージして細胞をトランスフェクションする。本発明の酵素をコー
ドする核酸配列は、エレクトロポーレーション、リポフェクション、バイオリス
ティック形質転換、または溶液中に核酸を細胞に単に接触させることによっても
導入され得る。
そのようなベクターは、宿主細胞のゲノムに組み込まれた後、または、プラス
ミドの場合のように染色体外に保持されて、複製を行う。任意の好適な宿主細胞
を用いることができ、これには、例えば、原核微生物および真核微生物、ならび
に植物細胞が挙げられる。
組換えクローンは、一般的に利用できる手法、例えばマーカーの存在によるス
クリーニングなどを用いて選択される。好適なスクリーニング法としては核酸ハ
イブリダイゼーション、抗体アッセイ、タンパク質活性を検出するためのプレー
トアッセイなどが含まれる。
目的の酵素が分泌される場合には、従来法により生育培地から回収することが
できる。別のやり方として、宿主細胞を破砕し、次いで当該分野で既知の回収法
により回収することもできる。
本発明に従う新規微生物であるテルモパリウム・ナトロフィラムは、有価値の
新しい酵素、特に、アミラーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、プルラ
ナーゼおよびキシラナーゼを産生することが見出されている。1例として、本発
明のアミラーゼの特性について記述する。微生物によって産生されたアミラーゼの特性
生育培地からゲルろ過クロマトグラフィによって分離された可溶性アミラーゼ
画分の分子量は、タンパク質マーカーと比較すると、90kDaである。このアミ
ラーゼ画分は、アミラーゼ活性の最適温度が95℃であり、最適pHは8.8 である
(図2および図3)。
イオン交換クロマトグラフィにより2種類のアミラーゼを分離することができ
、SDS−ポリアクリルアミド電気泳動法で測定すると以下の分子量を与える。
アミラーゼA−Iサブユニット分子量=87kDa
アミラーゼA−IIサブユニット分子量=83kDa
アミラーゼはA−Iは、最適温度95℃であり、最適pHが10.2である(図4お
よび図5)。その活性の半減期は96℃で測定すると11分間である。
アミラーゼA−IIは、最適温度が80℃であり、最適pHが9.6 である(図6お
よび図7)。80℃で120 分間のインキュベーション中に酵素活性は失活しない。
これらのアミラーゼは、さらに、次のような特性を有する。
アミラーゼA−I:・可溶性でん粉に対して加水分解活性を有し、主としてマ
ルトースおよびその他のデキストリンを産生。
・プルラナンに対する加水分解活性。
・NaCl(0.0067M)により活性が増大される。
アミラーゼA−II:・可溶性でん粉に対して加水分解活性を有し、デキストリ
ン(G1〜G9)を産生。
・EDTAおよびEGTAにより活性が減少。
・活性にCa2+が必要
アミラーゼA−Iは以下のN末端配列を有する:Xaa-Xaa-Glu-Ile-Tyr-Val/
Asp-Gly-Phe(Xaaは任意のアミノ酸を示す)。
そして、(内部に)以下の部分的アミノ酸配列を有する:Tyr-Ile-Gly-Asp-Gl
y-Ala-(Trp)-Glu-Ala-Val-Leu-Glu-Gly-(Asp)-(Asp)-Glu-(Gly/Glu)-Phe-Tyr-Ar
g(カッコ内はアミノ酸の同定が不確定であることを示す)。
アミラーゼA−IIは(内部に)以下の部分的アミノ酸配列を有する:Ile-Gly-
Leu-Pro-Ser-Val-Met-Thr-Glu-Pro-Trp-Asn-Pro-Ile-Gly-Gly-Ser-Asn-(Trp)-Il
e-Phe-Asp-Met-Met-Leu-Ile-(Arg)。
アミラーゼA−IおよびA−IIは、本発明の好ましいアミラーゼではあるが、
本発明はこれらのアミラーゼに限定されるものではない。むしろ、本発明は、ア
ミノ酸配列が若干異なるそれらのアミノ酸の変異体、およびそれらの変異体をコ
ードする核酸配列も提供するものである。
本発明の変異体アミラーゼは、アミラーゼA−IまたはアミラーゼA−IIに対
して配列相同性(ホモロジー)の程度が高く、例えば、70%、80%、90%、95%
、あるいは99%に達するような配列相同性を有する。
変異体は、該変異体がアミラーゼA−IまたはアミラーゼA−IIのアミラーゼ
活性を有するか、または実質的に該活性を有している限りは、アミラーゼA−I
またはアミラーゼA−IIとの配列の相違が、1個またはそれ以上の欠失、置換ま
たは挿入によるものであってもよい。例えば、変異体は、一般に、アミラーゼA
−Iおよび/またはA−IIが加水分解活性を発揮する物質の幾つかまたは全てに
対して加水分解活性を有する。本発明の有用性
本発明の新規微生物から得られる酵素は、洗剤産業においてクリーニング洗剤
や自動皿洗い洗剤として使用されることができる。熱的に安定であり、アルカリ
性であるため、該酵素は、高温、高pH下で使用されるのに極めて適している。
換言すれば、これらの酵素は、洗浄、特に皿洗いに理想的な条件下で使用される
のに極めて適している。しみや汚れを分解するために粉末状および液状洗剤の両
方で使用され得る酵素の例は、炭水化物を分解するアミラーゼ、タンパク質を分
解するプロテアーゼ、および脂質を分解するリパーゼである。酵素を組成物とし
て、例えば洗剤組成物として使用する場合には、当該分野で知られている他の多
くの洗剤成分、例えば、ビルダー、漂白剤、漂白剤活性剤、柔軟剤、香料、他の
酵素等と組み合わせて使用しなければならない。
洗剤産業は、熱的に安定なアルカリ性酵素に興味を持っている唯一の産業では
ない。これらの酵素に対する多くの有用な用途は、紙パルプ産業および繊維産業
においても見出される。例えば、熱的安定でアルカリ性の洗剤は、クリーニング
用洗剤や自動皿洗い用洗剤として有用であるが、紙の製造(特にデサイジング)
、および織物のデサイジング(特にアルカリ性精練工程と組み合わせる場合)に
おいても有用である。
これらの酵素に対する要求が増大しているのは、熱的安定なアルカリ性酵素の
この汎用性にある。
実施例実施例1:微生物の培養 培地
次の組成(リッター当たり)の倍地中でテルモパリウム・ナトロノフィラムの
培養を行った。
100 ml 溶液A
10 ml 溶液B
10 ml 溶液C
5m l ビタミン溶液(Raven他(1992)、Appl.Microbiol.Biotech.
38,263-267またはDSM141)
1 ml レザツリン(Resazurin)溶液(1g/L)(シグマ製)
2 g トリプトン(Difco Bacto製)
1 g 酵母エキス(Difco Bacto製)
2.5 g でん粉、可溶性(BDH/Merck製)
2 g 塩化ナトリウム
5 g 重炭酸ナトリウム
0.5 g 硫化ナトリウムXH2O
1MのHClまたは20%(v/v)のH2SO4を用いてpH8.5 に調整した。培地
の調製は厳密な嫌気性条件下に行った。大規模生育条件
容積20リッターのガラス製貯蔵ビン内でpH制御を行わず、65℃において、p
160 ガラス製分散管(最大孔径160 μm)から酸素を含有しない窒素で連続的に
散布を行ないながら、培養を行った。無菌培地に1%の予備生育培養物を接種し
た。18〜21時間、細胞を生育させたところ、光学密度(A600)は0.7 から0.8 と
なった。Sorvall RC3-B 遠心分離機を用いる連続的な遠心分離(5000rpm、20分間
、4℃)により細胞をハーベストした。代表的なバイオマス収量は3.2 〜3.2 g/
L(湿重量)であった。細胞ペーストは−20℃で貯蔵した。実施例2:酵素の抽出
(実施例1で得られた)細胞ペーストを緩衝液(0.05Mのトリス、0.005Mの
EDTA)に溶かして0.2 g/mlに稀釈した。得られた混合液を、0℃においてUl
trasonics 社製 model SP-958 中で3mmプローブを用いて50Wを3×10秒間印加
して超音波処理した。分解した細胞サスペンションを5℃において20分間、20,0
00rpm で遠心分離(Sorvall,ローターSM−24)した。得られた細胞ペレットを
緩衝液に再懸濁し、混合し、再び遠心分離した。2つの上清画分を一緒にした。
別の方法として、細胞の濃縮サスペンションを解凍し、6NのNaOHを添加
してpHを12に上げた。得られた混合物を室温で一晩インキュベートした。酸を
用いてpHを再調整しpH8〜10とし、得られた混合液を20,000rpm で20分間遠
心分離し、上清を集めた。実施例3:アミラーゼ酵素の精製
(実施例2で得られた)上清を、分子量10kDaのカットオフを有する膜を用
いCentriprep-30 装置(Amicon 製)で限外ろ過することにより1.5 〜2mlに濃縮
した。得られた濃縮タンパク質をHR16/60 Superdex-200カラムにかけてゲルろ
過を行い、1ml/分の流量で0.02Mのトリス緩衝液(pH8.5)を用いて溶出を行
った。アミラーゼ活性を含有する画分を集めて、HR5/5 MonoQカラムを用いる
イオン交換クロマトグラフィにかけた。0.02Mのトリス緩衝液(pH8.5)に溶か
した0〜2MのNaClの塩勾配を用い0.75 ml/分の流量でタンパク質を溶出さ
せた。アミラーゼ活性を有する2つの別々の画分が得られたので、これを一緒に
して0.02Mのトリス緩衝液(pH8.5)を用いて透析した。それぞれのアミラーゼ
タンパク質をさらにイオン交換クロマトグラフィにかけることによって更なる精
製を行った。アミラーゼ活性を有する2つの画分、アミラーゼA−Iおよびアミ
ラーゼA−IIが得られた。これらの2つのアミラーゼ成分をSDS−PAGEで
調べたところ、A−IおよびA−IIについてのサブユニット分子量は、それぞれ
、87kDaおよび83kDaであることが示された。実施例4:アミラーゼ活性の分析 方法1
改良ベルンフェルド(Bernfeld)分析を用いた(Bernfeld,P.(1955):「酵素学における方法(Methods in Enzymology,vol.1
)」(S.P.Colowick およ
びN.O.Kaplan編集)Academic Press 社発行、New York,149-158 頁)。425μ
lの緩衝液(0.05Mのトリス、0.005MのEDTA、0.0067MのNaCl〔20℃
においてpH8.5 、80℃においてpH8〕)、150μlの基質(0.05Mとトリス、
0.005MのEDTA、0.0067MのNaCl、1%(w/w)の可溶性トマトでん粉(Si
gma 製)、20℃においてpH8.5)、および0.002MのCaCl275μlを用いて80
℃において酵素サンプル100μlを20分間インキュベートした。展開液(0.4 M
のNaOHに溶かした1%(w/v)の3,5−ジニトロサリチル酸)を用いて反応
を停止させ、5分間沸とうさせた。この分析混合液を氷上で冷却し、550nm にお
ける吸光度を測定し、酵素の代わりにマルトースを用いて作製した検量線に基づ
いて値を読みとった。方法2
900μlの基質溶液(0.005 MのMES/HEPES/グリシン緩衝液
に溶かした1%(w/v)の可溶性でん粉)を用いて100μlの酵素をサンプルを70℃
において60分間インキュベートした。6NのHClを10μl添加して反応を停止
させ、1mlのヨウ素溶液(Sigma製、P700-2;3倍稀釈)を添加して展開し、100
μlの反応混合液を得た。620 nmにおいて水に対する吸光度を測定し、82650T
AU/gのα−アミラーゼ活性を有する標準α−アミラーゼ(Maxamyl S3)を用いて作
製した標準量線と比較した。方法3(アミラーゼA−I測定用)
条件は方法1と同じにした。但し、酵素サ
ンプルのインキュベーションは、650μlの基質(0.05 Mのトリス、1%(w/v)
の可溶性ポテトでん粉、0.0067MのNaCl、20℃におけるpH8.5)を用いて行
った。方法4(アミラーゼA−II測定用
) 条件は方法1と同じにした。但し、酵素サ
ンプルのインキュベーションは、650 μlの基質溶液(0.05 Mのトリス、1%(w
/v)の可溶性ポテトでん粉、0.002MのCaCl2、20℃におけるpH8.5 )を用い
て行った。実施例5:酵素活性に対する温度の影響
最初の試験として、実施例2に従った生育細胞から得られ、ゲルろ過クロマト
グラフィ(実施例3)によって分離された未精製酵素について、60℃から105 ℃
の範囲においてアミラーゼ活性を分析した。酵素活性の測定は、実施例4の方法
1に従い0.05Mのトリス緩衝液中で行った。この結果、活性の最適温度は95℃で
あることが示された(図2参照)。
第2の試験として、実施例3に従って得られた精製アミラーゼA−Iについて
65℃〜100 ℃における分析を行った。酵素活性の測定は実施例4の方法3に従っ
て行った。その結果、活性の最適温度は95℃であり、88℃〜99℃の範囲において
最大活性の50%が示された(図4参照)。
第3の試験として、実施例3により得られた精製アミラーゼA−IIについて65℃
〜100 ℃における分析を行った。酵素活性の測定は実施例4の方法に従って行わ
れた。この結果、活性の最適値は80℃であるが、<65℃から96℃の範囲にわたっ
て最大活性の50%が示されるという広いプロフィルが認められた(図6参照)。実施例6:酵素活性に対するpHの影響
最初の試験として、実施例2に従う生育細胞から得られゲルろ過クロマトグラ
フィ(実施例3)により分離された未精製酵素について、pH6.0 から10.8のp
H範囲においてアミラーゼ活性を測定した。酵素活性の測定は、実施例4の方法
1に従い、そして、pH範囲に応じてトリス緩衝液の代わりに適当な緩衝液(M
ES,HEPESまたはグリシン)を用いて80℃において行った。この結果、p
H7.5 からpH9.5 の間の広い範囲にわたって最適値があり、最大活性はpH8.
8 であった(図3参照)。
第2の試験として、実施例3に従って得られた精製アミラーゼA−Iについて
、適当な緩衝液(酢酸塩、MOPS,MES,トリス,HEPES,ジエタノー
ルアミンまたはグリシン)を用いて4.1 から11.4のpH範囲において分析を行っ
た。酵素活性の測定は、実施例4の方法3に従い80℃において実施した。その結
果、アミラーゼA−Iの活性の最適pHは10.2であることが示されている(図5
参照)。
第3の試験として、実施例3に従って得られた精製アミラーゼA−IIについて
、適当な緩衝液(酢酸塩、MOPS,MES,トリス,HEPES,ジエタノー
ルアミンまたはグリシン)を用い4.1 から11.4のpH範囲において分析を行った
。この結果が示すところによれば、アミラーゼA−IIの活性の最適pHは9.6 で
あり、pH8.1 から>pH11.5の範囲において最大活性の50%が認められる(図
7参照)。実施例7:アミラーゼのアミノ酸配列
実施例3により得られ、87kDaの分子量を有するアミラーゼA−IのN末端
アミノ酸配列を、EUROSEQUENCE(Groningen,オランダ)により測定した。帰属さ
れたN末端アミノ酸配列(添付の配列リストのSEQ ID No.2)は以下のとおりであ
る:
Xaa-Xaa-Glu-Ile-Tyr-Val/Asp-Gly-Phe(Xaa は任意のアミノ酸を示す)。
アミラーゼA−Iタンパク質の別のフラグメントは以下のようなアミノ酸配列(
添付の配列リストのSEQ ID No.3)を示した:
Tyr-Ile-Gly-Asp-Gly-Ala-(Trp)-Glu-Ala-Val-Leu-Glu-Gly-(Asp)-(Asp)-Gl
u-(Glu/Gly)-Phe-Tyr-Arg(カッコは、アミノ酸の同定が不確実であることを示
す)。
同様にして、実施例3により得られ、83kDaのタンパク質であるアミラーゼA
−IIは以下の部分的アミノ酸配列(添付の配列リストのSEQ ID No.4)を示した:
Ile-Gly-Leu-Pro-Ser-Val-Met-Thr-Glu-Pro-Trp-Asn-Pro-Ile-Gly-Gly-Ser-
Asn-(Trp)-Ile-Phe-Asp-Met-Met-Leu-Ile-(Arg)。実施例8:アミラーゼ遺伝子の単離
プラスミドpTZ18R(Mead,D.A.他(1998)Protein 1, 67)に、Tg9a株の
ゲノムライブラリーを作製した。HindIIIおよびEcoRIを用いてテル
モパリウム・ナトロノフィラム(Thermopallium natronophilum)Tg9Aの染色
体DNAを分解した。アガロースゲル電気泳動法により制限断片(フラグメント
)のサイズ分画を行い、1kbおよびそれより大きいフラグメントをゲルから単
離した。この画分を、ベクターpTZ18R由来のHindIII/EcoRI分
解DNAに連結(ライゲート)した。該連結体をエレクトロポレーションにより
大腸菌XL1 Blue MRFに形質転換した。組換えクローンをアミロース
清澄寒天上でスクリーニングした。LB培地で37℃において24時間増殖させた後
、該組換え菌株のアミラーゼ活性を測定した(Miller,J.H.(1972)、「分子遺
伝学実験法(Experiments in Molecular Genetics)」Cold Spring Harbor Labora
tory 発行、433 頁)。
組換え菌株のプラスミドDNAを単離し、制限分析法により挿入体(インサー
ト)の特性を調べることができる。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 FI
C12S 3/08 C12S 3/08
// D06L 1/00 D06L 1/00
D21C 9/10 D21C 9/10 Z
(C12N 9/28
C12R 1:01)
(C12P 21/02
C12R 1:01)
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,IT,L
U,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF
,CG,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,
SN,TD,TG),AP(KE,LS,MW,SD,S
Z,UG),UA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD
,RU,TJ,TM),AL,AM,AT,AU,AZ
,BB,BG,BR,BY,CA,CH,CN,CZ,
DE,DK,EE,ES,FI,GB,GE,HU,I
L,IS,JP,KE,KG,KP,KR,KZ,LK
,LR,LS,LT,LU,LV,MD,MG,MK,
MN,MW,MX,NO,NZ,PL,PT,RO,R
U,SD,SE,SG,SI,SK,TJ,TM,TR
,TT,UA,UG,US,UZ,VN
(72)発明者 ダンソン,マイケル ジョン
イギリス国 ビーエス18 3エイキュー
ソルトフォード グレンジ ロード 49
(72)発明者 ハフ,デイヴィッド ウィリアム
イギリス国 ビー12 2エイエックス バ
ス ブルームフィールド ロード 220
(72)発明者 トンプソン,カール レイモンド
イギリス国 ビー12 2エイワイ バス
バイオケミストリー デパートメント ユ
ニヴァーシティ オブ バス
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.テルモパリウム(Thermopallium)属のバクテリアから成る好熱姓で好アルカ リ性バクテリアの純粋培養物。 2.バクテリアがテルモパリウム・ナトロノフィラム(Thermppallium natronoph ilum) 種に属する請求の範囲1の好熱姓で好アルカリ性バクテリアの純粋培養物 。 3.バクテリアが、DSM9460として寄託されたテルモパリウム・ナトロノ フィラム(Thermopallium Natronophilum)株Tg9aである請求の範囲1の好熱 姓バクテリアの純水培養物。 4.16S rRNAの核酸配列が、SEQ ID No.1 の16S rRNA遺伝子配列に 対して92〜100 %の同一性を示すバクテリアの純粋培養物。 5.16S rRNAの核酸配列が、SEQ ID No.1 、16S rRNA遺伝子配列に 対して95〜100 %の同一性を示すバクテリアの純粋培養物。 6.バクテリアが好熱姓または好熱姓である請求の範囲5のバクテリアの純粋培 養物。 7.請求の範囲1〜6のいずれかのバクテリアから得られるポリペプチドであっ て、該ポリペプチドを産生する能力のあるバクテリアを該ポリペプチド産生を導 くような条件下で培養し、該ポリペプチドを回収することによって得られるポリ ペプチド。 8.ポリペプチドが酵素である請求項7のポリペプチド。 9.酵素がアミラーゼまたはプルラナーゼである請求の範囲8のポリペプチド。 10.(a) SEQ ID No.2 に示されるN末端アミノ酸配列、またはSEQ ID No.3 に 示される内部アミノ酸配列、または(b) 1つまたはそれ以上のアミノ酸の欠失、 置換または挿入によって相違し、プルラナーゼ活性を有するその変異体から成る 単離されたアルカリプルラナーゼ。 11.(a) SEQ ID No.4 によって示される内部アミノ酸配列、または(b) 1つま たはそれ以上のアミノ酸の欠失、置換または挿入によって相違し、アミラーゼ活 性を有するその変異体から成る単離されたアルカリアミラーゼ。 12.請求の範囲7〜9に記載されたポリペプチド、請求の範囲10に記載された アミラーゼを含む組成物。 13.組成物が洗剤組成物である請求の範囲12の組成物。 14.請求の範囲7〜9に記載のポリペプチド、請求の範囲10に記載のプルラナ ーゼ、または請求の範囲11に記載のアミラーゼを得るための方法であって、(a) 請求の範囲1〜6に従うバクテリアを培養し、(b) 請求の範囲7〜9に記載のポ リペプチド、請求の範囲10に記載のアミラーゼを含む画分を回収することを含む 方法。 15.請求の範囲11または12に従う組成物を製造する方法であって、(a) 請求の 範囲1〜6に従うバクテリアを培養し、(b) 請求の範囲7〜9に記載のポリペプ チド、請求の範囲10に記載のプルラナーゼ、または請求の範囲11に記載のアミラ ーゼを含む画分を回収することを含む方法。 16.請求の範囲7〜9に従うポリペプチド、またはSEQ ID No.2,3 もしくは4 に示されるアミノ酸配列を有する酵素をコードする単離された核酸。 17.請求の範囲16に従う核酸を含む組換え核酸。 18.請求の範囲17に従う組換え核酸を含む宿主細胞。 19.請求の範囲7〜9に従うポリペプチド、請求の範囲10に記載のプルラナー ゼ、または請求の範囲11に記載のアミラーゼを製造する方法であって、(a) 請求 の範囲18に従う宿主細胞を培養することによって、該ポリペプチド、プルラナー ゼまたはアミラーゼを発現させ、(b) 得られたポリペプヂド、プルラナーゼまた はアミラーゼを回収することを含む方法。 20.請求の範囲7〜9に従うポリペプチド、請求の範囲9に記載のプルラナー ゼ、または請求の範囲10に記載のアミラーゼの、紙もしくはパルプ製造、織物の 製造または洗剤組成物の調製における使用。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP95202477 | 1995-09-13 | ||
EP95202477.6 | 1995-09-13 | ||
PCT/EP1996/003896 WO1997010342A1 (en) | 1995-09-13 | 1996-09-03 | Alkaliphilic and thermophilic microorganisms and enzymes obtained therefrom |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH11514219A true JPH11514219A (ja) | 1999-12-07 |
Family
ID=8220630
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP9511624A Pending JPH11514219A (ja) | 1995-09-13 | 1996-09-03 | 好アルカリ性で好熱姓の微生物およびそれから得られる酵素 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US6218164B1 (ja) |
EP (1) | EP0850307B1 (ja) |
JP (1) | JPH11514219A (ja) |
CN (1) | CN1199424A (ja) |
AT (1) | ATE309373T1 (ja) |
AU (1) | AU714478B2 (ja) |
CA (1) | CA2231843A1 (ja) |
DE (1) | DE69635419T2 (ja) |
DK (1) | DK0850307T3 (ja) |
NZ (1) | NZ319118A (ja) |
WO (1) | WO1997010342A1 (ja) |
Families Citing this family (70)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
PL366249A1 (en) * | 2000-07-28 | 2005-01-24 | Henkel Kommanditgesellschaft Auf Aktien | Novel amylolytic enzyme extracted from bacillus sp. a 7-7 (dsm 12368) and washing and cleaning agents containing this novel amylolytic enzyme |
US6887636B2 (en) * | 2001-05-31 | 2005-05-03 | Ricoh Company, Ltd. | Toner for two-component developer, image forming method and device for developing electrostatic latent image |
US8809031B2 (en) * | 2007-03-23 | 2014-08-19 | Danisco Us Inc. | Enhanced amylase production by N-terminal addition to mature amylase protein |
TWI375451B (en) | 2007-11-08 | 2012-10-21 | Htc Corp | Method for displaying speed dial information and device using the method |
DK3110833T3 (da) | 2013-05-29 | 2020-04-06 | Danisco Us Inc | Hidtil ukendte metalloproteaser |
WO2014194117A2 (en) | 2013-05-29 | 2014-12-04 | Danisco Us Inc. | Novel metalloproteases |
EP3260538B1 (en) | 2013-05-29 | 2021-04-14 | Danisco US Inc. | Novel metalloproteases |
WO2014194032A1 (en) | 2013-05-29 | 2014-12-04 | Danisco Us Inc. | Novel metalloproteases |
DK3080262T3 (da) | 2013-12-13 | 2019-05-06 | Danisco Us Inc | Serinproteaser af bacillus-arter |
DK3553173T3 (da) | 2013-12-13 | 2021-08-23 | Danisco Us Inc | Serinproteaser af bacillus gibsonii-clade |
EP3083704B1 (en) | 2013-12-16 | 2022-08-17 | Nutrition & Biosciences USA 4, Inc. | Use of poly alpha-1,3-glucan ethers as viscosity modifiers |
BR112016014014B1 (pt) | 2013-12-18 | 2021-08-10 | Nutrition & Biosciences USA 4, Inc. | Composição, método para a produção de um composto e método para o tratamento de um material |
US20150232785A1 (en) | 2014-02-14 | 2015-08-20 | E I Du Pont De Nemours And Company | Polysaccharides for viscosity modification |
US9695253B2 (en) | 2014-03-11 | 2017-07-04 | E I Du Pont De Nemours And Company | Oxidized poly alpha-1,3-glucan |
EP4155398A1 (en) | 2014-03-21 | 2023-03-29 | Danisco US Inc. | Serine proteases of bacillus species |
US9714403B2 (en) | 2014-06-19 | 2017-07-25 | E I Du Pont De Nemours And Company | Compositions containing one or more poly alpha-1,3-glucan ether compounds |
WO2015195777A1 (en) | 2014-06-19 | 2015-12-23 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Compositions containing one or more poly alpha-1,3-glucan ether compounds |
WO2016061438A1 (en) | 2014-10-17 | 2016-04-21 | Danisco Us Inc. | Serine proteases of bacillus species |
DK3212662T3 (da) | 2014-10-27 | 2020-07-20 | Danisco Us Inc | Serinproteaser |
US20170335306A1 (en) | 2014-10-27 | 2017-11-23 | Danisco Us Inc. | Serine proteases |
WO2016069544A1 (en) | 2014-10-27 | 2016-05-06 | Danisco Us Inc. | Serine proteases |
WO2016069569A2 (en) | 2014-10-27 | 2016-05-06 | Danisco Us Inc. | Serine proteases |
WO2016069557A1 (en) | 2014-10-27 | 2016-05-06 | Danisco Us Inc. | Serine proteases of bacillus species |
US10131929B2 (en) | 2014-12-23 | 2018-11-20 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Enzymatically produced cellulose |
RU2733987C2 (ru) | 2015-05-13 | 2020-10-09 | ДАНИСКО ЮЭс ИНК. | Варианты протеазы клады aprl и их применения |
FI3307427T3 (fi) | 2015-06-09 | 2023-11-09 | Danisco Us Inc | Osmoottiset puhkeavat kapselit |
WO2016201069A1 (en) | 2015-06-09 | 2016-12-15 | Danisco Us Inc | Low-density enzyme-containing particles |
WO2016201040A1 (en) | 2015-06-09 | 2016-12-15 | Danisco Us Inc. | Water-triggered enzyme suspension |
CN107849549B (zh) | 2015-06-17 | 2024-04-05 | 丹尼斯科美国公司 | 吉氏芽孢杆菌进化枝丝氨酸蛋白酶 |
US20180320158A1 (en) | 2015-11-05 | 2018-11-08 | Danisco Us Inc. | Paenibacillus and bacillus spp. mannanases |
BR112018008946A2 (pt) | 2015-11-05 | 2020-11-03 | Danisco Us Inc. | mananases de paenibacillus sp. |
EP3374400B1 (en) | 2015-11-13 | 2022-04-13 | Nutrition & Biosciences USA 4, Inc. | Glucan fiber compositions for use in laundry care and fabric care |
JP2019504932A (ja) | 2015-11-13 | 2019-02-21 | イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニーE.I.Du Pont De Nemours And Company | 洗濯ケアおよび織物ケアにおいて使用するためのグルカン繊維組成物 |
WO2017083226A1 (en) | 2015-11-13 | 2017-05-18 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Glucan fiber compositions for use in laundry care and fabric care |
WO2017100720A1 (en) | 2015-12-09 | 2017-06-15 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylase combinatorial variants |
WO2017106676A1 (en) | 2015-12-18 | 2017-06-22 | Danisco Us Inc | Polypeptides with endoglucanase activity and uses thereof |
CN109715791B (zh) | 2016-05-03 | 2023-07-14 | 丹尼斯科美国公司 | 蛋白酶变体及其用途 |
US20190136218A1 (en) | 2016-05-05 | 2019-05-09 | Danisco Us Inc | Protease variants and uses thereof |
US11661567B2 (en) | 2016-05-31 | 2023-05-30 | Danisco Us Inc. | Protease variants and uses thereof |
MX2018015559A (es) | 2016-06-17 | 2019-06-06 | Danisco Us Inc | Variantes de proteasa y sus usos. |
EP3535365A2 (en) | 2016-11-07 | 2019-09-11 | Danisco US Inc. | Laundry detergent composition |
WO2018118917A1 (en) | 2016-12-21 | 2018-06-28 | Danisco Us Inc. | Protease variants and uses thereof |
CN110312794B (zh) | 2016-12-21 | 2024-04-12 | 丹尼斯科美国公司 | 吉氏芽孢杆菌进化枝丝氨酸蛋白酶 |
WO2018169750A1 (en) | 2017-03-15 | 2018-09-20 | Danisco Us Inc | Trypsin-like serine proteases and uses thereof |
US20200040283A1 (en) | 2017-03-31 | 2020-02-06 | Danisco Us Inc | Delayed release enzyme formulations for bleach-containing detergents |
WO2019006077A1 (en) | 2017-06-30 | 2019-01-03 | Danisco Us Inc | PARTICLES CONTAINING LOW AGGLOMERATION ENZYME |
CN111373039A (zh) | 2017-11-29 | 2020-07-03 | 丹尼斯科美国公司 | 具有改善的稳定性的枯草杆菌蛋白酶变体 |
CA3086202A1 (en) | 2017-12-21 | 2019-06-27 | Danisco Us Inc. | Enzyme-containing, hot-melt granules comprising a thermotolerant desiccant |
CN111867388A (zh) | 2018-02-08 | 2020-10-30 | 丹尼斯科美国公司 | 用于酶包封的耐热蜡基质颗粒 |
US20210363470A1 (en) | 2018-06-19 | 2021-11-25 | Danisco Us Inc | Subtilisin variants |
US20210214703A1 (en) | 2018-06-19 | 2021-07-15 | Danisco Us Inc | Subtilisin variants |
EP3844255A1 (en) | 2018-08-30 | 2021-07-07 | Danisco US Inc. | Enzyme-containing granules |
JP2022503923A (ja) | 2018-09-27 | 2022-01-12 | ダニスコ・ユーエス・インク | 医療用器具を洗浄するための組成物 |
EP3887515A1 (en) | 2018-11-28 | 2021-10-06 | Danisco US Inc. | Subtilisin variants having improved stability |
CN114174504A (zh) | 2019-05-24 | 2022-03-11 | 丹尼斯科美国公司 | 枯草杆菌蛋白酶变体和使用方法 |
WO2020247582A1 (en) | 2019-06-06 | 2020-12-10 | Danisco Us Inc | Methods and compositions for cleaning |
CN116323935A (zh) | 2020-08-27 | 2023-06-23 | 丹尼斯科美国公司 | 用于清洁的酶和酶组合物 |
EP4284906A1 (en) | 2021-01-29 | 2023-12-06 | Danisco US Inc. | Compositions for cleaning and methods related thereto |
CN117616120A (zh) | 2021-06-30 | 2024-02-27 | 丹尼斯科美国公司 | 变体脂肪酶及其用途 |
EP4396320A2 (en) | 2021-09-03 | 2024-07-10 | Danisco US Inc. | Laundry compositions for cleaning |
WO2023039270A2 (en) | 2021-09-13 | 2023-03-16 | Danisco Us Inc. | Bioactive-containing granules |
WO2023114939A2 (en) | 2021-12-16 | 2023-06-22 | Danisco Us Inc. | Subtilisin variants and methods of use |
WO2023114936A2 (en) | 2021-12-16 | 2023-06-22 | Danisco Us Inc. | Subtilisin variants and methods of use |
WO2023114932A2 (en) | 2021-12-16 | 2023-06-22 | Danisco Us Inc. | Subtilisin variants and methods of use |
WO2023168234A1 (en) | 2022-03-01 | 2023-09-07 | Danisco Us Inc. | Enzymes and enzyme compositions for cleaning |
WO2023250301A1 (en) | 2022-06-21 | 2023-12-28 | Danisco Us Inc. | Methods and compositions for cleaning comprising a polypeptide having thermolysin activity |
WO2024050346A1 (en) | 2022-09-02 | 2024-03-07 | Danisco Us Inc. | Detergent compositions and methods related thereto |
WO2024050343A1 (en) | 2022-09-02 | 2024-03-07 | Danisco Us Inc. | Subtilisin variants and methods related thereto |
WO2024050339A1 (en) | 2022-09-02 | 2024-03-07 | Danisco Us Inc. | Mannanase variants and methods of use |
WO2024102698A1 (en) | 2022-11-09 | 2024-05-16 | Danisco Us Inc. | Subtilisin variants and methods of use |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4628031A (en) * | 1984-09-18 | 1986-12-09 | Michigan Biotechnology Institute | Thermostable starch converting enzymes |
DE3712051A1 (de) * | 1987-04-09 | 1988-10-27 | Antranikian Garabed | Thermostabile amylasen und pullulanasen aus 2 anaeroben mikroorganismen |
US5055403A (en) * | 1989-06-26 | 1991-10-08 | Enzyme Bio-Systems, Ltd. | Thermoduric and aciduric pullulanase enzyme and method for its production |
DE69032360T2 (de) * | 1989-06-29 | 1998-12-03 | Genencor International, Inc., Rochester, N.Y. | Mutierte mikrobielle alpha-Amylasen mit erhöhter thermischer, saurer und/oder alkylischer Stabilität |
DK47291D0 (da) * | 1991-03-15 | 1991-03-15 | Novo Nordisk As | Pullulanase |
ES2137222T3 (es) * | 1992-12-28 | 1999-12-16 | Genencor Int | Polulanasa, microorganismos que la producen, procedimientos para la preparacion de la misma y utilizaciones. |
-
1996
- 1996-09-03 NZ NZ319118A patent/NZ319118A/xx unknown
- 1996-09-03 EP EP96932476A patent/EP0850307B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-09-03 US US09/029,937 patent/US6218164B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-09-03 JP JP9511624A patent/JPH11514219A/ja active Pending
- 1996-09-03 CA CA002231843A patent/CA2231843A1/en not_active Abandoned
- 1996-09-03 CN CN96196945A patent/CN1199424A/zh active Pending
- 1996-09-03 WO PCT/EP1996/003896 patent/WO1997010342A1/en active IP Right Grant
- 1996-09-03 AU AU71266/96A patent/AU714478B2/en not_active Ceased
- 1996-09-03 AT AT96932476T patent/ATE309373T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-09-03 DE DE69635419T patent/DE69635419T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-09-03 DK DK96932476T patent/DK0850307T3/da active
-
2000
- 2000-10-30 US US09/699,754 patent/US6432689B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2002
- 2002-06-18 US US10/176,417 patent/US20040033580A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU7126696A (en) | 1997-04-01 |
EP0850307B1 (en) | 2005-11-09 |
US6218164B1 (en) | 2001-04-17 |
CA2231843A1 (en) | 1997-03-20 |
DE69635419D1 (de) | 2005-12-15 |
WO1997010342A1 (en) | 1997-03-20 |
DK0850307T3 (da) | 2006-03-06 |
AU714478B2 (en) | 2000-01-06 |
US20040033580A1 (en) | 2004-02-19 |
ATE309373T1 (de) | 2005-11-15 |
NZ319118A (en) | 2000-01-28 |
EP0850307A1 (en) | 1998-07-01 |
DE69635419T2 (de) | 2006-07-13 |
US6432689B1 (en) | 2002-08-13 |
CN1199424A (zh) | 1998-11-18 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JPH11514219A (ja) | 好アルカリ性で好熱姓の微生物およびそれから得られる酵素 | |
Ghani et al. | Isolation and characterization of different strains of Bacillus licheniformis for the production of commercially significant enzymes | |
JP3086249B2 (ja) | 熱、酸及び/またはアルカリに高い安定性を有する細菌由来突然変異体α―アミラーゼ | |
Joyet et al. | Hyperthermostable variants of a highly thermostable alpha-amylase | |
Van Truong et al. | Cloning of two pectate lyase genes from the marine Antarctic bacterium Pseudoalteromonas haloplanktis strain ANT/505 and characterization of the enzymes | |
Feng et al. | Fermentation of starch for enhanced alkaline protease production by constructing an alkalophilic Bacillus pumilus strain | |
DK162776B (da) | Ekspressionsvektor indeholdende et amylasekodningsgen og fremgangsmaade til fremstilling deraf, genetisk konstruerede mikroorganismer med evne til massiv produktion af amylolytiske enzymer og fremgangsmaade til fremstilling af saadanne enzymer | |
WO1992002614A1 (en) | Novel thermostable pullulanases | |
Satoh et al. | Purification, characterization, and nucleotide sequence of an intracellular maltotriose-producing alpha-amylase from Streptococcus bovis 148 | |
KR101062978B1 (ko) | 신균주 페니실륨 피노필럼 kmj601 유래 엔도글루카네이즈의 생산 최적화 및 유전자 클로닝 | |
US5418156A (en) | Agarase enzyme system from alteromonas strain 2-40 | |
JP4259169B2 (ja) | 新規α−1,2−マンノシダーゼおよびその遺伝子、ならびに該酵素を用いたα−マンノシル糖化合物の製造方法 | |
JP3025625B2 (ja) | アルカリα−アミラーゼ活性を有するアルカリプルラナーゼ遺伝子 | |
NO320159B1 (no) | Framgangsmate og celle for framstilling av akariogent sukker | |
Kobayashi et al. | Bifunctional pectinolytic enzyme with separate pectate lyase and pectin methylesterase domains from an alkaliphilic Bacillus | |
JP2003210182A (ja) | 好熱性エンドグルカナーゼ | |
JP4380874B2 (ja) | アルカリセルラーゼ遺伝子 | |
JP4372986B2 (ja) | アルカリプルラナーゼ | |
JP4358984B2 (ja) | アルカリセルラーゼ遺伝子 | |
LU502063B1 (en) | USE OF CitT PROTEIN OR CitT PROTEIN-ENCODING GENE IN REGULATING EFFICIENCY OF RAMIE DEGUMMING BY MICROORGANISMS | |
JP2913411B2 (ja) | セルラーゼ遺伝子 | |
JP2002085078A (ja) | アルカリセルラーゼ遺伝子 | |
JPH07143880A (ja) | 超耐熱性α−アミラーゼ遺伝子 | |
JP2001258577A (ja) | ポリガラクツロナーゼ | |
KR101102010B1 (ko) | 신규 미생물 정읍피아 내장산에시스 및 상기 미생물 유래의 셀룰로오스 유전자 |