FI103285B - Eristettyjä -amylaasimutantteja, joiden lämmön-, hapon- ja/tai emäks enkestävyys on parantunut - Google Patents

Description

103285

Eristettyjä α-amylaasimutantteja, joiden lämmön-, hapon-ja/tai emäksenkestävyys on parantunut

Esillä oleva keksintö koskee geenitekniikkaa ja tuottaa 5 uusia DNA-molekyylejä, jotka sisältävät DNA-sekvenssejä, jotka koodattavat entsyymejä, joilla on a-amylaasiaktii-visuutta. Erityisesti tuodaan esiin mikrobisia cc-amy-laasimutantteja, joiden ominaisuuksia on parannettu, käytettäväksi tärkkelyksen hajotukseen, ja liisterin poista-10 miseen kankaasta ja muissa teollisissa prosesseissa.

Näiden cc-amylaasien lämmön-, hapon- ja emäksenkestävyydet ovat parantuneet, mikä aiheuttaa sen, että niiden avulla on parhaalla mahdollisella tavalla mahdollista toteuttaa 15 niiden aktiivisuus prosessiolosuhteissa, joita tähän mennessä ei ole voitu käyttää.

Tärkkelys koostuu amyloosin (15-30 % paino/paino) ja amy-lopektiinin (70-85 % paino/paino) seoksesta. Amyloosi 20 koostuu a-1,4-sidoksilla kytkettyjen glukoosiyksiköiden muodostamista lineaarisista ketjuista, joiden molekyyli-paino (MP) on noin 60 000 - noin 800 000. Amylopektiini on haarautunut polymeeri, joka sisältää α-l,6-haarautu-miskohtia aina 24-30 glukoosiyksikön jälkeen, sen MP voi 25 olla jopa 100 miljoonaa.

·* Sokereita tuotetaan yleisesti tärkkelyksestä, väkevöity- jen dekstroosisiirappien muodossa, entsyymikatalysoidun prosessin avulla, joka käsittää: (1) kiinteän tärkkelyk-30 sen nesteyttämisen (tai ohennuksen) a-amylaasin avulla dekstriineiksi, joiden keskimääräinen polymerisaatioaste on noin 7-10, ja (2) tuloksena olevan nesteytetyn tärkkelyksen (so. tärkkelyshydrolysaatin) sokeroimisen amylo-glukosidaasin avulla (myös nimeltä glukoamylaasi tai AG). 35 Tuloksena oleva siirappi sisältää runsaasti glukoosia. Suuri osa kaupallisesti tuotetusta glukoosisiirapista isomeroidaan myöhemmin entsymaattisesti dekstroosi/fruk-toosi-seokseksi, joka tunnetaan nimellä isosiirappi.

103285 2 α-amylaasi (EC 3.2.1.1) hydrolysoi tärkkelystä, glyko-geeniä ja vastaavia polysakkarideja katkaisemalla sisäisiä a-l,4-glukosidisidoksia sattumanvaraisesti. Tällä entsyymillä on joitakin tärkeitä kaupallisia käyttösovel-5 lutuksia, esimerkiksi sokeri-, panimo-, alkoholi- ja tekstiiliteollisuudessa, α-amylaaseja eristetään laajasta 3 bakteeri-, sieni-, kasvi- ja eläinvalikoimasta. Teolli- J sesti tärkeimpiä o-amylaaseja ovat basilleista eristettä vät a-amylaasit.

; 10 Tärkkelyksen hajotusprosessin ensimmäisessä vaiheessa tärkkelysliete liisteröidään kuumentamalla verrattain korkeassa lämpötilassa (jopa 110öC:ssa). Liisteröity 7 tärkkelys nesteytetään ja dekstrinoidaan lämpökestoisen 15 a-amylaasin avulla jatkuvassa kaksivaiheprosessissa. Tärkeitä prosessimuuttujia ovat tärkkelyspitoisuus, a-amy-laasiannostus, lämpötila ja pH. Nesteytys-dekstrinointi-reaktion aikana prosessimuuttujat on säilytettävä ahtaissa rajoissa, jotta saavutettaisiin hyviä konversiosuhtei-u 20 ta, koska muutoin voi syntyä vakavia suodatusongelmia.

Katso, esimerkiksi L.E. Coker ja K. Venkatasubramanian,: Biotechnology, ss. 165-171, Edit. P.N. Cheremisinoff, P.B. Quellette, Technicom Pubi. Corp. Lancaster Renn.

7s 1985. Yksi ongelmista, joka usein syntyy, on oikea lämpö- 25 tilan säätö hajotusprosessin alkuvaiheessa: ylikuumenemi-nen aiheuttaa usein α-amylaasin denaturoitumisen niin, että ohennus ei ole riittävä. Yksi tapa välttää tämä on lämpökestoisempien a-amylaasien käyttäminen.

30 Tätä tarkoitusta varten on esitetty kalsiumionien tai f· . amfifiilin lisäämistä (katso esim. EP-A-0189838), mutta i — tämä ratkaisu osoittautui epätyydyttäväksi.

™ Siitä johtuen on yhä olemassa huomattavaa kiinnostusta 35 saada aikaan α-amylaaseja, joiden lämpökestoisuus on li-'7 sääntynyt.

3 103285 EP-A-057976:ssa kuvaillaan lämpökestoista α-amylaasia koodittavan geenin eristämistä β. stearothermophilukses-ta. Geeni kloonataan plasmidiin, joka sisältää joko Ba-cilluksen tai E. colin replikaation aloituskohdan. Siten 5 saatua kimeeristä plasmidia käytetään α-amylaasin tuottamiseen. a-amylaasigeeni eristettiin, ja sitä käytettiin ilman lisämodifiointia.

EP-A-0134048:ssa kuvaillaan menetelmää muun muassa a-amy-10 laasin lisääntyvään kaupalliseen tuotantoon, kloonaamalla ja ilmentämällä yksi tai useampi α-amylaasigeeni teollisissa Bacillus-kannoissa.

EP-A-252666:ssa kuvaillaan kimeeristä α-amylaasia, jolla 15 on yleinen kaava Q-R-L, jossa kaavassa Q on 55-60 aminohappotähdettä sisältävä N-terminaalinen polypeptidi, joka on vähintään 75-prosenttisesti homologinen B. amvloli-ouefaciensin a-amylaasin 37:n N-terminaalisen tähteen kanssa, R on tietty polypeptidi ja L on 390-400 aminohap-20 potähdettä sisältävä C-terminaalinen polypeptidi, joka on vähintään 75-prosenttisesti homologinen B. licheniformik-sen a-amylaasin 395:n C-terminaalisen tähteen kanssa.

Gray et. aJL· (J. Bacteriol., 1986, 166. 635) kuvailevat 25 kimeerisiä a-amylaaseja, jotka on muodostettu B. stearot- • · hermophiluksen α-amylaasin NH2-terminaalisesta osasta ja B. licheniformiksen α-amylaasin COOH-terminaalisesta osasta. Useimpien hybridientsyymimolekyyleistä osoitettiin olevan vähemmän pysyviä kuin villityypin kantaent-30 syymien. Edelleen, yhdelläkään hybridimolekyylillä ei osoitettu olevan parannettuja pysyvyysominaisuuksia.

Yhdessäkään edellä siteeratussa viitteessä ei kuvailla yhden aminohapon käsittäviä korvauksia uusien a-amylaasi-35 en saamiseksi.

4 103285 EP-A-0285123:ssa tuodaan esille menetelmä nukleiinihappo-sekvenssien täydellistä mutatointia varten. Esimerkkinä kuvaillaan B. stearothermophiluksen a-amylaasin mutatointia. Vaikka siinä viitataan, että tätä menetelmää voidaan 5 käyttää B. stearothermophiluksen a-amylaasimutanttien aikaan saamiseksi, joiden pysyvyys on parantunut, esimerkkejä ei anneta.

Tämä keksintö koskee eristettyä o-amylaasimutanttia, jol-10 le on tunnusomaista se, että a-amylaasimutantissa ainakin yksi Bacillus licheniformiksesta saatavissa olevan villi-tyypin α-amylaasin aminohappo on korvautunut ja että a-amylaasimutantilla on korvautumisen seurauksena yksi tai useampia seuraavista parannetusta ominaisuuksista verrat-15 tuna villityypin a-amylaasiin: parantunut lämmönkestä- vyys, parantunut stabiilisuus pH:ssa alle 6,5, parantunut stabiilisuus pH:ssa yli 7,5 ja/tai parantunut haponkestä-vyys, jolloin ainakin yksi villityypin aminohappo asemassa Ala-lli, His-133 tai Thr-149 on korvautunut. Keksintö 20 koskee myös menetelmiä sellaisten mutanttien saamiseksi.

Edelleen annetaan käyttöön DNA-sekvenssejä, jotka koodit-tavat näitä mutantteja, vektoreita, jotka sisältävät näitä DNA-molekyylejä ilmennettävässä muodossa ja isän-täsoluja, jotka sisältävät näitä vektoreita.

25

Yhdessä keksinnön mukaisessa näkökohdassa annetaan vielä käyttöön a-amylaaseja, joiden lämmönkestävyys on parantunut, nämä mutantit α-amylaasit vähentävät suodatusongelmia tärkkelyksen hajotuksen käyttöolosuhteissa.

30

Keksinnön mukaisessa lisänäkökohdassa annetaan käyttöön α-amylaaseja, joiden haponkestävyys on parantunut, nämä vähentävät epäedullisten sivutuotteiden muodostumista, kuten maltuloosin, samanaikaisesti ne vähentävät lisättä-35 vän hapon määrää ennen reaktiota amyloglukosidaasin kanssa. Uusilla a-amylaaseilla on edullisesti sekä parannettuja ominaisuuksia koskien lämmönkestävyyttä ja hapon- 5 103285 kestävyyttä että koskien sekä lämmönkestävyyttä että emäksenkestävyyttä.

Keksinnön toisessa näkökohdassa mutanttiproteiineilla 5 osoitetaan olevan parempi suorituskyky tärkkelyksen nesteytyksen käyttöolosuhteissa. Emäksenkestävyys on erityisen käyttökelpoinen käytettäväksi tekstiilien liisterien-poistossa.

10 Näitä näkökohtia kuvaillaan lisää yksityiskohtaisessa kuvauksessa ja esimerkeissä tämän jälkeen.

Kuvio 1: pMa5-8:n nukleotidisekvenssi 15 Stanssens £t ai., 1987, EMBO Laboratory Course Martins-ried, heinäkuussa 1987. Eri elementtien kuvauksen osalta katso teksti.

Kuvio 2: Plasmidin pPROM SP02 insertin nukleotidisekvens-20 si Tämän vektorin konstruointia on kuvailtu EP-A-0224294:ssä. tt-amylaasin aminohapposekvenssiä kuvataan triplettien alapuolella. Numerointi alkaa valmiin prote- 25 iinin ensimmäisestä aminohaposta (Kuhn et ai·, 1982, J.

• « '

Bacteriol., 149. 372). SP02-promoottori-insertti ulottuu paikasta 61 paikkaan 344.

Kuvio 3: pMaTLia6;n nukleotidisekvenssi 30 Tämä vektori konstruoitiin pMa5-8:sta, pPROM SP02:n in-sertistä ja synteettisestä DNA-fragmentista, joka koodit-taa TAC-promoottoria. TAC-promoottorin DNA-fragmentti ulottuu paikasta 3757 paikkaan 3859. a-amylaasin 35 aminohapposekvenssiä kuvataan triplettien alapuolella.

103285 6

Kuvio 4: pMaTLia6:n restriktiokartta

Seuraavat tunnusomaiset restriktioentsyymikohdat ovat saatavilla aukon konstruointia varten a-amylaasigeenissä: 5 BamHI. Spel. SacII. Kpnl. Clal, Narl. Sali. Thtllll.

Xmalll ja BstEII. Sekvensointialukkeet kaikkia mahdollisia aukkoja varten on syntetisoitu, jotta mutaatioiden helppo määrittäminen olisi mahdollista. Plasmidi pMcTLia6 on identtinen pMaTLia6:n kanssa lukuun ottamatta amber-10 kodonin läsnäoloa ampisilliinigeenissä (poistaa Scal-koh- dan) ja amber-kodonin puuttumista kloramfenikoligeenistä (liittyy PvuII-kohdan läsnäoloon).

Kuvio 5: Piirros Bacillus/E. colin sukkulavektorista 15 pBMa/c pMa/c-osa (vasemmalla) mahdollistaa sopivan mutatoinnin i E. colissa. Bacillus subtilis -kasetti (oikealla) sisältää o-amylaasigeenin (tai jonkin muun Bacillus-geenin) 20 sekä lisäksi minimaalisen replikonin replikointia varten t B. subtiliksessa. E. colissa onnistuneen mutatoinnin jäl keen B. subtilis -kasetti voidaan saattaa renkaan muotoon antamalla SP02-promoottorin siirtyä a-amylaasigeenin edellä transformaation yhteydessä Bacillukseen.

; 25

Kuvio 6: pBMa/cl:n restriktiokartta Tämä vektori on spesifinen esimerkki kuviossa 5 hahmotellusta mutatointiekspressiovektorista.

30 (1) ja (2): monikloonauskohtia. Kohdegeeni liitetään koh- j; . dassa (2) . Vaihtelemalla paikkoja kohdissa (1) ja (2) voidaan konstruoida sopivia restriktiokohtia aukollisen dupleksin muodostamiseksi; 35 FDT: transkription terminaattori

Fl.ORI: fagista F1 lähtöisin oleva replikoinnin aloitus-kohta 7 103285 E. coli ORI: replikoinnin aloituskohta pBR322:sta BLA: ampisilliiniresistenssigeeni CAT: kloramfenikoliresistenssigeeni BAC ORI: pUB110:n replikoinnin aloituskohta 5 KANAMYSIINI: pUB110:n kanamysiini(neomysiini)resistenssi- geeni SP02: fagi SP02:n promoottori

Kuvio 7: pBMa/c6Lia6:n restriktiokartta 10 Bacillus licheniformiksen α-amylaasigeeni siirrettiin pBMa/cl:een kuvion 6 sisältämässä monikloonauskohdassa (2). Tässä kuviossa SP02-promoottori osoitetaan numerolla (2), ja £. coli ORI esitetään numerolla (4).

15 Kuvio 8: phoA-signaalisekvenssifracrmentin sekvenssi pMa/- cTPLia6:ssa

Kuviossa on sekvenssi EcoRI-kohdasta TAC-promoottorin yläpuolella valmiin a-amylaasin ensimmäisiin aminohappoi-20 hin saakka. phoA:n aminohapposekvenssi esitetään DNA-sek-venssin alapuolella.

Kuvio 9: Michaelis-Menten-kävrä villitvvpin fWT) ia 2D5-tt-amvlaasille 25 • · ' Tämä graafinen käyrästö osoittaa alkunopeuden koskien entsyymiaktiivisuuksia vastaan substraattikonsentraatio WT- ja 2D5-a-amylaasien osalta. Määritysolosuhteita kuvaillaan esimerkissä 8.

30

Kuvio 10: WT- ia D7-g-amvlaasien lämoöinaktivaatio Tämä käyrästö esittää puoliintumisaikoja sekä WT- että D7-«-amylaaseille CaJ*-pitoisuuden funktiona pH:ssa 5,5 ja 35 lämpötilassa 90,5°C.

103285 8

Kuvio li; WT- ia D7-g-amvlaasien lämpöinaktivaatio

Kuten kuviossa 10 paitsi, että pH on 7,0.

5 Kuvio 12: WT- ia 2D5-g-amvlaasien lämpöinaktivaatio Tämä käyrästö osoittaa puoliintumisaikoja sekä WT- että 2D5-a-amylaaseille Ca2*-pitoisuuden funktiona pHrssa 7,0 I ja lämpötilassa 95°C.

I 10 =. Kuvio 13: WT- ia D7-tt-amvlaasien lämpöinaktivaatio pH:n . funktiona

Kuvio 14: WT- ia 2D5-tt-amvlaasien lämpöinaktivaatio pH:n 15 funktiona

Kuvio 15: DE vastaan 1opdu-pH. mitattuna nesteytyksen jälkeen 110°C:ssa 20 Ilmaisulla "osoittaa parannettuja ominaisuuksia", käytet täessä "mutantti-a-amylaasin" yhteydessä tässä kuvauksessa, tarkoitetaan a-amylaaseja, joilla on korkeampi entsyymiaktiivisuus tai pitempi puoliintumisaika käyttöolosuhteissa tärkkelyksen nesteytyksessä, tekstiilien liis- 25 terinpoistossa ja muissa teollisissa prosesseissa.

"Parannetulla lämmönkestävyydellä" tarkoitetaan, että mu-tanttientsyymi säilyttää aktiivisuutensa korkeammassa | prosessilämpötilassa, tai että se toimii kauemmin kuin 30 villityypin entsyymi, josta se on lähtöisin.

' " « · "Parannetulla haponkestävyydellä" tarkoitetaan, että mu-tanttientsyymi toimii paremmin alemmissa (tai korkeammissa) ρΗ-arvoissa kuin villityypin entsyymi, josta se saa-35 tiin.

103235 9

Tulisi ymmärtää, että parannetut ominaisuudet johtuvat yhden tai useamman aminohapon korvaamisesta toisella.

Kromosomaalista DNA:ta voidaan eristää a-amylaasia sisäl-5 tävästä mikro-organismista. Edullisesti käytetään mikro-organismia, joka kuuluu Bacillus-sukuun. edullisemmin käytetään B. licheniformista. vielä edullisemmin B. licheniformis T5:ttä (katso EP-A-134048). Kromosomaalinen DNA pilkotaan sopivan restriktioentsyymin avulla ja kloo-10 nataan vektoriin. Muutamia mahdollisia valikointitapoja voidaan käyttää, esim. hybridisaatiota, immunologista ilmaisemista ja entsyymiaktiivisuuden ilmaisemista. Pilkotun kromosomaalisen DNA:n kloonaukseen käytettävän vektorin valinta riippuu käytettävissä olevasta valikointi-15 menetelmästä. Jos käytetään hybridisaatiota, erityisiä varotoimenpiteitä ei tarvita. Jos ilmaisu kuitenkin on immunologinen tai perustuu entsyymiaktiivisuuteen, vektorin on sisällettävä oikeat ekspressiosignaalit. a-amylaa-sia sisältävien kloonien varsinainen ilmaisu suoritettiin 20 tärkkelystä sisältävillä agarmaljoilla. Kasvatuksen ja inkuboinnin jälkeen J2-höyryssä, kehät positiivisten kloonien ympärillä ilmaistaan. Seuraavassa vaiheessa määritetään geenin sekvenssi. Saatua aminohapposekvenssiä käytetään vertailuun muiden tunnettujen a-amylaasisek-25 venssien suhteen, jolloin saadaan ensimmäinen käsitys • f tärkeistä aminohapoista (esim. aktiivinen kohta, Ca2':n sidonta, mahdolliset S-S-sillat). Parempi osoitus saadaan, kun 3D-rakenne määritetään. Koska tämä on hyvin työlästä, käytetään usein toista lähestymistapaa. 3D-ra-30 kenteen puuttuessa, käytetään ennustusohjelmia sekundaa-rirakenne-elementtien määrittämiseksi (esim. α-kierre, β-levy(sheet), mahdollisesti tertiäärirakenne-elementtejä, esim. β-tynnyri(barrel) määritetään. Katsauksen saamiseksi, katso Janin, J. ja Wodack, S.J., Prog. Biophys. Mo-35 lec. Biol. 1983, 42, 21-78.

103285 10

Arvokkaita aminohappokorvauksia voidaan kuvitella. Prote-iinirakenteen pysyvyys määritetään vapaaenergian net-toerona proteiinin laskostuneiden ja laskostumattomien konformaatioiden välillä. Koska proliinitähde on rajoit-5 tunut harvempiin konformaatioihin kuin muut aminohapot, proteiinin laskostamisen koniiguraationaalinen entropia vähenee (ja pysyvyys siten lisääntyy), kun aminohappo korvataan proliinilla. Toinen käyttökelpoinen substituutio on glysiini alaniiniksi korvaus. Sellaiset tähteet 10 kuin treoniini, väliini ja isoleusiini, joilla on haarautuneet β-hiilet, rajoittavat rungon koniormaatiota enemmän kuin haarautumattomat tähteet.

Koska osa tiettyjen proteiinien lämmönkestävyydestä joh-15 tuu suolasilloista, voi olla edullista liittää lysiini-ja arginiinitähteitä (Tomozic S.J. ja Klibanov A.M., J. Biol. Chem., 1988, 263. 3092-3096). Sen lisäksi lysiinin korvautuminen arginiinitähteillä voi parantaa suolasilto-jen pysyvyyttä, koska arginiini kykenee muodostamaan li-20 sävetysidoksen. Katsauksena katso Wigby, D.B. et ai.

Biochem. Biophys. Res. Comm. 1987, 149. 927-929. Aspara-giinin ja glutamiinin deamidaation mainitaan aiheuttavan entsyymirakenteen vakavaa murtumista, korvautuminen ei-amiditähteillä voi estää tämän murtumisen. Aminohappokor-25 vautumiset tehdään parhaiten mutatoimalla DNA-tasolla.

Mutatointikokeita voidaan periaatteessa suorittaa välittömästi eristetyistä klooneista. Insertti kloonataan kuitenkin edullisesti mutageneesi/ekspressiovektoriin. Sat-30 tumanvarainen mutatointi on mahdollista ja samoin on = ' paikkakohdisteinen mutatointi. Ottaen huomioon edellisen menetelmän mutatoitujen kloonien huomattava määrä, ja koska yhdenkään a-amylaasin 3D-rakenteen ei tiedetä mahdollistavan tieteellistä arvelua koskien paikkakohdis-35 teista mutatointia, päätettiin keksinnön mukaisesti suorittaa "sattumanvarainen" mutatointi spesifisissä alueissa .

11 103285

Seuraavassa on mahdollinen lähestymistapa tämän keksinnön toteuttamiselle.

Geeniä modifioidaan ensin liittämällä "hiljaiset" rest-5 riktiokohdat. Ei-hiljäisten restriktiokohtien liittäminen on myös mahdollista. Tämä mahdollistaa geenin spesifisten alueiden poistamisen. Toiseksi geeni kloonataan fasmi-diin. Tämä fagin ja plasmidin yhdistelmä helpottaa yksi-juosteisen DNA:n valmistamista. Mahdollisia ovat myös 10 muut tavat saada aikaan yksijuosteista DNA:ta. Hybri-disoimalla denaturoitu kaksijuosteisen vektorin (plus insertti) DNA vektori-inserttiyhdistelmän kanssa, joka sisältää aukon insertissään, saatiin aikaan epäjatkuvaa (aukkoista) heterodupleksi-DNA:ta (yksityiskohtaisen ku-15 vauksen saamiseksi katso Morinaga, Y et ai. 1984, Biotechnology, 2, 636).

Aukkoa käytetään kemialliseen tai entsymaattiseen muta-tointiin. Keksinnön mukaan käytettiin edullisesti bisul-20 fiittimenetelmää (Folk ja Hofstetter, Cell, 1983, 33.

585), ja entsymaattista väärinyhdistelymenetelmää käytetään (Lehtovaaran et ai. modifioitu versio, Prot. Eng., 1988, 2, 63). Näitä menetelmiä voidaan käyttää siten, että jokainen yksinkertainen nukleotidi aukon kohdalla 25 korvataan kaikilla kolmella muulla nukleotidillä (satu- • · raatiomutageneesi). Jälkimmäistä menetelmää voidaan käyttää usealla tavalla. Yhdessä niistä synteettinen aluke hybridisoidaan aukkoon. Seuraavaksi suoritetaan pidentä-misreaktio, jossa se deoksinukleotidi, joka on komplemen-30 taarinen ensimmäisen deoksinukleotidin kanssa 3'-puolella alukkeesta, puuttuu. Periaatteessa kaikki kolme muuta deoksinukleotidiä voidaan siten liittää. Tämä voidaan saada aikaan joko käyttämällä kolmen deoksinukleotidin seosta tai käyttämällä kolmea erillistä reaktiota, joista 35 kukin sisältää vain yhden deoksinukleotidin. Toinen menetelmän käyttötapa tuottaa sattumanvaraisia klooneja. Tässä yhteydessä toimeenpannaan neljä erillistä reaktiota, 12 103285 joista kukin sisältää yhden rajoittavan deoksinukleoti-din. Tämä antaa toisia (second) juosteita, jotka pysähty-l vät ennen jokaista yksinkertaista nukleotidiä. Seuraavat [ vaiheet voidaan suorittaa kuten edellä on kuvailtu. Sekä 5 bisulfiittimenetelmää että entsymaattista mutatointi- i: menetelmää käytettiin mutanttien saamiseksi.

- Entsymaattisten ominaisuuksien testaamiseksi voi olla h tarkoituksenmukaista ilmentää kloonatut geenit samassa ö 10 isännässä kuin mitä käytettiin mutatointikokeiden aikana.

u Periaatteessa tämä voi olla mikä tahansa isäntäsolu edellä lyttäen, että näille soluille on saatavissa sopivia muta- geneesi/ekspressiovektorisysteemejä. Suurimmaksi osaksi j| E. coli on erittäin sopiva työskentelyä varten, esimer- □ 15 kiksi E. coli WK6. Näiden pesäkkeiden kasvatuksen jälkeen mikrotiitterilevyillä, näiden levyjen kaivojen näytteitä ^ sijoitetaan agarmaljoille, joihin on lisätty tärkkelystä, ,, ja jotka on puskuroitu eri pH-arvoihin. Positiiviset !” kloonit voidaan ilmaista kehänmuodostuksen avulla. Seu- i= 20 lontaa sopivien puskureiden kanssa voidaan käyttää vali- i koitaessa lämmönkestävyyden, haponkestävyyden, emäksen- kestävyyden, suolankestävyyden tai jonkin muun kestävyy- ™ den suhteen, joka voidaan seuloa.

. 25 Sopivia isäntäkantoja mutanttisten a-amylaasien tuottami- seksi ovat transformoitavat mikro-organismit, joissa a-amylaasin ilmentyminen voidaan saada aikaan. Erityisesti ™ saman lajin tai suvun isäntäkannat, joista a-amylaasi on peräisin, ovat sopivia, kuten esimerkiksi Bacillus-kanta.

: 30 Edullisesti käytetään a-amylaasinegatiivista Bacillus- kantaa, edullisemmin α-amylaasi- ja proteaasinegatiivista Bacillus-kantaa.

Esimerkiksi B. licheniformis T9:ää on käytetty suurten 35 mutantti-a-amylaasimäärien tuottamiseksi.

13 103285

On edullista, että tuotettavat α-amylaasit erittyvät kasvualustaan (fermentoinnin aikana), mikä helpottaa niiden talteenottoa. Mitä tahansa sopivaa signaalisekvenssiä voidaan käyttää erittymisen aikaansaamiseksi.

5

Ilmentynyt α-amylaasi erittyy soluista ja voidaan myöhemmin puhdistaa jollakin sopivalla menetelmällä. Geelisuo-datus ja Mono Q -kromatografia ovat esimerkkejä sellaisista menetelmistä. Eristetyn a-amylaasin lämpöinaktivaa-10 tio testattiin erilaisissa Ca2*-pitoisuuksissa (0,5-15 mM) ja laajalla pH-alueella (5,5-8,0). Kokeita suoritettiin myös käyttöolosuhteissa. Erityisesti mutantti-o-amylaasi testattiin tärkkelyksen nesteytysolosuhteissa pH:ssa 5,5 ja 5,25. Lisäksi on testattu käyttösovellutuksia liiste-15 rin poistamiseksi tekstiileistä.

Joidenkin seulottavien mutanttien ominaisuudet ovat sopivampia halutuissa toteutusolosuhteissa.

20 Tämä keksintö tuo esille a-amylaaseja, joiden lämmönkes-tävyys, haponkestävyys ja emäksenkestävyys on parantunut. Yleensä aminohappokorvautumisten lukumäärä ei ole tärkeä niin kauan kuin mutatoidun proteiinin aktiivisuus on sama tai parempi kuin villityypin entsyymillä, a-amylaasimu-25 tantit eroavat vähintään yhden aminohapon osalta villi-tyypin entsyymistä, edullisesti mutantit eroavat 1-10 aminohapon osalta. Spesifisiin mutantteihin, joilla on parannettuja ominaisuuksia, lukeutuu a-amylaasimutantte-ja, jotka sisältävät yhden tai useamman aminohappokorvau-30 tumisen seuraavissa paikoissa lii, 133 ja 149 (numerointi on yhdenmukainen B. licheniformiksen α-amylaasin suhteen) . Edullisia aminohappokorvautumisia ovat Ala-lll-Thr, His-133-Tyr ja Thr-149-Ile.

35 Sellaisten mutanttientsyymien suorituskyky on parantunut pH-arvoissa alle 6,5 ja/tai yli 7,5. Suorituskyky on myös lisääntynyt korkeissa lämpötiloissa, mikä johtaa pidenty- 103285 14 neeseen puoliintumisaikaan esimerkiksi lämpötiloissa 110°C saakka.

Monet saatavissa olevat a-amylaasituotteet saadaan bak-5 teerilähteistä, erityisesti basilleista, esim. β. subti-liksesta. B. licheniformiksesta. B. stearothermophiluk-sesta. B. coacrulansista ja β. amvlolicmefaciensiksesta. Näiden entsyymien homologia- ja yhtäläisyysaste on korkea (Yuuki e£ ai·, J. Biochem., 1985, 98/ 1147; Nakajima et 10 aJL., Appi. Microbiol. Biotechnol., 1986, 22, 355). Edullisia mutaatioita koskevaa tietoa, joka on saatu yhdestä näistä a-amylaaseista, voidaan sen vuoksi käyttää muiden amylaasien parantamiseksi. Tämä keksintö koskee lähestymistapaa sellaisen tiedon saamiseksi.

15

Seuraavassa kuvaillaan käytettyjä koemenetelmiä ja esimerkkejä keksinnön valaisemiseksi. Esimerkit ovat vain keksinnön valaisemista varten eikä niitä ole tarkoitettu millään tavalla rajoittamaan keksinnön piiriä.

20 1. Yleiset kloonaustekniikat

Kloonausmenetelmiä käytettiin kuten T. Maniatis et a_l. on kuvaillut käsikirjoissa, 1982, Molecular Cloning, Cold 25 Spring Harbour Laboratory; F.M. Ausubel et al., 1987,

Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc., New York; B. Perbal, 1988, A Practical Guide to Molecular Cloning, 2nd edition, John Wiley & Sons Inc., New York. Näissä käsikirjoissa kuvaillaan yksityiskohtai-30 sesti toimintaohjeita rekombinantti-DNA-molekyylien konstruoimiseksi ja lisäämiseksi, geenikirjastojen vai- | « mistusmenetelmiä, menetelmiä DNA:n sekvensoimiseksi ja mutatoimiseksi ja ohjeita DNA-molekyylien käsittelemiseksi entsymaattisesti.

35 15 103285 2. Kemiallinen mutatointi

Kloonattua DNA:ta voidaan käsitellä in vitro kemikaaleilla mutaatioiden tuottamiseksi DNA:hän. Jos nämä mutaatiot 5 kohdennetaan aminohappoa koodittaviin triplettikodonei-hin, mutatoitua proteiinia voidaan tuottaa routatoidun kloonatun DNA:n avulla. Menetelmää kemialliseksi mutatoi-miseksi natriumbisulfiitin avulla kuvaillaan Shortle'n ja Botstein'in toimesta (Methods Enzymol., 1983, 100. 457).

10 Folk ja Hofstetter (Cell, 1983, 33., 585) kuvailevat edullista menetelmää. Smith, Ann. Rev. Genet., 1985, 19, 423, kuvailee muita mutatointimenetelmiä. Ausubel et ai., ibid, kuvailee erityisen käyttökelpoista protokollaa.

15 3. Mutaaeneesi. joka kohdistuu epäjatkuvaan DNA-duplek- siin

Epäjatkuvaan dupleksiin (Kramer e£ ai·, 1984, Nucl. Acids Res. 12, 9441) ja fasmidiin (plasmidi/fagihybridi) perus-20 tuvaa menetelmää käytettiin. Menetelmä perustuu pääasiallisesti epäjatkuvaan DNA-dupleksivälituotteeseen, joka sisältää aukkoisen juosteen (-juosteen), joka sisältää villityypin antibioottiresistenssimarkkerin, ja templaat-tijuosteen (+juosteen), joka sisältää amber-mutaation 25 geenissä, joka antaa antibioottiresistenssin. Pariutta-mismenettelyn jälkeen mutageeninen oligonukleotidi tulee liitetyksi aukkoiseen juosteeseen in vitro aukontäyttö-ja tiivistysreaktion aikana. Tuloksena olevia molekyylejä käytetään transformoitaessa epäsopivuuden (mismatch) kor-30 jäämiseen kykenemätön (Mut S) isäntä, jossa kytkentä aiotun mutaation ja antibioottiresistenssimarkkerin välillä • säilyy. Tästä kannasta eristetyn fasmidisekapopulaation annetaan sitten segregoitua suppressorinegatiivisessa isäntäkannassa. Transformantit maljataan antibioottia 35 sisältävälle alustalle, mikä siten aiheuttaa aukollisesta juosteesta peräisin oleville polville valintapainetta.

103285 16

Kaksoisvektorisysteemi pMa/c5-8, jota Stanssens et ai. kuvailivat (Nucl. Acids Res., 1989, 17, 4441) koostuu seuraavista osista: 5 pos 11-105: bakteriofagi fd, terminaattori pos 121-215: bakteriofagi fd, terminaattori pos 221-307: plasmidi pBR322 (pos 2069-2153) pos 313-768: bakteriofagi fi, replikaation aloituskohta j (pos 5482-5943) 10 pos 772-2571: plasmidi pBR322, replikaation aloituskohta ja β-laktamaasigeeni ! pos 2572-2685: transposoni Tn903 pos 2519-2772: tryptofaaniterminaattori (kaksinkertainen) pos 2773-3729: transposoni Tn9, kloramfenikoliasetyylit-! 15 ransferaasigeeni pos 3730-3803: monikloonauskohta - Sekvenssi kuvataan kuviossa 1.

^ pMa-tyypin vektorissa nukleotidi 3409 muutetaan G:stä A:- 20 ksi, kun taas pMc-tyypin vektorissa nukleotidi 2238 muutetaan G:stä C:ksi, mikä saa aikaan amber-lopetuskodoneja asetyylitransferaasigeenissä ja vastaavasti β-laktamaasi-geenissä, mikä tekee mainituista geeneistä inaktiivisia.

M

= ^ 25 Kaikki mainitut sekvenssit saatiin Genbank'lta (TM) (jul kaisu 54), National Nucleic Acid Sequence Data Bank, NIH USA. Plasmidi pMc5-8 on talletettu merkinnällä DSM 4566. Mutageneesin suorittamista varten kohde-DNA-fragmentti kloonataan pMa5-8:n monikloonauskohtaan. Seuraavaksi 30 konstruoidaan aukkoinen dupleksi pMa5-8:n, joka sisältää kohde-DNA:n, ja pMc5-8:n välillä.

Yksijuosteinen aukkoalue, joka sisältää kohde-DNA:n, voidaan mutatoida mutageenisen oligonukleotidin avulla, pit-35 kien synteettisten oligonukleotidien avulla, pienen määrän kanssa väärinyhdisteltyjä nukleotidejä, kemikaalien avulla tai nukleotidien entsymaattisen väärinyhdistelyn 103285 17 avulla, myös sattumanvaraista mutageneesi PCR:ää (polymerase chain reaction) voidaan käyttää. Yksityiskohtaisen kuvauksen osalta, katso Ausubel gt ai., ibid, tai Perbal, ibid. Vaihtoehtona in vitro mutageneesille voidaan käyt-5 tää in vivo mutageneesia joko UV-valon tai kemikaalien avulla, tai käyttämällä £. colin mutaattorikantaa (Fowler et ai., J. Bacteriol., 1986, 167. 130).

Mutageenisia nukleotidejä voidaan syntetisoida käyttämäl-10 lä laitetta, joka on saatavissa Applied Bio Systems’Itä.

4. Sattumanvarainen mutatointi entsvmaattisen nukleotidien väärinvhdistelvn avulla 15 Aukkoinen pMa/pMc-dupleksi voidaan saattaa ketjun pidennykseen alukkeella ja väärinyhdistelymutatointiin, kuten alunperin Shortle et ai. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1982, 79, 1588), B.C. Cunningham ja J.A. Wells (Prot.

Eng., 1987, 1, 319) ovat kuvailleet, tämän menetelmän 20 modifikaatiota on kuvaillut Lehtovaara et, ai., (Prot. Eng., 1988, 2, 63).

Tämä menetelmä perustuu polymeraasien hallittuun käyttöön. Neljä DNA-molekyylipopulaatiota muodostetaan ensin 25 aukkoisen pMa/pMc-dupleksin alukkeella pidentämisen avul la siten, että ne päättyvät sattumanvaraisesti, aukossa, mutta aina juuri ennen tunnettua emäslajia (ennen A:ta, B:tä, C:tä tai vastaavasti T:tä). Kukin neljästä populaatiosta mutatoidaan sen jälkeen erillisessä väärinyhdiste-30 lyreaktiossa, jossa oikea emäs voidaan nyt jättää pois.

Näin menetellen, kaikentyyppisiä emässubstituutiomutaati-oita voidaan muodostaa aukon jokaisessa kohdassa. Sek-venaasin (TM) (U.S. Biochemical Corporation) käyttö oli edullista Klenow-polymeraasin käyttöön nähden. Lisäksi 35 käytettiin käänteistä MoMuLV-transkriptaasia käänteisen A.M.V.-transkriptaasin sijasta, jota Lehtovaara et ai. ibid, käytti.

103285 18

Yhden kohdan käsittävien substituutioiden varmistamiseksi, Lehtovaaran et ai., ibid, kuvailemaan toimintaohjeistoon on keksinnön mukaisesti liitetty seuraava muunnos. Käänteisen transkriptaasin puskurissa on läsnä kolmen 5 asemesta vain yksi väärinyhdistelevä nukleotidi. Esimerkiksi A-spesifisesti rajoitettua emäspidennysseosta inku-boidaan kolmessa erillisessä reaktiossa, joissa on läsnä 250 μΜ dCTPra, 250 μΜ dGTPra ja vastaavasti 250 μΜ dTTP:a. Täydellistä sarjaa varten, joka käsittää 4 emäss-10 pesifisesti rajoitettua pidennysseosta, suoritetaan kaikkiaan 12 erillistä väärinyhdistelyreaktiota käsittävä sarja. 1,5 tunnin inkuboinnin jälkeen 42°C:ssa, lisätään j pysäytysliuosta (chase), joka käsittää kaikki neljä deok- sinukleotidiä pitoisuudessa 0,5 mM, ja reaktioita inku-15 boidaan vielä vähintään 20 minuuttia 37°C:ssa. Näytteitä käsitellään sen jälkeen edelleen Lehtovaaran et ai.

(ibid. 1 mukaisesti, sellaisen muunnoksen avulla, että vastavalintaa urasiiliä sisältävään DNA-juosteeseen ei :: käytetty, vaan käytettiin vastavalintaa, joka perustui 20 pMa/c-vektoriin.

j_ 5. g-amylaasimutanttien tuottaminen E. coli -kannan WK6 (Zell, R. ja Fritz, H.J., EMBO J., P f 25 1987, 6, 1809) transformantteja, jotka sisälsivät eks- {- ’ pressiovektorin, joka sisälsi minkä tahansa a-amylaasira- kenteen, siirrostettiin TB-alustaan (10 ml) 30°C:ssa. TB-alusta sisälsi 0,017 M KH2P04:a, 0,072 M K2HPO,:a, 12 g/1 Ts Bacto-tryptonia, 24 g/1 Bacto-hiivauutetta, 0,4 % glyse- 4.4 30 rolia ja antibioottia (ampisilliiniä pMa-rakenteiden ja f=? kloramfenikolia pMc-rakenteiden kanssa). viljelmänäyttei- : : *· tä käytettiin siirrostettaessa 250 ml:aan TB-alustaa 2 ; litran pulloissa. OD600-arvon ollessa 10-12, 0,1 mM IPTG:a j (isopropyyli-p-d-tiogalaktopyranosidia) lisättiin ja in- 35 kubointia jatkettiin toiset 12-16 tuntia.

103285 19 6. α-amvlaasimutanttien puhdistaminen

Solut kerättiin talteen sentrifugoimalla ja resuspendoi-tiin puskuriin, joka sisälsi 20 % sakkaroosia 0°C:ssa.

5 Toisen sentrifugoinnin jälkeen solut resuspendoitiin kylmään veteen. Solujäänteet poistettiin kolmannen sentrifugoinnin avulla ja supernatantin pH säädettiin arvoon 8,0 20 mM TRIS-puskurin avulla. CaCl2:a lisättiin loppupitoi-suuteen 50 mM. Materiaalia lämpökäsiteltiin 15 min. ajan 10 70°C:ssa, ja liukenematon aines poistettiin sentrifugoi- malla. Supernatantti suodatettiin 0,22 μ Millipore-suoti-men läpi ja väkevöitiin l/10:aan lähtötilavuudesta.

Jatkopuhdistus saatiin aikaan käyttämällä geelisuodatusta 15 (TSK HW-55- Merck) ja Mono Q -kromatografiaa. Ennen kro-matografointia Mono S:llä, entsyymiaktiivisuutta sisältävien fraktioiden pH säädettiin 4,8:ksi käyttäen nat-riumasetaattia. α-amylaasi eluoitiin 250 mM NaCl:n avulla. Inaktivoitumisen välttämiseksi pH säädettiin välittö-20 mästi 8,0:ksi.

Esimerkki 1

Bacillus licheniformiksen cc-amvlaasiaeenin molekulaarinen kloonaus 25

Bacillus licheniformis T5:stä (EP-A-134048; CBS 470.83) eristettyä kromosomaalista DNA:ta pilkottiin restriktio-entsyymillä EcoRI ja liitettiin pUBll0:n (Gryczan, T.J. et ai.. J. Bacteriol., 1978, 134. s. 318) EcoRI-kohtaan. 30 Ligaatioseos transformoitiin Bacillus subtilis lA40:een (Bacillus Genetic Stock Center). Neomysiinille resisten- * « tit pesäkkeet testattiin a-amylaasituotannon suhteen HI-agarmaljoilla (DIFCO), joihin oli lisätty 0,4 g/1 tärkkelystä (Zulkowsky’n tärkkelystä, Merck). Kasvatuksen ja 35 inkuboinnin jälkeen J2-höyryssä, positiivinen pesäke, joka tuotti laajan kirkaskehän, valittiin jatkokarakterisointiin. Tästä positiivisesta pesäkkeestä eristetyn 103285 20 plasmidin osoitettiin sisältävän 3,4 kiloemästä (ke) sisältävän EcoRI-EcoRI-fragmentin, joka oli lähtöisin Bacillus licheniformis T5:stä. Tälle plasmidille annettiin nimeksi pGB33 (EP-A-134048; CBS 466.83). a-amylaasia koo-5 dittava insertti liitettiin synteettiseen Shine-Dalgarno-sekvenssiin ja bakteriofagi SP02-promoottoriin, josta oli tuloksena plasmidi pProm SP02 (katso EP-A-0224294; CBS 696.85). pProm SP02:n insertin nukleotidisekvenssi, määritettynä Sangerin menetelmällä (Proc. Natl. Acad. Sei.

10 U.S.A., 1977, 74, 6463), esitetään kuviossa 2. Sekvens sissä esiintyy o-amylaasia koodittava suuri avoin lukukehys, joka on käytännöllisesti katsoen identtinen Bacillus lieheniformiksen α-amylaasisekvenssin kanssa, jonka Yuuki et ai. (ibid.1 on määrittänyt. Ensimmäiset 29 aminohappoa 15 käsittävät signaalisekvenssin, joka lohkeaa irti a-amy- laasin erittymisen aikana. Aminohappojen numerointi kaikkialla tässä patenttihakemuksessa viittaa numerointiin valmiin proteiinin mukaan.

20 Yuukin sekvenssi poikkeaa seuraavissa paikoissa: paikassa 134 Arg on läsnä Leu:n asemesta; paikassa 310 Ser on läsnä Gly:n asemesta; paikassa 320 Ala on läsnä Ser:n asemesta.

25 Esimerkki 2

Mutaaeneesi/ekspressiovektoreiden pMaTLia6 konstruointi

Plasmidi pPROM SP02 pilkottiin EcoRI:llä ja Bell:llä. ja 1,8 ke EcoRI-Bell-insertti puhdistettiin ja kloonattiin 30 EcoRI-BamHI:llä pilkottuun pMa5-8:aan. Tämä pMa5-8-vekto-ri oli ennalta varustettu modifioidulla monikloonauskoh-dalla. BamHI-HindIII-fraermentti. joka ulottuu paikasta 3767 paikkaan 3786 kuviossa 1, vaihdettiin synteettiseen DNA-sekvenssiin, koska se lukee paikasta 5647 paikkaan 35 5660 kuviossa 3. Tämä suoritettiin joidenkin a-amy- laasigeenin sisällä olevien restriktiokohtien tekemiseksi tunnusomaisiksi. Tuloksena oleva cc-amylaasigeenin sisäl- : 21 103285 tävä pMa5-8-johdannainen pilkottiin EcoRI:llä ja BamHI:-llä ja liitettiin synteettiseen DNA-fragmenttiin, joka kuljetti TAC-promoottorin kopiota (De Boer et ai·, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 1983, 80, 21). Tämän synteetti-5 sen DNA-fragmentin sekvenssi kuvataan kuviossa 3 yhdessä lopullisen α-amylaasin mutageneesi/ekspressiovektorin pMaTLia6 kanssa paikasta 3757 paikkaan 3859. Tämä lopullinen α-amylaasin mutageneesi/ekspressiovektori tehtiin valmiiksi sisällyttämällä useita hiljaisia restriktiokoh-10 tia, jotka on tarkoitettu tuottamaan aukkoja a-amy- laasigeenissä mutageneesikokeiden aikana (kuvio 4). Tätä tarkoitusta varten on tehty seuraavat mutaatiot käyttäen paikkakohdennettua oligonukleotidimutatointia: 15 - Spel-kohta on liitetty hiljaisella mutaatiolla:

T49T ja S50S

ACG —> ACT AGC —> AGT

- Narl-kohta on liitetty hiljaisella mutaatiolla:

20 A269A

GCG —> GCC

- Bstll-kohta on liitetty juuri TAG-lopetuskodonin alapuolelle 25

TAGAAGAGC —> TAGGTGACC

Tämä α-amylaasin mutageneesi/ekspressiovektori pMaTLia6 sopii mutatointiin aukkodupleksimenetelmällä. Sopivilla 30 restriktioentsyymeillä pilkottu kaksijuosteinen pMaTLia6 ,, DNA on pariutettu yksijuosteiseen pMcTLiaö DNA:hän.

• V

9

Tuloksena olevat yksijuosteiset aukkokohdat on altistettu paikkakohdennettuun mutatointiin, kemialliseen mutatoin-35 tiin ja sattumanvaraiseen entsymaattiseen mutatointiin kuten kokeellisessa jaksossa on kuvailtu.

1032S5 22 TAC-promoottorin läsnäolo α-amylaasigeenin edessä mahdollistaa α-amylaasin indusoituvan ilmenemisen E. colissa lisäämällä IPTG:a.

5 Plasmidi pMaTLiaö E. coli WK6:ssa talletettiin tunnuksella CBS 255.89 2. kesäkuuta 1989.

Esimerkki 3

Bacillus/E. colin sukkulavektorin konstruointi mutacrenee-10 siä ia ilmentämistä varten 1 Tämä vektori mahdollistaa liitetyn geenin mutatoinnin E.

I colissa ja välittömän ilmentymisen Bacilluksessa. Vekto rin konstruointiin valittuna strategiana oli pUB110-joh-15 dannaisen (Gryczan, ibid.) yhdistäminen pMa/c-kaksoisvek- torisysteemin kanssa siten, että: 1. B. subtilis -kasetti voidaan poistaa yksinkertaisella restriktio/religointi-kokeella.

20 2. Erilaiset cc-amylaasigeenit ja erilaiset promoottorit voidaan helposti kloonata tähän vektoriin.

" 3. Renkaanmuodostuksen jälkeen kloonattu geeni on sopivan 25 Bacillus-promoottorin ohjauksessa.

• · 4. E. colissa suoritettavan mutatoinnin aikana Bacilluk-sen promoottori ja rakenteellinen «-amylaasigeeni ovat fyysisesti erillään, mikä estää α-amylaasin mahdollisen „ 30 letaalin kerääntymisen E. coliin.

Kaaviomainen piirros sukkulavektorista esitetään kuviossa 5. Vektorin pBMa/cl lopullisen version rakennetta kuvataan kuviossa 6. Vektori pBMal on talletettu tunnuksella 35 CBS 252.89, 2. kesäkuuta, 1989. Vektori on konstruoitu I seuraavasti: 103285 23 - pUBHOin EcoRI-SnaBI-fracmentti. joka sisältää REP-gee-nin ja NeoR-geenin, puhdistettiin ja kloonattiin EcoRI-Sinal: 1 lä pilkottuun pUC8: aan.

5 - tämän pUC8-johdannaisen EcoRI-HindIII-fracmentti kloo nattiin EcoRI-Hindlll:11a pilkottuun pMa5-8:aan, josta oli tuloksena plasmidi pMa5-80.

- BamHI-Xbal-polylinkkerifracmentti korvattiin synteetti-10 sellä DNA-fragmentilla, joka koodittaa bakteriofagi SP02:n (Williams et al., J. Bacteriol., 1981, 146. 1162) SP02-promoottoria, sekä restriktiotunnistuskohdilla Sa-cll:lle, Aoal:lie. Xhol: lie. SacI:lie. Ball:lie. Mlul:lie ja Xbal: lie.

15 - pMa5-80:n tunnusomaista EcoRI-kohtaa käytettiin poly-linkkerifragmentin liittämiseksi, joka koostuu seuraavis-ta tunnistuskohdista: EcoRI. Smal, SacI. EcoRV. Sohi.

Kpnl. Xbal ja Hindlll.

20

Spesifisiä tarkoituksia varten pBMa/cl:stä on kehitetty johdannaiset pBMa/c2 ja pBMa/c6.

- pBMa/c2:ssa pBMa/cl:n EcoRI-HindiΙΙ-polvlinkkeri on 25 korvattu pUC19:n vastaavalla polylinkkerillä.

« - pBMa/c6:ssa lisäksi SacII-kohta pBMa/cl:n oikeassa po-lylinkkerissä on poistettu Klenow-reaktion avulla.

30 Paikkakohdennettu mutageneesi koskien β. licheniformiksen : α-amylaasigeeniä suoritettiin pBMa/c6 Lia6:n konstruoin nin jälkeen. Tämä vektori konstruoitiin liittämällä pMaT-Lia6:sta eristetty BamHI-HindIII-fracmentti edellä mainittuun pBMa/c6:een, joka katkaistiin BamHI:llä ja Hin-35 dIII:lla. Tuloksena olevaa plasmidia (kuvio 7) voidaan käyttää epäjatkuvien (aukkoisten) dupleksien konstruointiin £. colissa tapahtuvaa mutatointia varten.

103285 24

Tuloksena olevia mutantteja on ilmennetty Bacillus subti-lis lA40:ssä (BGSC 1A40) Sacl-restriktion. religoinnin ja transformaation jälkeen Chang'in ja Cohen'in mukaan (Mol. Gen. Genet., 1979, 168. 111).

5

Esimerkki 4

Bacillus licheniformiksen oikein prosessoidun g-amvlaasin ilmentäminen E. colissa 10 pMaTLia:n tuottaman α-amylaasin (esimerkki 2) karakterisointi osoitti, että osa a-amylaasista oli väärin prosessoitunut erityksen aikana. NH2-terminaalinen sekvensointi osoitti ylimääräisen Alaniini-tähteen E. coli WK6:ssa tuotetussa a-amylaasissa.

15

Vaikka ei ole osoitusta siitä, että tämä antaa erilaisia ominaisuuksia amylaasille, α-amylaasin signaalisekvenssi on korvattu alkalisen fosfataasin PhoA-signaalisekvens-sillä. Tätä tarkoitusta varten suoritettiin mutatointikoe 20 Fspl-restriktiokohdan liittämiseksi pMaTLia6:een signaa-lipeptidin ja valmiin α-amylaasin liitoskohdassa. Pilkkomisen jälkeen FspI:llä ja BamHI:llä. synteettinen DNA-fragmentti, joka koodittaa phoA-sianaalisekvenssiä (Michaelis et ai., J. Bacteriol., 1983, 154. 366), lii-25 tettiin. Tämän rakenteen sekvenssi esitetään kuviossa 8. pMa/cTPLia6:n tuottaman α-amylaasin osoitettiin sisältävän oikea NH2-terminaalinen sekvenssi.

Esimerkki 5 30 Pysyvän g-amvlaasin seulonta A. Haponkestävien g-amvlaasimutanttien seulonta a-amylaasimutantteja, jotka toimivat paremmin tai huonommin matalassa pH:ssa kuin villityypin a-amylaasi, voidaan 35 valikoida vertailemalla kehiä tärkkelysmaljoilla, jotka on puskuroitu eri pH-arvoissa, tärkkelyksen värjäämisen jälkeen jodiliuoksella.

103285 25

Menetelmä: 1. Kasvatus 5 Mahdollisia mutantteja kasvatetaan mikrotitrauslevyissä.

Kasvualustana on 250 μΐ Brain Heart Infusion -liemi (DIF-CO). Seuraavat lisäykset suoritetaan:

kloramfenikoli 50 μg/ml 10 I.P.T.G. (SIGMA) 0,2 mM

CaCl2 2 mM

Pesäkkeitä poimitaan agarmaljoilta steriileillä hammastikuilla ja siirrostetaan mikrotitrauslevyn erillisiin kai-15 voihin (96). Kuhunkin levyyn sisällytetään 4 villityypin pesäkettä kontrolliksi.

Nämä mikrotitrauslevyt sijoitetaan 37°C:seen 40 tunnin ajaksi ilman ravistelua.

20 2. Levvtesti Tämän ajanjakson jälkeen, jolloin a-amylaasia muodostuu, otetaan 5 μ1:η näytteitä kustakin kaivosta ja sijoitetaan 25 kahdelle eri tyyppiselle agarlevylle (144 x 140). Ensimmäinen tyyppi on rikas Heart-lnfusion-agarlevy (DIFCO) + 0,4 % tärkkelystä (Zulkowsky-tärkkelys-Merck) + kloram-fenikolia 50 μg/ml. 16 tunnin inkuboinnin jälkeen 37°C:-ssa tämä levy toimii mutanttivarastona.

30 ... Toinen levytyyppi on varsinainen seulontalevy, joka si sältää:

Bacto-agaria (DIFCO) 1,5 %

Zulkowsky-tärkkelystä 0,2 % 35

Agar ja tärkkelys liuotetaan synteettiseen johtoveteen (STW). Tämä sisältää: demineralisoitua vettä + 103285 26

CaCl2:a 2 mM

MgCl2: a 1 mM

NaHC03:a 2,5 mM BSA:a 10 Mg/ml 5

Seulontalevyt puskuroidaan 5 M kaliumasetaattipuskurikan-- taliuoksen 100-kertaisella laimennuksella tässä alustas sa. Kantaliuosten pH-arvot ovat 4,80; 5,0 ja 5,2 huoneen l lämpötilassa. Lopulliset pH-arvot agarlevyllä ovat mitat- i 10 taessa jonkin verran matalampia kuin kantaliuosten pH:t.

h Kustakin kaivosta siirrostetaan 5 μΐ viljelmää kolmelle ii L seulontalevylle, joissa on eri pH-arvot.

pH-alue valitaan siten, että villityypin a-amylaasin 15 osalta on jäljellä hyvin vähän tai ei lainkaan aktiivi-suutta maljalla, jonka pH on matalin.

n 3. Värjäys : 20 Seulontalevyjä inkuboidaan 2 tunnin ajan 55°C:ssa. Tämän “ ajanjakson jälkeen levyjen päälle kaadetaan J2-liuosta.

10 x J2-liuos sisältää 30 g J2:a ja 70 g KJ:a litrassa.

— Kirkastumisen määrä siirrostuspisteissä korreloi a-amy- T- 25 laasin jäännösaktiivisuuteen kyseisessä pH-arvossa. Ne ” mutantit, jotka toimivat paremmin kuin villityyppikont- rollit, valitaan toiselle seulontakierrokselle. Villityypin kehät ovat hyvin toistettavia tässä kokeessa.

30 4. Toinen seulonta

Positiiviset mutantit poimitaan rikkaalta levyltä ja puhdistetaan tuoreilla HI-levyillä + kloramfenikoli. Kusta-kin mutantista poimitaan neljä erillispesäkettä ja ne 35 testataan uudelleen samalla tavalla kuin ensimmäisessä seulonnassa. Näistä viljelmistä tehdään lisäksi laimenin nussarjoja STW:n kanssa, ja nämä laimennukset siirroste-

IjS

103285 27 taan seulontalevyille, joiden pH on neutraali (pH = 7,0). Vertaileminen villityypin viljelmiin antaa mahdollisuuden päättää, johtuuko parempi suorituskyky matalassa pH:ssa a-amylaasin paremmasta kokonaistuotannosta vaiko olennai-5 sesti pysyvämmästä a-amylaasista.

Mutantit, jotka "selviävät" toisessa seulonnassa, karakterisoidaan määrittämällä nukleotidisekvenssi siitä geenin osasta, jolle mutatointi suoritettiin.

10 B. Emäksenkestävän g-arovlaasin seulonta

Emäksenkestävien a-amylaasien seulonta suoritetaan samalla tavalla, jota käytettiin haponkestävän a-amylaasin 15 kohdalla. Mikrotitrauslevyillä kasvatuksen jälkeen ote taan 5 μ1:η näytteitä kustakin kaivosta ja siirrostetaan varastolevylle ja varsinaiselle seulontalevylle. Viimeksi mainittu sisältää: 20 Bacto Agaria (DIFCO) 1,5 %

Zulkowskyn tärkkelystä 0,2 % ja tehdään valmiiksi demineralisoidulla vedellä, joka sisältää 25

CaCl2:a 2 mM

MgCl2: a 1 mM

NaHCO-,: a 2,5 mM

BSA:a 10 μq/ml 30 λ Seulontalevyt puskuroidaan 50 mM karbonaatti/bikarbonaat- ti-puskurilla, pH-arvojen ollessa 9,0, 9,5 ja 10,0. pH-alue valitaan siten, että korkeimmassa pH-arvossa on hyvin vähän tai ei lainkaan villityypin a-amylaasiaktiivi-35 suutta. Kahden tunnin inkuboinnin jälkeen 55°C:ssa, J2- liuosta valetaan levyjen päälle. Ne mutantit, jotka tuottavat paremman kehän kuin villityypin entsyymi, valitaan 103285 28 toiselle seulontakierrokselle. Tämä toinen seulontakier-ros suoritetaan samaan tapaan kuin haponkestävyyden seulonta.

5 C. Lämmönkestävien g-amvlaasimutanttien seulonta α-amylaasimutantit, jotka toimivat paremmin tai huonommin korkeassa lämpötilassa kuin villityypin α-amylaasi, voidaan myös valikoida vertailemalla kehiä tärkkelyslevyil-10 lä, jotka kuumennuksen jälkeisissä viljelyliemien sisältämä amylaasin jäännösaktiivisuus on aiheuttanut.

Menetelmä: ' 15 1. Mutantteja kasvatetaan samaan tapaan kuin pH-seulon- nassa.

2. Mutantteja replikoidaan HI-agarlevyillä kuten pH-seu-lonnassa.

20 3. Mikrotitrauslevyjen erilliset kaivot suljettiin kerta-käyttötulpilla (Flow Laboratories) kasvuliemien haihtumisen estämiseksi kuumennusvaiheen aikana.

25 4. Mikrotitrauslevyjä kuumennettiin vesihauteessa 1 tun- « nin ajan 95°C:ssa. Kuumennuksen jälkeen mikrotitrauslevyt asetettiin sentrifugiin koko näytteen keräämiseksi mikro-titrauslevyn pohjalle.

30 5. Lämmönkestävien mutanttien seulonta tehtiin seuraavas ti:

Kustakin kaivosta siirrostettiin 5 μΐ viljelmää neutraaleille seulontalevyille (Katso pH-seulonta). Näitä levyjä inkuboitiin 1 tunnin ajan 55°C:ssa.

35 Tärkkelyksen värjäämisen jälkeen jodiliuoksella, mutantit ja kontrollit voidaan seuloa cc-amylaasin jäännösaktiivi- 103285 29 suuden suhteen vertailemalla siirrostuspisteiden kirkastumia (kehiä).

Siinä tapauksessa, että kontrollien jäännösaktiivisuus on 5 liian korkea, laimennussarjoja on valmistettava ja siir-rostettava seulontamaljalle, jotta kyetään erottamaan mutantit, jotka ovat läramönkestävämpiä kuin villityypin entsyymi.

10 6. Mahdolliset kiinnostavat mutantit jatkotestataan kuten tehtiin pH-seulontamenetelmässä.

A- tai B-seulontalajin yhdistelmää C-lajin kanssa voidaan käyttää, jos halutaan yhdistelmä ominaisuuksista. Esimer-15 kiksi ensimmäisen seulontakierroksen jälkeen, koskien emäksenkestävää a-amylaasia, toinen seulontakierros voidaan suorittaa lämmönkestävyyden osalta. Ne mutantit, jotka arvostellaan positiivisiksi molemmissa testeissä, voidaan valita ehdokkaina, jotka ilmentävät haluttujen 20 ominaisuuksien yhdistelmää.

Esimerkki 6 pMaTLiaS:n bisulfiittimutaqeneesi 25 pMaTLia6:n yksijuosteista DNA:ta pariutettiin SacII- ** Clal:llä pilkotun pMcTLia6:n kanssa, jotta saataisiin heterodupleksi, jossa on aukko, joka ulottuu paikasta 4315 paikkaan 4569 (kuvio 3). Tälle heterodupleksille suoritettiin bisulfiittimutatointi (katso kokeellinen 30 osa).

Transformoinnin jälkeen E. coli WK6 mut S:ään (Zell, R. ja Fritz, H.J., ibid.) ja valikoinnin jälkeen kloram-fenikolia sisältävillä agarlevyillä (50 μς/πιΐ) plasmidi-35 kertymät eristettiin ja transformoitiin E. coli WK6:een.

E. coli WK6 Mut S talletettiin tunnuksella CBS 472.88, Ej_ 103285 30 coli WK6 talletettiin tunnuksella CBS 473.88. Tuloksena olevia transformantteja kasvatettiin BHI-alustassa (DIF-CO) , joka sisälsi 2,0 mM CaCl2:a, 50 Mg/ml kloramfeniko-lia ja 0,20 mM IPTG:a (SIGMA) 40 tunnin aikana 37°C:ssa 5 mikrotiitterikaivoissa ravistelematta. pH:n osalta pysyvien mutanttien seulonta suoritettiin kuten esimerkissä 5 on kuvailtu.

Noin 300 CmR-transformanttia (kloramfenikoliresistenttiä) 10 seulottiin. Mutaatiofrekvenssi, määritettynä DNA:n sekvensoinnin avulla, oli keskimäärin 0,4 mutaatiota/mole-kyyli aukon kohdalla. Yksi haponkestävä mutantti, D7, identifioitiin pH-seulonnan jälkeen. Tämän mutantin sekvensointi osoitti mutaation H133Y, joka oli lähtöisin 15 koodittavan tripletin mutaatiosta CAC —> TAC.

- Mutantti D7 todettiin positiiviseksi myös lämmönkestävyy- den seulontamäärityksessä (esimerkki 5).

20 DNA:n sekvensointi suoritettiin yksijuosteisella DNA:11a i spesifisen oligonukleotidin kanssa, joka oli suunniteltu 1 alukkeeksi juuri ennen SacII-Clal-fragmenttia. Erillises sä mutatointikokeessa seulottiin 1000 CmR-transformant-tia. Toinen haponkestävä mutantti, 2D5, identifioitiin . . 25 pH-seulonnan jälkeen. Tässä mutantissa on seuraavat mu- « taatiot:

H133Y CAC —> TAC

T149I ACA —> ATA

i 30 ; Bisulfiittimutatointia on käytetty samaan tapaan kuin U juuri on kuvailtu Clal-Sa11-aukkoon, joka ulottuu paikas- ; ta 4569 paikkaan 4976 kuviossa 3. Noin 300 CmR-transfor- manttia seulottiin (mutaatiofrekvenssi 0,6 mutaatiota/mo-j 35 lekyyli). Yhtään haponkestävää transformanttia ei todet tu. Joukko happolabiileja mutantteja todettiin. Näiden 103285 31 happolabiilien mutanttien joukossa joillakin saattaa olla siirtynyt pH-spektri, mikä johtaa enemmän emäksenkestä-vään fenotyyppiin.

5 Esimerkki 7 pMaTLia6:n entsvmaattinen mutaaeneesi

Yksijuosteinen pMaTLia6 (kuvio 4) pariutettiin Clal-Sa-JJrllä pilkotun pMcTLia6:n kanssa, jotta saataisiin hete-10 rodupleksi, joka ulottuu paikasta 4569 paikkaan 4976 (kuvio 3). Epäjatkuva dupleksi mutatoitiin entsymaattisen väärinyhdistelyn avulla, kuten kokeellisessa osassa on kuvailtu.

15 dATP-rajoitetun alukkeella pidennyksen jälkeen saatu näy te jaettiin kolmeen osaan ja inkuboitiin käänteisen tran-skriptaasin läsnä ollessa dCTP:n, dGTP:n ja vastaavasti dTTP:n kanssa. Kymmenen minuutin inkuboinnin jälkeen 37°C:ssa annettiin pysäytysliuosta (chase-pulssi), joka 20 sisälsi kaikkia neljää dNTP:a ja Klenow-polymeraasia, T4-DNA-ligaasia lisättiin ketjunpidennyksen lopettamiseksi kokonaan kaksijuosteisiksi molekyyleiksi.

Nämä molekyylit transformoitiin £. coli WK6 Mut S:ään ja 25 plasmidikertymät otettiin talteen. Nämä plasmidikertymät *' transformoitiin seuraavaksi £. coli WK6:een ja pesäkkeet valikoitiin kloramfenikolia (50 μg/m1) sisältävillä agar-maljoilla. Tuloksena olevat mutantit seulottiin a-amylaa-sin pysyvyyden suhteen kuten esimerkissä 5 on kuvailtu.

30

Toisessa kokeessa Spel-SacII-aukko saatettiin rajoitettuun pidennykseen alukkeella dATP:n, dCTPrn, dGTP:n ja vastaavasti dTTPrn kanssa. Nämä alukekertymät mutatoitiin väärinyhdistelyn avulla (katso kokeellinen osa). 100 Cm*-35 transformanttia testattiin pH-levyillä (esimerkki 5) ja mutantti M29 identifioitiin pysyvämpänä matalassa pH:ssa. Mutaation sekvenssi määritettiin: 32 103285

A111T GCG —> TCG

Esimerkki 8

Pysyvien mutanttien ominaisuuksia 5

Kaksi bisulfiittimutatointikokeista saatua mutanttia karakterisoitiin edelleen. Kuten aikaisemmin on kuvailtu, DNA:n sekvensointi osoitti seuraavat aminohappokorvautu-miset; 10 - D7 sisälsi tyrosiinin paikassa 133 histidiinin sijasta (D7 = H133Y), - 2D5 sisälsi D7-mutaation ja lisäksi treoniini 149 oli 15 korvautunut isoleusiinilla (2D5 = H133Y, T149I).

3 a) Entsyymiaktiivisuuden määrittäminen B. licheniformiksen α-amylaasi WT:n ja mutanttien entsyy-20 miaktiivisuus määritettiin käyttäen 4-nitrofenyyli-malto-pentaosidia (4NP-DP5) substraattina, 4-nitrofenolia ja maltopentaoosia muodostuu, tätä reaktiota voidaan seurata - mittaamalla muutos OD 405:ssä. Määritys suoritettiin

35°C:ssa liuoksessa, joka sisälsi 50 mM MOPS:a, 50 mM

7. ^ 25 NaCl: a, 2 mM CaCl2:a (pH 7,15) ja 0,1 mM 4NP-DP5:a. Al- “ ** kunopeudet mitattiin ja E-nitrofenolille otettiin arvoksi s 10 000 1/M/cm. Kuviossa 9 esitetään tulokset WT- ja 2D5- α-amylaaseille. Vmaks. ja Km laskettiin ja ilmoitetaan taulukossa 1.

3 30 : Taulukko 1

Vmaks. (Mmoolia/min/mg) Km (mM) 35 WT 66,7 + 0,9 0,112 ± 0,005 2D5 66,3 ± 0,7 0,119 + 0,004 103285 33

Taulukko 1 osoittaa selvästi, että α-axnylaasi 2D5:n mutaatiot eivät vaikuta entsyymiaktiivisuuteen oleellisesti .

b) Ca2<:n vaikutus lämpöinaktivaatioon 5 Lämpöinaktivaatiokokeita suoritettiin WT:lle, D7:lle ja 2D5:lle erilaisissa kalsiumpitoisuuksissa. Menetelmä oli seuraavanlainen: 10 1) Demetallisaatio

Entsyymiä (2-3 mg/ml) dialysoitiin 24 tunnin ajan vastaan 3x11 20 mM MOPS

5 mM EDTA 5 mM EGTA pH 7,0 15 3x11 20 mM MOPS pH 7,0 2) Remetallisäätio - 500 μΐ puskuria 100 mM (esim. MES, MOPS, EPPS)* 20 - 145 μΐ demetallisoitua entsyymiä (esim. 2,15 mg/ml) - 100 μΐ CaCl2: a (100, 50, 30, 20, 10, 5 tai 2,5 mM) - x μΐ K2S0,:a (100 mM) - (255-x) μΐ H20 25 [CaCl2] loppu- [K2S0,] loppu- (mM) (mM) 0,25 14,75 0,5 14,5 30 1 14 ; 2 13 3 12 5 10 10 0 35 _ 103285 34 * - pH MES esim. 6,77 huoneen lämpötilassa antaa 6,0 90°C: ssa (pKa 6,15 pKa/°C = -0,011) - pKa:t olivat Table of Merck'stä (Zwitterionische Puffersubstanzen) 5 3) Lämpöinaktivaatio

Yhtä ml huoneen lämpötilassa esi-inkuboitua entsyymili-uosta kuumennettiin 90,5°C:ssa tai 95°C:ssa suljetuissa 10 Pierce-pulloissa (teflon-päällystetyt tiivisteet) pitoi suudessa noin 0,2 mg/ml. 50 μ1:η näytteitä otettiin säännöllisin välein 0 ja 6 tunnin välillä ruiskulla ja jäähdytettiin jäiden päällä. Jäännösaktiivisuudet on määritetty 4NP-DP5:n kanssa (0,5 mM).

15

Puoliintumisajät määritettiin käyttäen yksinkertaista eksponentiaalista hajoamisen soviteohjelmaa (GRAPHPAD).

Kuviot 10 ja 11 esittävät WT- ja D7 -α-amylaasien puo-' 20 liintumisaikoja pH:ssa 5,5 ja vastaavasti 7,0 Ca2*-pitoi- suuden funktiona 9 0,5°C:ssa. 2D5:n riippuvuus Ca2*:sta on määritetty vain pH:ssa 7,0 95°C:ssa (kuvio 12). Voidaan myös havaita, että mutanttien riippuvuus Ca2*:sta ei eroa WT:n vastaavasta.

25 ·· c. g-amylaasimutanttien lämmönkestävyvs eri pH-arvoissa Lämpöinaktivaation riippuvuus pH:sta koskien sekä D7:ää että 2D5:ttä on määritetty 90.5 ja vastaavasti 95°C:ssa 30 käyttäen puskuria kuten edellä on kuvailtu 1 mM Ca2*-pi-toisuudessa. Voidaan päätellä, että sekä D7:n että 2D5:n ‘ lämmönkestävyys lisääntyy tuntuvasti (jopa kaksinkertai- Γ seksi 2D5:llä) koko pH-alueella. (kuviot 13 ja 14).

M

ai 103285 35

Esimerkki 9

Mutanttientsyymien tuottaminen Bacilluksessa

Mutaatiot g. licheniformiksen a-amylaasissa, jotka iden-5 tifioitiin ilmentämällä E. coli WK6:ssa, siirrettiin Ba-cilluksen ekspressiovektoriin kahdella eri tavalla.

a) α-amylaasigeenin sisältämien tunnusomaisten restrik-tiokohtien avulla, fragmentteja, jotka sisältävät mutaa- 10 tioita, eristettiin pMaTLia6-mutanteista ja subkloonat- tiin pBMa6.Lia6:n homologiseen paikkaan. Viimeksi mainittu plasmidi, joka voi replikoitua joko £. colissa tai Bacilluksessa. pilkottiin seuraavaksi Sacl:llä ja muutettiin uudelleen renkaaksi T4 DNA-ligaasin avulla. Trans-15 formoinnin jälkeen Bacillus subtilis lA40:een saatiin suuri määrä a-amylaasituotantoa SP02-promoottorin ohjauksessa. Uudelleen renkaaksi muutettu pBMa6.Lia6 on nimetty pB6.Lia6:ksi vektorin £. coli -osan poistamisen osoittamiseksi .

20 b) pBMa6.Lia6:n yksijuosteista DNA:ta kerättiin £. colis-ta ja pariutettiin restriktioentsyymillä pilkotun pBMc6.Lia6:n kaksijuosteisen DNA:n kanssa, jotta saataisiin aukkoinen dupleksi tavoitellun aukon ollessa a-amy- 25 laasigeenissä. Tälle aukkoalueelle suoritettiin sen jäi-• keen paikkakohdennettu mutatointi oligonukleotidin kanssa (kuten kokeellisessa jaksossa on kuvailtu), joka koodit-taa haluttua mutaatiota. pBMc6.Lia6-vektori transformoidaan sen jälkeen pB6.Lia6-tyypin vektoriin kuten edellä 30 on kuvailtu. Erilaisten yhtä paikkaa käsittävien mutaati-. oiden yhdistelmä voidaan toteuttaa menetelmällä a), jos mutaatiot ovat eri aukoissa, edullisesti kuitenkin käytetään menetelmää b).

35 Mutanttien D7 ja 2D5 mutaatiot siirrettiin pBMa6.Lia6:een menetelmällä a) vaihtamalla SacII-Sall-fragmentit, ja a-amylaasi otettiin talteen transformoidun Bacillus subti- 103285 36 lis 1Α40:η alustasta. Kummankin mutantin supernatanteille ; suoritettiin esimerkkien mukaisia seulontamenettelyjä, ja varmistettiin, että kumpikin mutanteista tuottaa a-amy-laasia, joka on haponkestävämpi ja lämmönkestävämpi kuin . 5 a-amylaasi, jota villityyppi pB6.Lia6 on tuottanut.

α-amylaasimutaatioiden fenotyyppi Bacilluksessa ei siis ole erilainen kuin fenotyyppi E. colissa.

l 10 Lopuksi pB6.Lia6-mutantit on transformoitu Bacillus Π licheniformis T9:ään, joka on Bacillus licheniformis T5:n h.

(EP-0253455, CBS 470.83) proteaasinegatiivinen, a-amy-laasinegatiivinen johdannainen. Isäntää T9 on käytetty * suurten a-amylaasimutanttimäärien tuottamiseen homologini 15 sessa systeemissä. Kromosomaalisen a-amylaasigeenin pois- ™ taminen tekee tästä kannasta erittäin sopivan mutantin a- amylaasin tuottamiseen, koska ei tuoteta yhtään konta-™ minoivaa villityypin α-amylaasia. Tästä kannasta talteen

t“S

jj otettua entsyymiä on käytetty teolliseen käyttösovellu- ™ 20 tustestaukseen. Mutanttien pB6.Lia6.2D5 ja pB6.Lia6.D7 teollinen hyöty osoitettiin.

4_ Esimerkki 10

Mutantin kävttösovellutustesti tärkkelyksen nestevtvksen 25 olosuhteissa .1___ · f ^ Mutantin α-amylaasi 2D5:n testaamiseksi todenmukaisemmis- sa olosuhteissa, fermentointiliemi (esimerkin 9 mukainen) on puhdistettu ultrasuodatuksen avulla ja entsyymi formu-IZ. 30 loitu 50-%:isen propyleeniglykolin avulla. Kolme näytettä — on testattu: ΖΞ ,· 893701: WT B. licheniformis T5:n a-amylaasi 1530 4 TAU/g 893703: 2D5 WT:n tavoin valmistettu mutantti 2820 I 35 TAU/g ΓΖ Maxamyl 0819 Kaupallinen näyte 7090 TAU/g 103285 37

Yksi TAU (thermostable α-amylase unit) määritellään ent-syymimääränä, joka muuttaa standardoiduissa olosuhteissa 1 mg:n tärkkelystä minuutissa tuotteeksi, jolla on ver-tailuväriä vastaava absorptio 620 nm:ssä jodireaktion 5 jälkeen. Standardiolosuhteet ovat pH 6,6; 30°C; reaktioaika: 20 min. Vertailuväri on 25 g CoC12.6H20, 3,84 g K2Cr207 ja 1 ml HCl:a (IM) 100 ml:ssa tislattua vettä.

1. Nestevtvskoe matalassa pH:ssa (5.5 ia 5.251 10 Tärkkelyslietteen lämpötila nostetaan 110 + 0,5°C:seen niin nopeasti kuin mahdollista ja pidetään tässä lämpötilassa 6 minuutin ajan.

15 Nesteytys toteutetaan jatkuvana virtauksena (5,4 1/h).

Kolme 135 ml:n näytettä (1,5 nesteytysminuuttia) otetaan 45, 60 ja 75 nesteytysminuutin jälkeen ja pidetään 95°C:-ssa kahden tunnin ajan. Tämän ajan kuluttua 50 ml näytteestä hapotetaan 0,4 ml:11a H2S0,:a IN, jotta saadaan pH 20 3,5 ja asetetaan kiehuvaan hauteeseen 10 minuutin ajaksi entsyymiaktiivisuuden lopettamiseksi ennen D.E.-määritystä .

Loppuosa näytteestä jäähdytetään jäännösentsyymiaktiivi-25 suuden määrittämiseksi.

> ' Lietteen koostumus: 3,3 kg maissitärkkelystä ka. 88 % (2,904 kg kuivaa tärk-kiä) .

30 5,45 1 kaivovettä (40 T.H).

Lietteen kuiva-aine on 33 %.

.· pH korjataan 5,5:n kohdalle IN rikkihapon tai IN NaOH:n avulla.

35 Entsyymipitoisuus: 4,4 TAU/g kuivaa tärkkelystä. Virtaus nopeus varmistetaan kaksi tai kolme kertaa kokeen aikana.

103285 2. D.E.:n määrittäminen

Nesteytetyn tärkkelyksen kuiva-aine varmistetaan refrak-tometrillä (noin 34 %). D.E. määritetään hyvin tunnetulla 5 Lane Eynon menetelmällä. Tulokset esitetään kuviossa 15.

3. Jäännösentsvvmiaktiivisuus Jäännösamylaasiaktiivisuus nesteytetyssä tärkkelyksessä 10 määritetään Brabender-amylografilla.

40 g perunatärkkelystä ; 390 ml tislattua vettä 50°C:ssa 50 ml Tris-puskuria 0,05 M pH 6,50 15 5 ml CaCl2.2HzO:a 30g/l Lämpötila nostetaan 80°C:seen (1,5°C/min) , kun viskositeetti on stabiloitunut (10 min.), 5 ml laimennettua t nesteytettyä tärkkelystä (7 g 50 ml:ksi tislatulla vedel- 20 lä) lisätään, viskositeetin alenema 20 minuutin kuluttua mitataan, tämä alenema on entsyymiaktiivisuuden funktio, f Standardikäyrä tunnetulla entsyymipitoisuudella mahdol listaa jäännösaktiivisuuden estimoinnin T.A.U-yksiköissä.

25 Mutantti 2D5 toimii merkittävästi paremmin pH:ssa < 5,5 -t— * t ja 110°C kuin WT-entsyymi. 2-3 DE-yksikön parannus pH:ssa — 5,25 saadaan mutantilla 2D5.

;_ Esimerkki 11 30 Mutantin g-amvlaasin käyttösovellutuskoe tekstiilien liisterinpoiston olosuhteissa

Alkalisten α-amylaasimutanttien teollisen käyttösovellutuksen testaamiseksi suoritetaan koe pysyvyydestä 20°C:-35 ssa seuraavassa liuoksessa: • >

Claims (9)

1. 39 103285 1.4 % H202 (35 %) 1,0-1,5 % kaustinen sooda (100 %) 15-20 ml/ natriumsilikaatti (38 Be) 0,3-0,5 % alkyylibentseenisulfonaatti (Lanaryl N.A.-
2. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen eristetty a-amylaasi-mutantti, tunnettu siitä, että se sisältää ainakin yhden seuraavista aminohappokorvautumisista: Ala-111-30 Thr, His-133-Tyr tai Thr-149-Ile.
3. .: 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen eristetty a-amylaasi- mutantti, tunnettu siitä, että aminohappokor-vautuminen on yksi tai useampi seuraavista: Ala-lll-Thr,

   35 His-133-Tyr tai Thr-149-Ile. 103285
4. 4. DNA-sekvenssi, joka koodaa jonkin patenttivaatimuksista 1 - 3 mukaista o-amylaasimutanttia.
5. 5. Ekspressiovektori, joka sisältää patenttivaatimuksen 4 5 mukaisen DNA-sekvenssin.

   5 ICI) 0,5-1,0 % orgaaninen stabiloimisaine (Tinoclarite G) 2.5 tunnin inkuboinnin jälkeen suotuisten ominaisuuksien perusteella valituilla α-amylaasimutanteilla tulisi olla 10 jäännösentsyymiaktiivisuutta. Patentt ivaat imukset 15 l. Eristetty α-amylaasimutantti, tunnettu siitä, että a-amylaasimutantissa ainakin yksi Bacillus licheni-formiksesta saatavissa olevan villityypin a-amylaasin aminohappo on korvautunut ja että cc-amylaasimutantilla on korvautumisen seurauksena yksi tai useampia seuraavista 20 parannetusta ominaisuuksista verrattuna villityypin oc- amylaasiin: parantunut lämmönkestävyys, parantunut stabiilisuus pH:ssa alle 6,5, parantunut stabiilisuus pH:ssa yli 7,5 ja/tai parantunut haponkestävyys, jolloin ainakin yksi villityypin aminohappo asemassa Ala-lll, His-133 tai 25 Thr-149 on korvautunut. *
6. 6. Bakteeri-isäntäsolu, joka sisältää patenttivaatimuksen 5 mukaisen ekspressiovektorin.
7. 7. Menetelmä α-amylaasimutantin valmistamiseksi, tun nettu siitä, että menetelmässä a) viljellään patenttivaatimuksen 6 mukaisia soluja sellaisissa olosuhteissa, joissa saadaan tuotettua a-amy-laasimutanttia, ja ‘ 15 b) otetaan a-amylaasimutantti talteen viljelmästä.
8. 8. Menetelmä tärkkelyksen hajottamiseksi, tunnet- t u siitä, että saatetaan tärkkelys kosketukseen jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukaisen mutatoidun «-amy-7 20 laasin kanssa riittävän pitkäksi ajaksi ja sellaisissa olosuhteissa, jotta a-amylaasi saa aikaan tärkkelyksen hajoamisen.
9. 9. Menetelmä liisterin poistamiseksi tekstiileistä, 25 tunnettu siitä, että saatetaan liisteriä sisäl-' tävä tekstiili kosketukseen mutatoidun a-amylaasin kanssa riittävän pitkäksi ajaksi ja sellaisissa olosuhteissa, jotta saadaan aikaan liisterin poisto tekstiilistä. 30