JP3086249B2 - 熱、酸及び／またはアルカリに高い安定性を有する細菌由来突然変異体α―アミラーゼ - Google Patents

熱、酸及び／またはアルカリに高い安定性を有する細菌由来突然変異体α―アミラーゼ

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Description

【発明の詳細な説明】 導入 技術分野 本発明は遺伝子操作技術分野に関し、α−アミラーゼ
活性を持つ酵素をコードするDNA配列を含む新しいDNA分
子に関する。具体的には、澱粉の分解や繊維の糊抜き、
他の工業的工程の使用に優れた特長を有する細菌由来突
然変異体α−アミラーゼが開示される。この開示された
α−アミラーゼは温度、酸及びアルカリに対し高い安定
性を示し、それにより今まで使われなかった工程におい
ても理想的に適した活性を示すことができる。
背景技術 澱粉はアミロース（15−30％重量／重量）と、アミロ
ペクチン（70−85％重量／重量）の混合物からなる。ア
ミロースは約60000から800000の分子量を持つ直鎖のα
−１、４−結合グルコース単位から成る。アミロペクチ
ンは、24−30グルコース単位ごとにα−１、６分岐点を
もつ分枝状高分子であり、分子量は１億に達すると思わ
れる。
澱粉由来の糖は、濃縮ブドウ糖シロップの形で、現
在、（１）α−アミラーゼを用い固体澱粉を平均約７−
10の重合度を持つデキストリンへ液化（または稀薄化
（thinning））する工程、及び（２）生じた液化澱粉
（すなわち澱粉水解物）をアミログルコシダーゼ（グル
コアミラーゼまたはAGとも呼ぶ）を用いて糖化する工程
を含む酵素触媒方法で生産されている。生じたシロップ
は高濃度のブドウ糖を含む。工業的に生産したブドウ糖
シロップの多くは次に酵素的にイソシロップというブド
ウ糖／フルクトースの混合物へと異性化される。
α−アミラーゼ（EC 3.2.1.1）は、澱粉とグリコー
ゲン、類縁の多糖類を内部のα−１、４−グルコシド結
合を不規則に切断することによって加水分解する。この
酵素は、例えば糖、醸造、アルコール、繊維産業などに
おいて多数の重要な工業的応用が図られている。α−ア
ミラーゼは、種々の細菌、真菌類、植物、動物から単離
される。工業的に最も重要なα−アミラーゼは枯草菌
（Bacilli）から単離されるものである。
澱粉の加水分解過程の第一段階では、澱粉スラリーは
比較的高い温度（110度）まで熱することによりゼラチ
ン化する。ゼラチン化した澱粉は、連続した２段階の工
程で熱に安定なα−アミラーゼにより液化されデキスト
リン化される。主要な変動因子は澱粉濃度、α−アミラ
ーゼ量、温度そしてpHである。液化−デキストリン化反
応では良い転換比率を得るために変動因子を狭い範囲に
保つ必要がある。さもなくば濾過の際重大な問題を生じ
るからである。例えば、コッカー（L.E.Coker）とフェ
ンカッタズブラマニアン（K.Venkatasubramanian）、バ
イオテクノロジー、165−171頁、シェレミシノフ（P.N.
Cheremisinoff）、ケレット（P.B.Quellette）編、テク
ニコム出版（株）ランカスター、1985年）参照。頻繁に
生じる問題の１つは分解過程の初期段階の適当な温度調
節である。すなわち過熱によりα−アミラーゼが変性し
最終の稀薄化が不充分になる。これを防ぐ１つの方法
は、さらに高い熱安定性のα−アミラーゼを用いること
である。
そのためにカルシウムイオンや両親媒性化合物（例え
ばEP−Ａ−0189838参照）を加えることが提案されてき
た。しかしこの解決法は不満足な結果に終わったようで
ある。
従ってなおさら本質的に、より高い熱安定性をもった
α−アミラーゼを用いることに興味がもたれる。
関連文献 EP−Ａ−057976では、熱安定なバチルス（Ｂ）．ステ
アロテモルフィルスからのα−アミラーゼをコードする
遺伝子の単離、そしてその遺伝子は枯草菌または大腸菌
の複製開始部位を含むプラスミドに組み込んであること
について述べている。α−アミラーゼを産生するのにそ
のようなキメラのプラスミドが用いられる。該α−アミ
ラーゼ遺伝子は、単離後修飾を施さずに使われた。
EP−Ａ−0134048では、工業的に用いられる枯草菌株
の１つ以上のα−アミラーゼ遺伝子をクローン化し発現
することにより、α−アミラーゼをとりわけ工業的に多
量に生産する方法について述べている。
EP−Ａ−252666では、一般にＱ−Ｒ−Ｌと書かれるキ
メラのα−アミラーゼについて説明している。（式中、
Ｑは、B.アミロリクエファシエンス由来α−アミラーゼ
のＮ末37個のアミノ酸残基と最低75％一致するＮ末の55
から60個のアミノ酸残基を示し、Ｒは付け加えられたポ
リペプチドを示し、ＬはB.リケニホルミスのα−アミラ
ーゼのＣ末395個のアミノ酸残基と最低75％のホモロジ
ーをもつ390から400個からなるＣ末のポリペプチドを示
す）。
グレイらは（ジャーナル オブ バクテリオロジー、
166号、635頁、1986年）B.ステアロテルモルフィルスの
α−アミラーゼのアミノ末端部位とB.リケニフォルミス
のα−アミラーゼのＣ末端部位からなるキメラα−アミ
ラーゼについて報告している。ほとんどのハイブリッド
酵素は親株の酵素より不安定であることが示されてい
る。さらにいずれのハイブリッド酵素についても、より
高い安定性を有することは示されていない。
上に利用した関連文献のうち新規なα−アミラーゼを
得るために単一アミノ酸置換を利用したものは全くな
い。
EP−Ａ−0285123は、塩基配列の完全な突然変異の方
法を開示している。B.ステアロテルモフィルスのα−ア
ミラーゼが突然変異の例として説明されている。この方
法はこれまでより高い安定性をもつB.ステアロモルフィ
ルスのα−アミラーゼの変異体を得るのに用いることが
できると示唆しているが、例はあげられていない。
発明の要約 本発明では、変異体α−アミラーゼ及びその様な変異
体の生産方法について述べる。該変異体α−アミラーゼ
は野生型α−アミラーゼと少なくともアミノ酸１つが異
なることを特徴とする。さらに、これらの変異体をコー
ドするDNAと、これらのDNAを発現可能な形で含むベクタ
ー、及び該ベクターを含む宿主細胞について報告する。
本発明の第一の態様として、クローン化されたα−ア
ミラーゼ遺伝子の不規則突然変異が開示される。該変異
遺伝子は、適当なベクター系を用いて適したホストの細
菌中で発現させる。
発明の第２の態様として、変異体α−アミラーゼをス
クリーニングする方法を説明し応用する。該方法は、よ
り熱安定でより酸耐性のα−アミラーゼを産生する。さ
らに、この方法は、わずかに修正することによりアルカ
リ耐性のα−アミラーゼを得るのにも用いられる。その
ように検出されたクローンの発現産物は、単離、精製さ
れる。
本発明の第三の態様として、熱安定性が上昇し、これ
ら変異体α−アミラーゼを澱粉分解に用いる条件下での
濾過の問題を減少させたα−アミラーゼが提供される。
本発明の第４の態様として、酸耐性が上昇し、マルチ
ュロースなどの好ましくない副産物の生成を減少させ、
それと同時にアミログルコシダーゼとの反応の前に加え
る酸の量を減少させたα−アミラーゼが提供される。新
しいα−アミラーゼは、熱安定性と酸耐性の点で、ある
いは熱安定とアルカリ耐性の点で好ましくは両者の優れ
た性質を有する。
本発明の第５の態様としては、変異蛋白が澱粉の液化
に用いる条件下でより良い効率を示すことである。該ア
ルカリ耐性は特に繊維糊抜きへの応用に有用である。こ
れらの点は後述する発明の開示と実施例でさらに説明さ
れる。
図面の簡単な説明 図1:pMa5−８のヌクレオチド配列 スタンセンら、1987年、エンボラボラトリ−コースマ
ルチンスリード、1987年７月。別のプラスミドの説明に
関しては本文参照。
図2:プラスミドpPROM SPO2 インサートのヌクレオチ
ド配列 このベクターの構造はEP−Ａ−0224294で説明されて
いる。α−アミラーゼのアミノ酸配列はトリプレットの
下に書かれている。番号付けは成熟蛋白の最初のアミノ
酸から始まっている（クーンら、ジャーナルオブバクテ
リオロジー、194巻:372頁）。SPO2プロモーター挿入配
列（insert）は61番目から344番目までに組み込まれて
いる。
図3:pMaTLia6のヌクレオチド配列 このベクターはpMa5−８と、pPROM SPO2の挿入配
列、そしてTACプロモーターをコードする合成DNAフラグ
メントから成る。TACプロモーターDNAフラグメントは37
57番目から3859番目までに組み込まれている。α−アミ
ラーゼのアミノ酸配列はトリプレットの下に示す。
図4:pMaTLia6の制限酵素地図 次の各１箇所の制限酵素切断部位がα−アミラーゼ遺
伝子中のギャップ形成に利用可能である:BamH I、Spe
I、Sac II,Kpn I、Cla I、Nar I、Sal I、Thtlll I、Xm
a III、そしてBstE II。変異配列を容易に決定するため
に可能性のある全ての切断部位に対するシークエンシン
グプライマーを合成した。プラスミドpMcTLia6はpMaTLi
a6とアンピシリン遺伝子中にアンバーコドンが存在する
こと（Sca I部位を除いた）とクロラムフェニコール遺
伝子中にアンバーコドンを含まないこと（Pvu II部位の
存在に伴い）を除いて同一である。
図5:枯草菌／大腸菌のシャトルベクターpMa/cの概略 （左）pMa/c部分は大腸菌に簡便に突然変異を起こす
のを可能にする。（右）バチルスズブチリスの遺伝子単
位（cassette）はα−アミラーゼ遺伝子（または他の枯
草菌遺伝子）とバチルスズブチリスの増殖に最小限のレ
プリコンを含む。大腸菌での突然変異が成功した後はバ
チルスズブチリス遺伝子単位は枯草菌にトランスフォー
メーションする際環状化し、SPO2プロモーターをα−ア
ミラーゼ遺伝子の前に動かすことができる。
図6:pBMa/c1の制限酵素地図 このベクターは図５に示した突然変異発現ベクターの
具体的な例である。（１）及び（２）：マルチプルクロ
ーニングサイト。目的の遺伝子は（２）に組み込まれて
いる。（１）と（２）で制限酵素位置を変えることによ
り２本鎖へのギャップ形成のために便利な制限酵素部位
を構築することができる;FDT:転写終結位置 F1.ORI:ファージF1由来複製開始領域 E.coli ORI:pBR322の複製開始領域 BLA:アンピシリン耐性遺伝子 CAT:クロラムフェニコール耐性遺伝子 BAC ORI:pUB110の複製開始領域 KANAMAYCIN:pUB110のカナマイシン（メオマイシン）
耐性遺伝子 SPO2:ファージSPO2のプロモーター 図7:pBMa/c6Lia6の制限酵素地図 バチルスリケニホルミスのα−アミラーゼ遺伝子を図
６のpMa/c1のマルチプルクローニングサイト（２）に組
み込んだ。この図ではSPO2のプロモーターは（２）と、
大腸菌のORIは（４）と表されている。
図8:pMa/cTPLia6中のPhoAのシグナル配列断片の配列 TACプロモーターの上流のEcoR I部位から成熟α−ア
ミラーゼの最初のアミノ酸までを示してある。phoAのア
ミノ酸配列はDNA配列の下に示す。
図9:野生型と2D5α−アミラーゼのミカエリスメンテン
プロット このグラフは基質濃度に対する酵素活性の初速度を野
生型α−アミラーゼと2D5α−アミラーゼについて表し
たものである。アッセイ条件は実施例８に説明する。
図10:野生型α−アミラーゼとD7α−アミラーゼの熱失
活 このプロットはpH5.5,90.5℃において野生型とD7α−
アミラーゼ両方の半減期をCa2+濃度の関数として表して
いる。
図11:野生型及びD7α−アミラーゼの熱失活 pHが7.0であるのを除き図10と同様。
図12:野性型及び2D5α−アミラーゼの熱失活 このプロットはpH7.0,95℃での親株及び2D5α−アミ
ラーゼ両方の半減期をCa2+濃度の関数として表してい
る。
図13:野生型及びD7α−アミラーゼの熱失活のpH依存性 図14:野生型及び2D5α−アミラーゼの熱失活のpH依存性 図15:110℃での液化後に測定した最終pHに対するDE 発明の詳細な説明 本説明中、「変異体α−アミラーゼ」に関連して「性
質が向上した」と呼ぶ場合、高い酵素活性、または澱粉
液化、繊維の糊抜き、または他の工業的生産への応用で
の条件下で長い半減期を有するα−アミラーゼを意味す
る。
「高い熱安定性」を有するとは、変異体酵素が高い温
度の工程で活性を保持する、あるいはその変異体酵素が
由来する野生型の酵素より、同じ温度においてより長時
間活性を保持することを意味する。
「高い酸（あるいはアルカリ）安定性」を持つとは、
変異体酵素がより低い（あるいは高い）pH値でその野生
型の酵素より高い活性を示すことを意味する。
向上した性質は１つか２つのアミノ酸の置換により生
じたものであることを理解すべきである。
染色体DNAはα−アミラーゼを含む微生物から単離で
きる。好ましくは枯草菌属に属する細菌、さらに好まし
くはバチルス リケニホルミス、さらにより好ましくは
バチルス リケニホルミス T5を用いる（EP−Ａ−1340
48参照）。染色体DNAは適当な制限酵素で消化し、ベク
ターにクローン化した。クローンの選択にはハイブリダ
イゼイション、免疫学的検出、酵素活性の検出など多く
の方法を用いることができる。制限酵素消化した染色体
DNAをクローニングするのに用いるベクターの選択は、
使用可能なクローン選択の方法に依存する。もしハイブ
リダイゼイションを用いるなら何も注意は必要でない。
しかし、もし検出が免疫学的なものまたは酵素活性に基
づいたものであるならベクターは適当な発現シグナルを
含んでいなければならない。α−アミラーゼを含むクロ
ーンの実際の検出は、澱粉を含む寒天プレート上で行っ
た。ヨード蒸気存在下で増殖、培養した後ポジティブク
ローンの周りちハロー（halo）が検出される。次の段階
として遺伝子の配列を決定する。そこから得られたアミ
ノ酸配列を、重要なアミノ酸についての最初の情報を得
るために他の既知のα−アミラーゼの配列と比較するの
に用いる（例 活性部位、Ca2+結合、Ｓ−Ｓ結合の可能
性など）。３次元構造を決定するとさらに詳しい情報が
得られる。これはしばしば手間がかかるので他の方法が
用いられる。３次元構造がなくとも２次元構造要素
（例．α−ヘリックス、β−シート）を決定する予測プ
ログラムをうまく用い最終的に３次元構造要素、例えば
ベータバレル（β−barrel）を決定できる。総説として
ジャニンとオダック、プログレス イン バイオフィジ
ックス アンド モレキュラーバイオロジー、42巻、21
−78頁、1983年がある。
重要なアミノ酸の置換を予想することができる。蛋白
質の構造の安定性は蛋白質の折りたたまれた部分と伸び
た部分の間の自由エネルギーの合計差により決定され
る。プロリン残基は他のアミノ酸よりとれる構造が限ら
れているのでアミノ酸がプロリンに置換されているとき
には蛋白質を伸ばそうとする空間配置上のエントロピー
は減少する（そしてそれにより安定性は上昇する）。別
の有用な置換はグリシンをアラニンに置換することであ
る。分枝したβ−炭素を持つトレオニン、バリン、イソ
ロイシンなどの残基は分枝していない残基よりも骨格の
コンフォメーションを制限する。
ある種の蛋白の熱安定性は部分的には塩橋によるので
リジンとアルギニン残基を導入することは有用かもしれ
ない（トモジックとクリバノフ、ジャーナル オブ バ
イオロジカル ケミストリー、263巻、3092−3096頁、1
988年）。さらにアルギニンは新たな水素結合を形成す
ることができるのでリジンをアルギニン残基で置換する
ことにより塩橋の安定性を高めるかもしれない。総説と
してウイグビーら、バイオケミカル アンド バイオフ
ィジカル リサーチ コミュニケーションズ、149巻、9
27−929頁、1987年 参照。アスパラギンとグルタミン
の脱アミド化は酵素の構造を大幅に破壊すると言われて
いるので非アミド残基への置換はこのような破壊を防ぐ
かもしれない。アミノ酸の置換はDNAレベルでの突然変
異により最もうまくできる。
原則的に突然変異実験は単離したクローンに対しても
即座に行うことができる。しかし、挿入配列は突然変異
／発現ベクターにクローン化する方が好ましい。ランダ
ム突然変異は可能であり、また部位限定突然変異（site
−directed mutagenesis）もまた可能である。前者の方
法によると突然変異をおこしたクローンは莫大な数に上
ることを考慮し、また部位限定突然変異について経験に
基づき推測することができるα−アミラーゼの３次元構
造は知られていないので、特定の部位においてランダム
突然変異を行うことを決定した。
次に示すのは本発明を実行するための可能な方法であ
る。
始めに遺伝子は「サイレント」制限酵素切断部位の導
入を行うことにより修飾する。非サイレント切断部位の
導入も可能である。このことにより遺伝子の特定の部位
を欠損させることができる。２番目に遺伝子はファスミ
ドにクローニングする。このファージとプラスミドの結
合により１本鎖のDNAを産生することが容易になる。１
本鎖DNAを得る他の方法も可能である。解離した２本鎖
のベクター（挿入断片を含む）DNAを挿入断片にギャッ
プの入ったベクター／挿入断片の結合体とハイブリダイ
ゼイションすることにより、ギャップの入ったヘテロ２
本鎖DNAが得られた（詳しくは森永ら、バイオテクノロ
ジー、２巻、636頁、1984年）。
ギャップは化学的あるいは酵素による突然変異におい
ても用いられる。好ましくは我々の用いた重亜硫酸法
（フォークとホフステッター、セル、33巻、585頁、198
3年）と酵素的な偽導入（misincorporation）法である
（レートバアラら、プロテインエンジニアリング、２
巻、63頁、1988年）である。これらの方法はギャップ中
の全ての１つのヌクレオチドを他の３つのヌクレオチド
全てと置換する（飽和突然変異）様に行うことができ
る。後者の方法は数種の方法に応用することができる。
そのうちの一つは合成プライマーをギャップとハイブリ
ダイズする方法である。ついでプライマーから３′側の
最初のデオキシヌクレオチドに相補的なデオキシヌクレ
オチドが欠けている部分において伸長反応を行う。原則
的に他の３つのデオキシヌクレオチド全てをこのように
導入することができる。このことは３つのデオキシヌク
レオチドの混合物を用いることにより、あるいは１つの
ヌクレオチドを含む３つの別々の反応を用いることによ
り達成される。その方法を応用した別の方法によりラン
ダムクローンが得られる。つまりそれぞれ１つの限られ
た量のデオキシヌクレオチドを含む４つの別々の反応を
行う。この方法により各１つのヌクレオチドの前で止ま
る２番目の鎖を得ることができる。次の段階は前述した
ように行うことができる。重亜硫酸法と酵素的突然変異
の方法の両者を変異体を得るのに用いた。
酵素的性質を調べるのに突然変異実験に用いた宿主細
胞と同じ宿主細胞中でクローニングした遺伝子を発現さ
せるのが都合がよいかもしれない。原則的に宿主細胞は
適当な突然変異／発現ベクター系がその細胞に対して可
能であればどんな細胞でもかまわない。多くの場合大腸
菌、例えば大腸菌WK6株などがとても便利である。コロ
ニーをマイクロタイタープレート中で増殖させた後プレ
ートのウェルからとったサンプルを異なったpH値にバッ
ファライズした澱粉を含む寒天プレートにスポットす
る。陽性クローンはハロー（halo）形成により検出する
ことができる。熱安定性、酸安定性、アルカリ安定性、
生理食塩水安定性、スクリーニングできるその他の安定
性について選択するのに適当な緩衝液を用いたスクリー
ニングを用いることができる。
変異体α−アミラーゼの産生に適当な宿主細胞株に
は、α−アミラーゼの発現が可能である形質転換可能な
細菌がある。特に枯草菌などのα−アミラーゼを得たの
と同じ種あるいは属の宿主細胞株が適する。好ましくは
α−アミラーゼを含まない枯草菌株であり、より好まし
くはα−アミラーゼとプロテアーゼを含まない枯草菌株
である。
例えばバチルス リケニホルミス T9を大量の変異体
α−アミラーゼを得るのに用いた。
好ましくは産生されるα−アミラーゼが培地中に（醗
酵中に）分泌されることであり、これによりα−アミラ
ーゼの回収が容易になる。分泌させるために、いずれの
適当なシグナル配列も用いることができる。
発現されたα−アミラーゼは宿主細胞から分泌され、
ついで適当な方法により精製することができる。例えば
ゲル濾過とモノＱクロマトグラフィーを挙げることがで
きる。単離されたα−アミラーゼは種々のCa2+濃度（0.
5−15mM）、広いpH値範囲（5.5−8.0）での熱失活につ
いて検討した。検討は実際の適用条件下でも行った。特
に変異体α−アミラーゼはpH5.5からpH5.25での澱粉液
化の条件下で試験した。さらに繊維の糊抜きへの応用に
ついても検討を行った。
スクリーニングされた変異体のいくつかの性質は期待
する適用条件下でより適しているであろう。
本発明は熱安定性、酸耐性、アルカリ耐性の上昇した
α−アミラーゼについて開示している。一般的に置換す
るアミノ酸の数は変異体蛋白の活性が野生型の酵素の活
性と同じかそれより良い限り重要でない。変異体α−ア
ミラーゼは野生型酵素と少なくとも１つのアミノ酸、好
ましくは１つから10個のアミノ酸が異なる。向上した性
質を持つ具体的変異体として111、133、149番目（番号
付けはバチルス リケニホルミスのα−アミラーゼに従
った）のアミノ酸の１つかそれ以上の置換を含むα−ア
ミラーゼがある。好ましいアミノ酸の置換にはAla−111
−The,His−133−Tyr,Tyr−149−Ileがある。
このような変異体酵素は6.5以下及び／または、7.5以
上のpH値での活性が向上した。例えば110度までの高い
温度で半減期が長くなるなどの向上した活性を示した。
入手可能なα−アミラーゼ製品の多くは細菌を原料と
して得られている。特に枯草菌、例えばバチルス、ズブ
チリス，バチルス リケニホルミス、バチルス ステア
ロテルモフィリス、バチルス コアギュランス、バチル
ス アミロリクエンファシエンスである。これらの酵素
は高いホモロジーと類似性を示す（結城ら、ジャーナル
オブ バイオケミストリー、98巻、1147頁、1985年；
中島ら、アプライド マイクロバイオロジー アンド
バイオテクノロジー、23巻、355頁、1986年）。従っ
て、これらのα−アミラーゼの１つから得た好ましい変
異に関する情報は他のα−アミラーゼを改良するのに用
いることができる。本発明はそのような情報を得るため
のアプローチを提供する。
次に述べるのは用いた実験上の方法と発明を具体的に
示すための実施例である。これらの実施例は単に説明の
ためであり、従って発明の範囲を限定することを意図し
たものでは決してない。
実施例 材料と方法 1.一般的なクローニングの技術 クローニングの技術は以下のハンドブックに説明して
あるものを用いた。マニアティスら、モレキュラー ク
ローニング、コールド スプリング ハーバー ラボラ
トリー,1982年；アウスベルら、カレントプロトコール
ズインモレキュラーバイオロジー、ニューヨーク 1987
年；パーバル、プラクティカル ガイド ツウ モレキ
ュラー クローニング、第２版、ジョンウィリーアンド
サンズ（株）、ニューヨーク、1988年。これらのハンド
ブックは組み換え体DNAの構築とその増殖、遺伝子ライ
ブラリーを作る手順、DNAのシークエンスと突然変異の
ためのプロトコール、およびDNA分子に関する酵素の取
扱いのプロトコールについて詳しく説明してある。
2.化学的突然変異 クローン化されたDNAはDNA中に変異を導入するために
試験管内（invitro）で化学薬品で処理してよい。もし
これらの変異をアミノ酸をコードするトリプレットコド
ンに起こすならば、変異を起こしたクローン化DNAによ
り変異体蛋白質が産生される。重亜硫酸ナトリウムを用
いた化学的突然変異の方法はショールとボートシュタイ
ンにより説明されている（メソーズ イン エンザイモ
ロジー、100巻、457頁、1983年）。好ましい方法はフォ
ークとホッフシュテッター（セル、33巻、585頁、1983
年）により説明されている。突然変異を起こす他の方法
はスミスによりアニュアル レビュー オブ ジュネテ
ィックス、19巻、423頁、1985年に説明されている。特
に有用なプロトコールはアウスベールらにより同誌に説
明されている。
3.ギャップの入った２本鎖DNAの突然変異 ギャップの入った２本鎖DNAを用いる方法（クレイマ
ーら、ヌクレイック アシッズ リサーチ、12巻、9441
頁、1984年）とファスミド（プラスミド／ファージのハ
イブリッド）を用いた。その方法は本質的に、野生型遺
伝子の抗生物質耐性マーカーの入ったギャップの入った
鎖（一鎖）と抗生物質耐性を与える遺伝子にアンバー突
然変異の入った鋳型鎖（＋鎖）からなるギャップの入っ
た２本鎖DNAの中間体を用いるものである。アニール後
は、変異を起こしたオリゴヌクレオチドを試験管内のギ
ャップ埋め（gap filling）と結合（sealing）反応の間
にギャップの入った鎖に組み込む。その結果生じた分子
を、目的とした突然変異と抗生物質耐性マーカー間の連
結を保持しているミスマッチ修復欠損宿主細胞株（Mut
Ｓ）を形質転換するのに用いた。この株から分離した
混合ファスミド群は、サプレッサーを持たない宿主細胞
株中で分離される。形質転換株は抗生物質を含む培地の
プレートにまくことにより、ギャップの入った鎖から生
じた子孫細胞を選択する。
ツインベクター系pMa/c5−８は、スタンセンらにより
記載されているが（ヌクレイック アシッズ リサー
チ、17巻、4441頁、1989年）次の領域からなっている。
pos11−105:バクテリオファージ fd、ターミネータ
ー pos121−215:バクテリオファージ fd、ターミネータ
ー pos221−307:プラスミッドpBR322（pos2069−2153） pos313−768:バクテリオファージ fl,複製開始領域
（pos5482−5943） pos772−2571:プラスミッド pBR322、複製開始領域
及びβ−ラクタマーゼ遺伝子 pos2572−2685:トランスポゾン Tn903 pos2519−2772:トリプトファンターミネータ（ダブ
ル） pos2773−3229:トランスポゾン Tn9、クロラムフェ
ニコールアセチルトランスェラーゼ遺伝子 pos3730−3803:マルチプルクローニングサイト 配列は図１に示している。
pMc型ベクターでは2238番目のヌクレオチドはＧから
Ｃに変えられているのに対しpMa型ベクターで3409番目
のヌクレオチドがＧからＡに変えられているが、それ
は、それぞれアセチルトランスフェラーゼ遺伝子とβ−
ラクタマーゼ遺伝子中にアンバー停止コドンを作り、該
遺伝子を不活性化するためである。
ここであげた全ての配列はジーンバンク（Genbank）
（TM）、ナショナル ヌクレイック アシッド シーク
エンス データ バンクNIH USAから入手した。プラス
ミッドpMc5−８はDSM 4566として登録されている。突
然変異を行うために目的のDNA断片はpMa5−８のマルチ
プル クローニング サイトに組み入れた。次に目的の
DNAを含むpMa5−８とpMc5−８の間のギャップの入った
二本鎖を構築した。
目的のDNAから成る一本鎖のギャップは、突然変異誘
発性オリゴヌクレオチド、長い合成オリゴヌクレオチ
ド、低いレベルで偽導入された（misincorporated）ヌ
クレオチド，化学薬品、または不規則突然変異PCRを適
用できる酵素的なヌクレオチドの偽導入（misincorpora
tion）により突然変異を起こすことができる。詳細はア
ウスベールら、（同上）あるいは、パーバル（同上）参
照。試験管内突然変異の他の方法としては、UV照射また
は化学薬品によるもの、あるいは大腸菌ミューテイター
株を用いる生体内（in vivo）突然変異を用いることが
できる（ファウラーら、ジャーナル オブ バクテリオ
ロジー、167巻、130頁、1986年）。
突然変異誘発性ヌクレオチドはアプライドバイオシス
テムから入手可能な装置を用い、合成できる。
4.ヌクレオチドの酵素的偽導入による不規則突然変異 pMa/pMcのギャップの入った２本鎖に対しプライマー
伸長と偽導入突然変異を行うことができる。これは最初
にショートルら（プロシーディングス オブ ナショナ
ル アカデミー オブ サイエンシズ オブ THE USA
79巻、1588頁、1982年）、カニングハムとウェルズ
（プロテインエンジニアリング、１巻、319頁、1987
年）により報告されたもので、この方法の改良法はトレ
バアラらにより報告されている（プロテイン エンジニ
アリング、63巻、２頁、1988年）。
この方法はポリメラーゼの制限的使用に基づいてい
る。始めにDNA分子の４種を、pMa/pMcのギャップの入っ
た２本鎖のプライマー伸長により、ギャップの中で不規
則に、しかしいつも決まった塩基種の前で停止するよう
に（それぞれ、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴの前で）調製し
た。次に４つの各グループはそれぞれ別々の、今度は正
しい塩基を除去することができる偽導入反応において突
然変異を起こした。この方法で全ての型の塩基置換型突
然変異をギャップの全ての位置において起こすことがで
きる。クレノウポリメラーゼよりもシーケナーゼ（TM）
（U.S.バイオケミカルコーポレイション）を好んで用い
た。さらにレトバアラら（同上）らが用いたMoMuLV逆転
写酵素をA.M.V.逆転写酵素の代わりに用いた。
１塩基置換を確認するため、レトバアラら（同上）の
プロトコールに次の改良点を導入した。逆転写酵素緩衝
液中に３種でなく１種のみ偽導入ヌクレオチドを入れ
る。例えば、Ａ特異的に制限された塩基伸長混合物は25
0μMdCTP,250μＭ dGTP,250μＭ dTTPとそれぞれ別々
の３種の反応液中でインキュベートする。４塩基特異的
制限伸長反応混合物の完全な組み合わせに対し、全部で
12種の偽導入反応を行った。42℃で1.5時間のインキュ
ーベーション後、４種全てのデオキシヌクレオチドを0.
5mMの濃度で加え、反応液をさらに最低20分間37℃でイ
ンキュベートした。サンプルはレトバアラらの方法（同
上）により処理し、その中でウラシルを含むDNA鎖への
カウンターセレクション（counterselection）でなくpM
a/cベクターに基づくカウンターセレクションを適用す
るという変更を行った。
5.変異体α−アミラーゼの生産 α−アミラーゼ遺伝子を含む発現ベクターを持つ大腸
菌変異株WK6（ツエル、フリッツ、エンボジャーナル、
６巻、1809頁、1987年）を30℃でTB培地（10ml）に接種
した。TB培地は0.017M KH2PO4、0.072M K2HPO4、12g/
バクトトリプトン、24g/バクトイーストエクストラ
クト、0.4％グリセロールと抗生物質（pMaにはアンピシ
リンまたはpMcにはクロラムフェニコール）を含む。培
養液の一部を２のフラスコ中の250mlのTB培地に植え
付いだ。OD600が10−12のとき0.1mMIPTG（イソプロピル
−β−ｄ−チオガラクトピラノシド）を加え、さらに12
−16時間培養を続けた。
6.変異体α−アミラーゼの精製 菌体は遠心により集菌し、20％ショ糖を含む緩衝液に
０℃で懸濁した。２回目の遠心の後、菌体は冷水に懸濁
した。菌体の残さは３回目の遠心により除き、上清を20
mMトリス緩衝液でpH8.0に合わせた。CaCl2を最終濃度50
mMになるよう加えた。サンプルは15分間70℃で熱処理
し、不溶物を遠心で除いた。上清は0.22μミリポアメン
ブレンによりろ過し、初期容量の1/10まで濃縮した。
精製はさらに、ゲルろ過（TSK HW−55−メルク社）
とモノＱクロマトグラフィーにより行った。MonoSクロ
マトグラフィーの前に酵素活性を含むフラクションにつ
いて、酢酸ナトリウムを用い、pHを4.8に調整した。α
−アミラーゼは250mMNaClで溶出した。失活を防ぐた
め、pHを速やかに8.0に調整した。
実施例 実施例１ バチルスリケニホルミスのα−アミラーゼ遺伝子のモレ
キュラークローニング バチルスリケニホルミスのT5（EP−Ａ−134048;CBS47
0.83）から単離した染色体DNAを制限酵素EcoK Iで消化
し、PUB110（グリンザンら、ジャーナルオブバクテリオ
ロジー、134巻、318頁、1978年）のEcoR I部位に組み込
んだ。組み換え体はバチルスズブチリス1A40（バチルス
ジェネティック ストックセンター）にトランスフォ
ームした。α−アミラーゼ産生について、ネオマイシン
耐性コロニーを0.4g/澱粉（ツルコフスキー澱粉、メ
ルク社）を加えたHI寒天プレートで検定した。ヨー素蒸
気中で増殖、インキュベーション後、大きな透明のハロ
を作った陽性コロニーは次の解析に選択された。この陽
性コロニーから単離したプラスミドはバチルスリクニホ
ルミスT5から生じた3.4kbのEcoR I−EcoR I断片を含む
ことが示された。このプラスミドはpGB33（EP−Ａ−134
048;CBS466.83）と命名された。α−アミラーゼをコー
ドする挿入断片は合成シャインダルガル17配列とバクテ
リオファージSPO2プロモーターに組み込み、その結果で
きたプラスミドをpRromSPO2とした（EP−Ａ−0224294参
照。CBS696.85）。サンガー法（プロオシーディング
オブ ナショナル アカデミー サイエンス オブ U.
S.A.74巻、6463頁、1977年）により決定したpPromSPO2
の挿入断片のヌクレオチド配列は図２に示した。配列は
α−アミラーゼをコードする１つの大きなオープンリー
ディングフレームを示し、これは、結城ら（同上）によ
り決定されたバチルスリケニホルミスのα−アミラーゼ
の配列と実質的に一致する。初めの29個のアミノ酸はα
−アミラーゼが分泌される際切り出されるシグナル配列
である。この応用を通じて、アミノ酸の番号づけは成熟
蛋白に応じた番号である。
結城の配列は、次の箇所において異なっている。134
番目、ロイシンの代わりにアルギニンが存在し、310番
目グリシンの代わりにセリンが存在し、320番目、セリ
ンの代わりにアラニンが存在する。
実施例２ 突然変異／発現ベクターpMaTLia6の構築 プラスミドpPROM SPO2はEcoR IとBcl Iで消化し、1.
8kbのEcoR I−Bcl I断片を精製し、EcoR I−BamH I消化
したpMa5−８に組み込んだ。このpMa5−８ベクターは改
変したマルチプルクローニングサイトを前もって付加し
ておいた。図１の3767番目から3786番目のBamH I−Hind
III断片は図３の5647番目から5660番目にくるように合
成DNA配列と交換した。このことは、α−アミラーゼ遺
伝子中の制限酵素部位のいくつかを単一箇所にするため
に行った。生成したα−アミラーゼを含むpMa5−８誘導
体はEcoR IとBamH Iとで消化し、TACプロモーター（デ
ュボアら、プロシーディンブズ オブ ナショナルアカ
デミー オブ サイエンシズ オブTheU.S.A.80巻、21
頁、1983年）のコピーをもつ合成DNA断片と連結した。
この合成DNA断片の配列は3757番目から3859番目まで、
最終的なα−アミラーゼの突然変異／発現ベクターのpM
aTLia6と共に図３に示した。この最終α−アミラーゼ突
然変異／発現ベクターは突然変異実験の際にα−アミラ
ーゼ遺伝子中にギャップを生じるよう数か所サイレント
制限酵素切断部位を導入することにより完成した（図
４）。この目的のため次の突然変異を部位限定オリゴヌ
クレオチド突然変異を用いて行った。
−Spe I部位をサイレント突然変異により導入した。
T49T と S50S ACG→ACT AGC→AGT −Nar I部位をサイレント突然変異により導入した。
A269A GCG→GCC −BstE II部位をTAG終止コドンの下流直後に導入した。
TAGAAGAGC→TAGGTGACC このα−アミラーゼ突然変異ベクターpMaTLia6はギャ
ップ入り２本鎖法を用いた突然変異に適している。適当
な制限酵素による消化により調製した二本鎖pMaTLia6DN
Aはアニールし１本鎖pMcTLia6DNAとした。
生じた１本鎖ギャップに対し、実験の項に説明した部
位限定突然変異、化学的突然変異、そして不規則酵素的
突然変異を行った。
α−アミラーゼ遺伝子の前にTALプロモーターをつけ
ることによってIPTGを加えることにより大腸菌にα−ア
ミラーゼを誘導発現させ得る。
大腸菌WK6中のプラスミドpMaTLia6は1989年６月２日
にCBS255.89として寄託した。
実施例３ 突然変異と発現のための枯草菌／大腸菌シャトルベクタ
ーの構築 このベクターは大腸菌内での挿入した遺伝子の突然変
異、及び枯草菌内での速やかな発現を可能にする。ベク
ターの構築のために選んだ方法はpUB110系プラスミド
（ブリクザン、同上）をpMa/cツインベクター系と次の
ような方法で結合することである。
1. バチルスサチリスの遺伝子単位（casette）は１回
の制限酵素切断及び再ライゲーション実験により除くこ
とができる。
2. 異なるα−アミラーゼ遺伝子と異なるプロモーター
を容易にこのベクターにクローン化することができる。
3. 再環状化の後、クローン化した遺伝子は適当な枯草
菌のプロモーターの制御下に置くことができる。
4. 大腸菌の突然変異の間、枯草菌のプロモーターと構
造α−アミラーゼ遺伝子は大腸菌内にα−アミラーゼを
蓄積させると致死的であるかもしれないのでそれを避け
るために物理的に分離する。
シャトルベクターの図は図５に示した。ベクターpBMa
/c1の最終的な構造は図６に示した。ベクターpBMa1は19
89年６月２日にCBS 252.89として寄託してある。ベク
ターは次のように構築された。
−REP遺伝子とNeoR遺伝子を含むpUB110のEcoR I−SnaB
I断片は精製しEcoR I−Sma Iで消化したpUC8に組み込ん
だ。
−BamH I−Xba Iポリリンカー断片はバクテリオファー
ジSPO2のSPO2プロモーターをコードするDNA（ウィリア
ムズら、ジャーナル オブ バクテリオロジー、146
巻、1162頁、1981年）及びSac II、Apa I、Xho I、Suc
I、Bgl I、Mlu IとXba Iの制限酵素認識部位の合成断片
で置換した。
−pMa5−80の単一のEcoR I部位は、次の制限認識部位を
構成するポリリンカーDNA断片を挿入するのに用いた:Ec
oR I、Sma I、Sac I、EcoR V、Sph I、Kph I、Kpn I、
及びHind III、特定の目的のために誘導体pBMa/c2とpBM
a/c6がpBMa/c1から開発された。
−pBMa/c2ではpBMa/c1のEcoR I−Hind IIIポリリンカー
はpUC19の相当するポリリンカーにより置換した。
−pBMa/c6ではさらにpBMa/c1の右のポリリンカー中のSa
c II部位をクレノー反応により除いた。
バチルスリケニホルミスのα−アミラーゼに対する部
位限定突然変異はpBMa/c6Lia6を構築した後行った。こ
のベクターはpMaTLia6から単離したBamH I−Hind III断
片をBamH IとHind IIIにより開裂させた上述のpBMa/c6
に組み込むことにより構築した。生じたプラスミド（図
７）は大腸菌の突然変異でギャップの入った２本鎖を構
築するのに用いることができる。
生じた変異体はチャンとコーエンの方法に従い（モレ
キュラー アンド ジェネラル ジュネティックス、16
8巻、111頁、1979年）Sac Iによる制限酵素処理、再ラ
イゲーション、及びトランスフォーメーションによりバ
チルスズブチリス 1A40（BGSc 1A40）で発現させた。
実施例４ 完全な成熟蛋白としてのバチルスリケニホルミスのα−
アミラーゼの大腸菌における発現 pMaTLia6（例２）により産生されたα−アミラーゼの
解析によりα−アミラーゼの一部は分泌される間に誤っ
て修飾されることがわかった。アミノ末端シークエンス
により大腸菌WK6の産生するα−アミラーゼは余分なア
ラニン残基があることがわかった。
このことによりアミラーゼが異なる性質を持つか否か
わからないが、α−アミラーゼのシグナル配列をアルカ
リホスファターゼPhoAのシグナル配列と交換した。この
目的のためFsp I制限酵素切断部位をpMaTLia6のシグナ
ルペプチドと成熟α−アミラーゼの連結部位に導入する
ように突然変異実験を行った。Fsp IとBamH I消化の
後、phoAシグナル配列（ミカエリスら、ジャーナルオブ
バクテリオロジー、154巻、366頁、1983年）をコードす
る合成DNA断片を挿入した。このプラスミドの配列は図
８に示す。pMa/cTLPia6が産生するα−アミラーゼは正
確なアミノ末端配列を持つことがわかった。
実施例５ 安定なα−アミラーゼのスクリーニング A.酸耐性α−アミラーゼ突然変異体のスクリーニング 野生型α−アミラーゼよりも低いpHで良くも悪くも活
性を示すα−アミラーゼ突然変異体は、異なるpH値で緩
衝化した澱粉プレートにできるハローをヨウ素液ででん
ぷんを染色した後に比較することにより選択できる。
方 法； 1.増 殖 突然変異株の候補はマイクロタイタープレートで増殖
させる。増殖培地はブレインハートインフュージョンブ
ロス250μ（ディフコ社）である。補足したものは クロラムフェニコール 50μg/ml I.P.T.G.（シグマ社） 0.2mM CaCl2 2mM コロニーは滅菌つまようじで寒天プレートから拾いマイ
クロタイタープレートの各ウェル（96）に植菌した。各
プレートには４つの野生型コロニーを対照として植菌し
た。
これらのマイクロタイタープレートは振とうせず40時
間37℃に置いた。
2.プレート試験 α−アミラーゼの産生されたインキュベーション後、
各ウェルからサンプル５μをとり２種の異なった種類
の寒天プレート（144×140nm）にスポットした。第一の
タイプは栄養分の多いハートインフュージョン寒天プレ
ート（DIFIO社）＋0.4％澱粉（ツルコフスキー澱粉−メ
ルク社）＋クロラムフェニコール50μg/mlである。37℃
16時間インキュベーションの後、このプレートは突然変
異体を保存するのに用いられた。
第２のプレートのタイプは実際のスクリーニング用の
プレートで、バクトラガー（DIFIO社）1.5％ソルコフス
キー澱粉0.2％を含む。寒天と澱粉は合成生水（StW）に
溶解した。こ れは脱金属水＋CaCl2 2mM MgCl2 1mM NaHCO3 2.5mM BSA 10μg/ml である。
スクリーングブレートはこの培地中に5Mのストック用
酢酸カリウム緩衝液を100倍希釈して緩衝化する。測定
した寒天プレート中の最終pH値はストック用溶液より少
し低い。各ウェルから５μの培養液を異なったpH値の
３種のスクリーニングプレートにスポットする。
pH値の範囲は最低pH値のプレートにおいて野生型のα
−アミラーゼに対し、ほとんどまたは全く活性が残存し
ないように選ぶ。
3.染 色 スクリーニングプレートは55℃で２時間インキュベー
トする。この後ヨー素液をプレートに注ぎかける。10倍
ヨウ素液は１につき30gのヨウ素と70gのKIを含む。
スポットの透明な部分の面積はそのpHにおいて残存す
るα−アミラーゼ活性と相関する。野生型株の対照より
高い活性を示した突然変異株は第２次のスクリーニング
に選択する。野生型のハローはこの実験において良好な
再現性を示す。
4.第２次スクリーニング 栄養分の高いプレートから陽性コロニーを拾い新たな
HIプレート＋クロウムフェニコール上で精製する。各突
然変異株から４つのシングルコロニーを拾い、第一次ス
クリーニングの際と同様の方法で再度検定する。さら
に、これらの培養液の希釈系列をSTWで作りそれを中性p
Hのスクリーニングプレート（pH＝7.0）にスポットす
る。野生型株の培養との比較から低いpHで高い活性を示
すのがα−アミラーゼの産生が全般に高かったためか本
質的により安定なα−アミラーゼのためであるのかを決
定することができる。
第２次スクリーニングに「生き残った」突然変異株は
突然変異をおこされた遺伝子の部分のヌクレオチド配列
を決定することにより解析を行う。
B.アルカリ耐性α−アミラーゼのスクリーニング アルカリ耐性のα−アミラーゼのスクリーニングは酸
耐性α−アミラーゼに用いられた方法と同様の方法で行
われる。マイクロタイタープレートで増殖後サンプル５
μを各ウェルからとり保存用プレートと実際のスクリ
ーニングプレートにスポットする。後者は バクトアカー（DIFCO） 1.5％ ツルコフスキーでん粉 0.2％ を含み、脱金属水と CaCl2 2mM MgCl2 1mM NaHCO3 2.5mM BSA 10μg/ml を加え完成する。
スクリーニングプレートは pH値9.0、9.5、10.0の50mM炭酸／重炭酸緩衝液で緩衝化
する。pH値の範囲は最も高いpH値において野生型のα−
アミラーゼがほとんどまたは全く活性を示さなくなるよ
うに選ぶ。55℃で２時間培養後ヨー素液をプレートに注
ぐ。野生型酵素よりよいハローを形成した突然変異株は
スクリーニング第２段階に選択する。この第２次スクリ
ーニングは酸耐性株のスクリーニングの際と同様の方法
で行う。
C.熱耐性α−アミラーゼ突然変異株のスクリーニング 高温で野生型α−アミラーゼより高いあるいは低い活
性をもつα−アミラーゼ突然変異体は加熱後の培養液の
残存するα−アミラーゼ活性により生じた澱粉プレート
のハローの比較により選択することができる。
方法； 1. 突然変異体はpHスクリーニングの際と同じ方法で増
殖させる。
2. 突然変異体をpHスクリーニングの際のようにHI寒天
プレート上で増殖させる。
3. マイクロタイタープレートの各ウェルを加熱時に培
養液が蒸発しないよう使い捨てキャップ（フロウラボラ
トリーズ）で密閉する。
4. マイクロタイタープレートを水浴で95℃１時間加熱
する。加熱後マイクロタイタープレートはサンプル全て
をマイクロタイタープレートの底に集めるため遠心し
た。
5. 熱耐性突然変異体のスクリーニングは次のように行
った。各ウェルから５μの培養液をとり中性のスクリ
ーニングプレート（pHスクリーニング参照）にスポット
した。このプレートは55℃１時間培養した。
ヨウ素液で澱粉を染色した後突然変異体と対照はスポ
ットの透明部分（ハロー）を比較することにより残存す
るα−アミラーゼ活性に対するスクリーニングを行うこ
とができる。
対照の残存する活性が高すぎる場合、野生型酵素より
熱耐性の突然変異体を識別するため希釈系列を作製しス
クリーニングプレートにスポットしなければならない。
6. 興味深い突然変異体である可能性のあるものはpHス
クリーニング法で行ったようにさらに試験する。
スクリーニングタイプＡまたはＢとＣの組み合わせ
は、組み合わせた特長を望むならば用いることができ
る。例えばアルカリ耐性のα−アミラーゼのスクリーニ
ングの第一次段階の後、熱耐性のスクリーニングの第２
段階を行うことができる。両方の試験で陽性の結果を示
した突然変異体は望ましい性質を合わせ持った候補とし
て選択することができよう。
実施例６ pMaTLia6の重亜硫酸突然変異 4315番目から4569番目（図３）までのギャップの入っ
たヘテロ２本鎖を得るためpMaTLia6の１本鎖DNAをSac I
I−Cla Iで切断したpMcTLia6と共にアニールした。この
ヘテロ二本鎖に対し重亜硫酸突然変異を行った（実施例
参照）。
大腸菌WK6mutS（ツェルとフリッツ、同上）に導入
し、クロウムフェニコールを含む寒天プレート（50μg/
ml）で選択後、プラスミドDNAを単離し大腸菌WK6に導入
した。大腸菌WK6MutSはCBS472.88として、大腸菌WK6はC
BS473.88として寄託されている。生じた形質転換体は2.
0mM CaCl2、50μg/mlクロラムフェニコール及び0.20mM
IPTG（シグマ社）を含むBHI培地（DIFCO社）中37℃40
時間、マイクロタイタープレートで振とうせず培養す
る。pH耐性突然変異体のスクリーニングは実施例５で述
べたようにして行った。約300個のクロラムフェニコー
ル耐性形質転換株をスクリーニングした。DNAシークエ
ンスにより決定した突然変異頻度はギャップ上平均0.4
回／分子であった。１つの酸耐性突然変異体D7がpHスク
リーニングの後同定された。この突然変異体の配列から
トリプレットがCACからTACに変わったことによるH133Y
の変異であることがわかった。
突然変異体D7は熱耐性スクリーニングアッセイ（実施
例５）においても陽性であることがわかった。
Sac II−Cla I断片の直前から始まるよう計画された
特定のオリゴヌクレオチドを用い、１本鎖DNAのDNAシー
クエンスが行われた。別々の突然変異実験において1000
個のクロラムフェニコール耐性形質転換体をスクリーニ
ングした。他の酸耐性突然変異体である2D5がpHスクリ
ーニングの後同定された。この突然変異体は次の変異を
持つ。
H133Y CAC→TAC T149I CAC→ATA 重亜硫酸突然変異を図３の4569番目から4976番目まで
のCla I−Sal Iギャップに対してもこれまで述べたのと
同様の方法で行った。約300個のクロラムフェニコール
耐性形質転換株をスクリーニングした（突然変異頻度0.
6回／分子）。酸耐性形質転換体は全く見出されなかっ
た。多数の酸不安定な変異体を見出した。この酸に不安
定な突然変異体の中にはよりアルカリ耐性の表現型を生
じるpHスペクトラムの移行があるものがあるのかもしれ
ない。
実施例７ pMaTLia6の酵素的突然変異 4569番目から4976番目（図３）までに渡るヘテロ２本
鎖を得るため、Cla I−Sal Iで切断したpMCTLia6と共
に、１本鎖pMaTLia6（図４）をアニールした。ギャップ
の入った２本鎖に対し実施例に述べたように酵素的に偽
導入し突然変異を行った。
dATP制限プライマー伸長後に得たサンプルは３つに分
け、それぞれdcTP、dGTP、dTTPと共に逆転写酵素存在下
インキュベーションした。37℃10分間インキュベーショ
ン後４つ全てのdNTPとクレノウポリメラーゼを加え反応
させ、T4−DNAリガーゼを完全に２本鎖DNAに伸長させる
ために加えた。
このDNAは大腸菌WK6MutSに導入し、プラスミドDNAを
回収した。プラスミドDNAは続いて大腸菌WK6に導入しク
ロラムフェニコール（50μg/ml）を含む寒天プレート上
でコロニーを選択した。得られた突然変異株は実施例５
で述べたようにα−アミラーゼの安定性に関してスクリ
ーニングを行った。
別の実験でSpe I−Sac IIギャップに対し、それぞれd
ATP、dCTP、dGTP及びdTTPとの制限プライマー伸長を行
った。このプライマー群に対し偽導入（実験の項参照）
により突然変異を行った。100個のクロラムフェニコー
ル耐性形質転換株をpHプレート上で試験し（実施例５）
突然変異体M29を低いpHでより耐性を示すと同定した。
この変異は次の配列であると決定した。A111T GCG→TC
G 実施例８ 耐性突然変異体の性質 重亜硫酸突然変異実験で得られた２つの突然変異体を
さらに解析した。前述したようにDNAシークエンスによ
り次のアミノ酸の置換が示唆された。
−D7では133番目のヒスチジンの代わりにチロシンを含
み（D7＝H133Y）、 −2D5はD7の変異とその他に149番目のトレオチンがイソ
ロイシンに置換されている（2D5＝H133Y、T149I）。
ａ）酵素活性の測定 バチルスリケニホルミスのα−アミラーゼの野生型と
突然変異体の酵素活性を４−ニトロフェニル−マルトペ
ンタオシド（4NP−DP5）を基質として用い測定した。反
応の結果４ニトロフェノールとマルトペンタオースが生
じOD405の変化を測定することにより活性を調べること
ができる。アッセイは50mMMOPS、50mMNaCl、2mMCaCl
2（pH7.15）及び０−1mM4NP−DP5存在下35℃で行った。
初速度を測定し、Ｅ−ニトロフェノールは10.000/M
1cmと定めた。
図９に野生型酵素と2D5α−アミラーゼについての結
果を示す。VmaxとKmを計算し表１に示した。
表 １ Vmax（μmol/min/mg Km（mM） WT 66.7±0.9 0.112±0.005 2D5 66.3±0.7 0.119±0.004 表１はα−アミラーゼ2D5の変異が本質的に酵素活性
に影響を及ぼさないことを明らかに示している。
ｂ）熱失活性に対するCa2+の効果 種々のカルシウム濃度下での熱失活性実験を野生型酵
素、D7、2D5に対し行った。方法は以下の通り。
１）脱金属 酵素（２−3mg/ml）は24時間以下の緩衝液に対して透
析 ３×1L 20mM MOPS 5mM EDTA 5mM EGTA pH7.0 ３×1L 20mM MOPS pH7.0 ２）再金属付加 −500μ緩衝液100mM（例MES、MOPS、EDPS）＊ −145μ脱金属化酵素（例、2.15mg/ml） −100μ CaCl2（100、50、30、20、10、5:または2.5
mM） −Ｘμ K2SO4（100mM） −（255−Ｘ）μH2O 〔CaCl2〕最終濃度 〔K2SO4〕最終濃度 （mM） （mM） 0.25 14.75 0.5 14.5 1 14 2 13 3 12 5 10 10 0 ＊−MESのpH・例、室温で6.77は90℃で6.0となる。
（pKa6.15 pKa/℃＝−0.011）。
−pKa値はメルク社の表（２価イオン緩衝液）から採用
した。
３）熱失活 約0.2mg/mlの濃度の、室温でプレインキュベーション
した酵素液1mlを密閉したピアスバイアル（テフロンコ
ートしたシール）中で90.5℃または95℃で熱した。０か
ら６時間後一定時間ごとにシリンジでサンプル50μを
とり氷上で冷却した。残存する酵素活性を4NP−DD5（0.
5mM）を用い測定した。
シングル エフスポネンシャル デケイ フィティン
グ プログラム（Single exponential Decay Fitting P
rogram）、（グラフパッド社 GRAPHPAD）を用い半減期
を計算した。
図10、11に野生型酵素とD7α−アミラーゼのpH5.5及
びpH7.0各々での90.5℃での半減期をCa2+濃度の関数と
して示している。2D5のCa2+依存性は95℃においてはpH
7.0において求めたのみである（図12）。変異体のCa2+
依存性も野生型酵素の場合と変わらないことがわかる。
C.異なるpH値での突然変異体α−アミラーゼの熱耐性 D7と2D5両方の熱耐性のpH依存性を上述したように1mM
Ca2+を含む緩衝液中で90.5℃及び95℃各々において求め
た。D7と2D5両方について熱耐性はpHの範囲全般におい
て大きく向上した（2D5では２倍まで）と結論できる。
実施例９ 枯草菌での突然変異体酵素の産生 バチルスリケンホルミスのα−アミラーゼでの突然変
異遺伝子は大腸菌WK−６において発現させることにより
同定されたが、これを２つの異なった方法で枯草菌の発
現ベクターに挿入した。
ａ）α−アミラーゼ遺伝子の単一の制限酵素切断部位を
用い（図４）、突然変異個所を含むDNA断片をpMaTLia6
突然変異株から単離しpBMa6、Lia6の相固な位置にサブ
クローンした。後者のプラスミドは大腸菌、枯草菌いず
れにおいても複製できるが、それを次にSac Iで切断しT
4DNAリガーゼで再環状化した。バチルスサチリスIA40に
導入後、SPO2プロモーター制御下でα−アミラーゼの多
量の産生が認められた。再環状化したpBMa6、Lia6はベ
クターの大腸菌のDNA断片が除かれたのを示すためにpB
6、Lia6と命名する。
ｂ）pBMa6、Lia6の１本鎖DNAを大腸菌から再回収し、α
−アミラーゼ遺伝子上に目的のギャップをもつ２本鎖DN
Aを得るために制限酵素で切断したpBMc6、Lia6の２本鎖
DNAとアニールした。このギャップに対し望む突然変異
をコードするオリゴヌクレオチドとの部位限定突然変異
（実験の項で述べたように）を行った。pBMc6、Lia6ベ
クターは次に上述したようにpB6、Lia6型ベクターに変
換する。
ａ）においてはもし突然変異が異なるギャップで選択的
におこるならば、異なる単一部位突然変異（single sit
e mutation）の組み合わせを行うことができるが、方法
ｂ）を用いる。
突然変異株D7と2D5の変異DNAは、方法ａ）により、Sa
c II−Sal I DNA断片を変換することによりpBMa6、Lia6
に挿入した。そしてα−アミラーゼを形質転換したバチ
ルスズブチリス1A40の培養上清から回収した。両方の突
然変異株の培養上清に対し実施例のスクリーニング操作
を行い、両方の突然変異株は野生型株のpB6、Lia6によ
り産生されたα−アミラーゼより酸耐性かつ熱耐性であ
るα−アミラーゼを産生することを確かめた。
従って、枯草菌でのα−アミラーゼ突然変異株の表現
型は大腸菌での表現型と異ならない。
最終的にpB6、Lia6突然変異体は、バチルスリヘニホ
ルミスT9に導入された。この菌はバチルスリヘニホルミ
スT5のプロテアーゼ、α−アミラーゼ欠損類縁株である
（EP−0253455、CBS470.83）。宿主のT9は宿主と同一の
系でα−アミラーゼの突然変異株を多量に産生するため
に用いられた。染色体のα−アミラーゼ遺伝子がないた
めにこの株は野生型のα−アミラーゼが全く混合して産
生されないので突然変異株α−アミラーゼを産生するの
に非常に適している。この菌株から回収した酵素は工業
上の応用試験に用いた。突然変異体pB6、Lia6、2D5とpB
6、Lia6、D7の工業上の利用を示した。
実施例10 澱粉分解の条件下での突然変異株α−アミラーゼの応用
試験 突然変異株α−アミラーゼ2D5をより実際的状況で試
験するため、我々は限外濾過により発酵培養液（実施例
９）を精製し酵素を50％プロプレングリコールで処理し
た。
３種のサンプルを試験した： 893701:野生型株 バチルスリヘニホルミスT5α−ア
ミラーゼ1530TAU/g 893703:2D5 野生型と同様に調製した突然変異株2820
TAU/g Maxamy l 0819 工業用サンプル 7090TAU/g 1TAU（熱耐性α−アミラーゼ単位）は標準化した条件
下で１分間に1gの澱粉をヨウ素と反応後620nmで対照の
色と同一の吸収を持つ産物に変換する酵素の量として定
義する。標準条件はpH6.6、30℃、反応時間20分であ
る。対照の色は100ml蒸留水中25gCoCl2・6H2O、3.84g
K2Cr2O7及び1mlHCl（1M）である。
1.低いpH（5.5及び5.25）での液化試験 澱粉のスラリーの温度を110℃±0.5℃にできるだけ急
速に上げ６分間この温度に保つ。
液化は連続的流路（5.4/n）中で行う。135ml（液化
1.5分）の３種のサンプルを液化45、60、及び75分後取
り、95℃に２時間保つ。この後、サンプル50mlを1NH2SO
40.4mlでpH3.5に調整し、D.E.決定の前に酵素活性を止
めるために10分間沸騰水に入れる。
サンプルの残りは残存酵素活性を測定するため冷却す
る。
スラリー組成： 3.3kgとうもろこしでん粉D.S.88％（2.904kg乾燥澱
粉）。
3.45 井戸水（40T.H.） スラリーの乾燥物質は33％。
pHは1N硫酸または1NNaOHにより調整する。
酵素濃度:4.4TAU/gr乾燥澱粉。
流速は試験の間２、３回確認する。
2.D.E.測定 液化澱粉の乾燥物質を屈折率測定計により確認する
（約34％）。D.E.は有名なレインエイノン法により決定
する。結果は図15に示す。
3.残存酵素活性 液化澱粉中の残存アミラーゼ活性は、ブラベンダーア
ミログラフを用いて測定した。
40g ジャガイモ澱粉 390ml 蒸留水50℃ 50ml トリス緩衝液 0.05M pH6.50 5mM 30g/ CaCl2・2H2O 粘度が安定したら（10分）温度を80℃に上げ（1.5゜
／分）希釈した液化澱粉5ml（7gを蒸留水で50mlにす
る）を加え、20分後粘度の減少を測定する。この減少は
酵素活性と相関している。既知の酵素濃度を用いた標準
曲線によりT.A.U.で表される残存活性を推定することが
できる。
変異体2D5はpH5.5以下及び110℃において野生型酵素
より顕著に高い活性を示す。変異体2D5についてpH5.25
において２−3DE単位の上昇が得られる。
実施例11 変異体α−アミラーゼの繊維糊抜きの条件下での適用試
験 アルカリ性α−アミラーゼ変異株の工業的応用を試験
するため次の溶液中で20℃での安定性に関して試験を行
う。
1.4％ 過酸化水素（35％） 1.0−1.5％ 苛性ソーダ（100％） 15−20ml/ ケイ酸ナトリウム（38B） 0.3−0.5％ スルホン酸アルキルベンゼン（Lanaryl
N.A.−ICI） 0.5−1.0％ 有機安定剤（Tinoclarite G） 2.5時間インキュベーション後、望ましい性質を有す
るために選んだ変異体α−アミラーゼにはいくらかの酵
素活性が残存するはずである。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ // Ｄ０６Ｍ 16/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/28 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者 クワックス ウィルヘルムス ヨハネス オランダ国 エヌエル―2253ヴェーベー フォールショッテン ヤン ファン ガレンラーン ８ (72)発明者 ラロッシュ イヴ ベルギー国 ベー1150 ブリュッセル リュー ベーメル 115 (72)発明者 ヴォーレブレヒト アドリアヌス ウィ ルヘルムス ヘルマヌス オランダ国 エヌエル―2671ウェーゼッ ト ナールトウェイク ベレクラウ 13 (72)発明者 スタンサン パトリック ベルギー国 サン デニーズ ウェスト ラン ド ジェイラーン 13 (72)発明者 ローヴェレイ マルク ベルギー国 ベー2950 ハールテール ヴィルジャンストラート 22 (56)参考文献 Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．166（２) ｐ．635−643（1986) Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１（３) ｐ．241（1987) Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．98（５）ｐ. 1147−1156（1985) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 9/28 C12N 15/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (13)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】バチルス・リケニホルミスから得られ、下
    記配列の１番目〜483番目のアミノ酸配列において133番
    目及び149番目の少なくとも１つの位置において異なる
    アミノ酸に置換されており、下記配列の１番目〜483番
    目のアミノ酸配列からなるα−アミラーゼよりも耐熱性
    が向上した変異体α−アミラーゼ、又は下記配列の１番
    目〜483番目のアミノ酸配列において133番目及び149番
    目の少なくとも１つの位置において異なるアミノ酸に置
    換されており、かつ下記配列の１番目〜483番目のアミ
    ノ酸配列の133番目及び149番目以外の１若しくは数個の
    アミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
    を有しており、下記配列の１番目〜483番目のアミノ酸
    配列からなるα−アミラーゼよりも耐熱性が向上した変
    異体α−アミラーゼ。
  2. 【請求項２】次のアミノ酸置換、すなわちHis−133−Ty
    r、Thr−149−Ileの１つ以上を含むことを特徴とする、
    請求の範囲第１項記載のα−アミラーゼ。
  3. 【請求項３】請求の範囲第１項記載のα−アミラーゼを
    コードする変異体遺伝子。
  4. 【請求項４】請求の範囲第３項記載の変異体遺伝子を含
    む発現ベクター。
  5. 【請求項５】請求の範囲第４項記載の発現ベクターを含
    む宿主細胞。
  6. 【請求項６】請求の範囲第４項記載の発現ベクターによ
    り形質転換されたことを特徴とし、形質転換に先立ち、
    細胞外澱粉分解酵素を産生する能力が実質上ない宿主細
    胞。
  7. 【請求項７】バチルス・リケニホルミスT9で表された請
    求の範囲第６項記載の宿主細胞。
  8. 【請求項８】請求の範囲第１項に記載の変異体α−アミ
    ラーゼを調製する方法であって、 前記変異体α−アミラーゼをコードする遺伝子を得るた
    めにα−アミラーゼをコードするクローン化した遺伝子
    に突然変異をおこす工程； 得られた変異体α−アミラーゼ遺伝子又は遺伝子群を単
    離する工程； 上記変異体α−アミラーゼ遺伝子又は遺伝子群を発現及
    び産生に適当な宿主細胞に導入する工程；及び 産生した変異体α−アミラーゼを回収し、該変異体α−
    アミラーゼを同定する工程を含む方法。
  9. 【請求項９】変異体α−アミラーゼを産生する方法であ
    って、 請求の範囲第５項〜第７項のいずれか１項に記載の宿主
    細胞を適当な培地中で培養する工程、及び産生されたα
    −アミラーゼを回収する工程を含む方法。
  10. 【請求項１０】請求の範囲第１項又は第２項に記載した
    変異体α−アミラーゼの利用を含む澱粉分解の方法。
  11. 【請求項１１】請求の範囲第１項又は第２項に記載した
    変異体α−アミラーゼの利用を含む繊維糊抜き方法。
  12. 【請求項１２】請求の範囲第１項又は第２項に記載した
    変異体α−アミラーゼを含む澱粉分解用組成物。
  13. 【請求項１３】請求の範囲第１項又は第２項に記載した
    変異体α−アミラーゼを含む繊維糊抜き用組成物。
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