CN100396777C - 一种嗜热碱性α-淀粉酶及其编码基因 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种α-淀粉酶及其编码基因。该酶具有嗜热碱性，其最适反应温度约为60℃，最适反应pH值约为10，该酶能水解淀粉为相应的单糖和寡糖，在发酵、纺织、制药品食品加工等方面具有重要的应用价值。

Description

一种嗜热碱性α-淀粉酶及其编码基因

技术领域

本发明涉及一种酶及其编码基因，特别涉及一种嗜热碱性α-淀粉酶及其编码基因。

背景技术

淀粉是由α-葡萄糖单元通过α-1，4或α-1，6糖苷键组成，分为直链淀粉和支链淀粉。淀粉除供食用外，在工业上用途也很广泛，如通过发酵造酒和通过水解制糖。由于淀粉有复杂的结构，要降解淀粉需要多种酶。这些酶可被简单地分为2类：外切酶和内切酶。内切酶如α-淀粉酶(EC3.2.1.1)，外切酶如β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)。

α-淀粉酶(α-amylase，EC 3.2.1.1)，也称液化型淀粉酶，其水解淀粉多糖分子如直链淀粉和支链淀粉中α-1，4-糖苷键，产生单糖和寡糖。长期以来α-淀粉酶一直被用于多个领域。例如，在发酵业中它一直被用于谷物和马铃薯的糖化，在纺织业中用作淀粉糊去除剂，在制药业中用作助消化药，而在食品业中用于制造粘稠的麦芽糖浆。α-淀粉酶已经从细菌、真菌、植物和动物等许多不同的来源中获得。

高温α-淀粉酶具有：(1)降低淀粉醪黏度，减少输送时的动力消耗；(2)杂菌污染机会少；(3)热稳定性好，对钙离子的需要少等优点，从而在许多生产领域，特别是酶法生产葡萄糖及果葡糖浆、酒精及味精等生产中，耐高温α-淀粉酶正逐步取代常温α-淀粉酶。高温α-淀粉酶主要是来自细菌包括温菌(Takagi等，Bacterial and Mold Amylase，The Enzymes，New York，Academic Press，1971)、中度嗜热菌(Antranikian，AppliedBiochemistry and Biotechnology，20/21：267-279，1989；Glymph等，Appliedand Environmental Microbiology，34：391，1977；Hasegawa等，J.Biochem，79：35-42，1976)和超嗜热菌(Koch等，Arch.Microbiol，155：572-578，1991；Schumann等，FEBS Letters，282：122-126，1991)，如嗜热芽孢菌(Bacillusstearothermophilus)(Bramm等，第5612202号美国专利，申请日1997年3月18日)、好热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter finii)和乙酸乙基嗜热拟杆菌(Thermobacteroides acetoethylicus)(Antranikian等，第4929557号美国专利，申请日1990年5月29日)，热硫化氢梭菌(Clostridiumthermohydrosulfuricum)(Zeikus等，PCT国际专利申请WO 8601831，申请日1986年12月9日)，火球菌(Pyrococcus furiosus)(Laderman等，第5578479号美国专利，申请日1996年11月26日；Kelly等，第6355467号美国专利，申请日2002年3月12日)。微生物产生α-淀粉酶种类多，不同来源的α-淀粉酶具有多方面不同性质，从而导致各具特色的应用范围。因而需要持续不断地开发新特性α-淀粉酶以更好地满足工业需要。

关于α-淀粉酶基因有专利和文献报道。如Kato等报道了硫化叶菌(Sulfolobus sp.)的α-淀粉酶基因(第6391595号美国专利，申请日2002年5月21日)；Ito等报道了假单胞菌(Pseudomonas sp.)的α-淀粉酶基因(第6087147号美国专利，申请日2000年7月11日)；Kidd等报道了嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila.)的α-淀粉酶基因(J Appl Microbiol，92：289-96，2002)；Kim等报道了栖热菌(Thermus sp.)的α-淀粉酶基因(Appl Environ Microbiol，65：1644-51，1999)；Dautor等报道了嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的α-淀粉酶基因(Biochemistry，38(26)，8385-8392，1999)。

目前在自然界中发现的大部分α-淀粉酶在中性到酸性pH范围内表现出最大且稳定的酶切活性，但在pH 9-10的碱性溶液中却很少发挥作用。已知只有少数的碱性α-淀粉酶在碱性的pH范围内表现最大的活性。碱性α-淀粉酶是指酶最适工作pH高于8的α-淀粉酶，这些碱性α-淀粉酶包括由芽胞杆菌(Bacillus sp.)A-40-2产生的一种酶(Horikoshi，K.等，Agric.Biol.Chem.，35，1782，1971)，由芽胞杆菌NRRL B-3881产生的一种酶(Boyer，E.等，J.Bacteriol.，110，992，1972)，由链霉菌(Streptomyces)KSM-9产生的一种酶(日本公开专利61-209528)，由芽胞杆菌H-167产生的一种酶(日本公开专利62-208278)，由芽胞杆菌A3-8产生的一种酶(日本公开专利2-49584)，以及由嗜盐碱球菌(Natronococcus)AH-36产生的一种酶(日本公开专利4-211369)。上述碱性α-淀粉酶大部分是将淀粉或淀粉相关糖分解为葡萄糖、麦芽糖或麦芽三糖的所谓糖化α-淀粉酶。虽然它们能有效地用于制糖业中，但如果将它们用作洗涤剂的酶却会产生问题。因此，仍然需要寻找对用于洗涤剂中的表面活化剂具有抗性并以一种高度随机的方式分解淀粉或淀粉相关多糖的所谓的液化型碱性α-淀粉酶。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种基因，其能编码一种嗜热碱性的α-淀粉酶。

本发明的另一目的是提供一种嗜热碱性α-淀粉酶，其可在较高温度和较高pH值条件下水解淀粉。

本发明的另一目的是提供一种能表达嗜热碱性α-淀粉酶的重组质粒。

本发明的再一目的是提供一种能产生嗜热碱性α-淀粉酶的重组菌。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提出一种编码嗜热碱性α-淀粉酶的基因，其具有选自于下列a)、b)或c)的核苷酸序列：

a)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；

b)由于遗传密码的简并性，不同于SEQ ID NO：1但编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：1所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列；

c)在严格杂交条件下与上述a)或b)中的序列杂交，并且编码具有活性的嗜热碱性α-淀粉酶的核苷酸序列。

在本发明的一个实施例中，上述编码嗜热碱性α-淀粉酶的基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

本发明提出一种嗜热碱性α-淀粉酶，其具有选自于下列d)、e)或f)的氨基酸序列：

d)上述a)、b)或c)所述的核苷酸序列编码的氨基酸序列；

e)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；

f)上述e)中缺失、替换或插入一个或多个氨基酸后的氨基酸序列，并且具有该序列的蛋白质有嗜热碱性α-淀粉酶的活性。

在本发明的一个实施例中，上述嗜热碱性α-淀粉酶具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

本发明提出一种表达嗜热碱性α-淀粉酶的重组质粒，其至少包括上述编码嗜热碱性α-淀粉酶的基因。

在本发明的一个实施例中，上述重组质粒的载体为pET-28a(+)。

本发明提出一种产生嗜热碱性α-淀粉酶的重组菌，该菌内导入了上述编码嗜热碱性α-淀粉酶的基因。

在本发明的一个实施例中，上述重组菌例如为大肠杆菌，优选为大肠杆菌BL21菌株。

应当指出的是，上述提到的术语“严格条件”在本说明书中的含义是指在该条件下形成了所谓特异杂交而没有形成非特异的杂交。例如，该严格条件可以是，相互之间的同源性不小于70％的DNA之间可以杂交而低于上述数值的DNA之间不能杂交，优选的是同源性不少于90％的DNA之间可以杂交。相对于Southern杂交中普通洗涤条件而言，可以例如为如下的杂交条件：将杂交膜置于预杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.0，7％SDS)中，50℃预杂交30min；弃预杂交液，加入杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.0，7％SDS，同位素标记的核苷酸片段)，50℃杂交12hr；弃杂交液，加入洗膜液I(2×SSC和0.1％SDS)，50℃洗膜2次，每次30min；加入洗膜液II(0.5×SSC和0.1％SDS)，50℃洗膜30min。

本发明涉及的嗜热碱性α-淀粉酶基因编码的氨基酸序列与其它已报道的α-淀粉酶的氨基酸序列相比，相似性小于40％。

所属技术领域的技术人员应该知道，本发明的编码嗜热碱性α-淀粉酶的DNA序列，还包括编码对SEQ ID NO：1所示核苷酸序列所表达的酶分子的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸替换、插入或缺失并仍具有该酶活性的蛋白质的核苷酸序列。

另外，对本发明的嗜热碱性α-淀粉酶基因所表达的酶分子的氨基酸进行一个或多个氨基酸替换、插入或缺失所得到的蛋白质也能达到本发明的目的。因而本发明还包括与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有至少70％的同源性，优选具有至少90％的同源性，但同时具有嗜热碱性α-淀粉酶活性的蛋白质。上面使用的术语“多个”可以是小于100的数目，优选为小于10的数目。

本发明的嗜热碱性α-淀粉酶的热稳定性高、耐碱、适合用于淀粉加工和其他相关工业，如：化工、纺织、食品、医药工业中应用。

附图说明

图1为本发明实施例中的嗜热碱性α-淀粉酶基因重组质粒pETAMY的构建模式图。

图2为本发明的重组嗜热碱性α-淀粉酶的反应温度曲线图。

图3为本发明的重组嗜热碱性α-淀粉酶的反应pH曲线图。

具体实施方式

下面通过具体实施例并参照附图对本发明进行更详细的说明。应该理解的是，以下所述的实施例仅仅是用于说明而不是限制本发明。

实施例一

1.嗜热脱氮芽胞杆菌NG80-2(CGMCC No.1228)总DNA的提取

研究证明，嗜热脱氮芽胞杆菌(Geobacillus thermodenitrificans)NG80-2产生的α-淀粉酶特别适于在高温和碱性条件下水解淀粉多糖分子。因此，在本实施例中，采用从中国天津大港油田官69-8区块油井地层水分离获得的嗜热脱氮芽胞杆菌NG80-2(该菌株已保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No.1228)，取其过夜培养的新鲜培养菌液3ml，离心收集菌体，菌体悬于250微升50mM Tris缓冲液中(pH8.0)，加入10微升0.4M EDTA(pH8.0)，混匀后37℃保温20min，之后加入30微升20mg/ml溶菌酶，混匀后37℃再保温20min，再加入5微升20mg/ml蛋白酶K，温柔混匀后，再加入20微升10％ SDS，50℃保温至溶液澄清，分别用等体积酚∶氯仿∶异戊醇抽提两次，氯仿∶异戊醇抽提一次，最后一次的上清溶液加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，回收DNA，用70％乙醇漂洗，沉淀溶于100微升TE缓冲液(pH8.0，10mMTris，1mMEDTA)，加入10mg/ml RNase 2微升，65℃保温30min，分别用酚∶氯仿∶异戊醇、氯仿∶异戊醇各抽提一次，上清液加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，回收DNA，用70％乙醇洗，真空干燥，沉淀溶于50微升TE缓冲液。DNA溶液的紫外分光光度计测定结果为A260/A280＝1.95，A260＝0.73。

2.嗜热碱性α-淀粉酶基因的克隆和筛选

取前面所述的总DNA溶液0.5微升(约10ng)作为模板，以下列寡核苷酸序列作为引物，并按下述设定的PCR循环参数进行20个循环PCR。

设定的PCR循环参数如下：

95℃，3min；95℃，30s；50℃，45s；72℃，2min；72℃，5min；4℃，2hr。

引物序列如下：

上游引物：5’-ACGAGAATTCATGGGGAACCGGCTTTTTATGC-3’；

下游引物：5’-TGCACTCGAGTTATTCATTTGTCCGTTTTGTTC-3’，

上述PCR产物用EcoRI和XhoI双酶切，经0.8％的琼脂糖凝胶电泳，切胶回收1.5kb酶切产物片断。与经同样限制型内切酶酶解并切胶回收的质粒pET-28a(+)连接，转化感受态大肠杆菌DH5α后，涂于含50μg/ml Kan(卡拉霉素)，0.5％淀粉的LB固体培养基上。37℃培养12小时，再在60℃培养1-5小时，菌落周围有明显的透明圈即为阳性克隆，挑取单克隆提取质粒鉴定，插入有SEQ ID NO：1的DNA序列的pET-28a(+)质粒为重组质粒pETAMY(见图1)。

将鉴定后的重组质粒pETAMY转化感受态大肠杆菌BL21(该菌株可向天津开发区厚普生物技术开发有限公司订购，货号为69387-3)后，涂于含50μg/ml Kan(卡拉霉素)的LB固体培养基上。37℃培养16～18小时，挑取单克隆鉴定，插入有SEQ ID NO：1的DNA序列的pET-28a(+)质粒为重组质粒pETAMY(见图1)，含有该质粒的重组大肠杆菌菌株为大肠杆菌BL21AMY。采用Sanger双脱氧法对此DNA片段进行了测序。测序结果显示，该基因DNA片段全长1536bp，由ATG起始密码开始，到TAA终止密码子结尾。该完整的ORF编码一个由511个氨基酸组成的蛋白质。属于α-淀粉酶(alpha-amylase)家族，最高相似于普通高温放线菌(Thermoactinomyces vulgaris)的α-淀粉酶(40％)。

实施例二重组α-淀粉酶的纯化和特性

将上述重组菌E.Coli BL21AMY单克隆接入20ml含50μg/ml Kan的LB培养基中，37℃，180rpm/min培养12小时，然后将培养物按1％(V/V)接种量接入200ml含50μg/ml Kan的LB培养基(共10个摇瓶)，37℃，220rpm/min培养A600为0.6时，加入IPTG至终浓度为0.2mM，45℃，150rpm/min诱导4小时。离心收集菌体，悬于20mM磷酸钠(pH8.0)缓冲液中，利用超声波破碎细胞，离心上清液为重组α-淀粉酶的粗提液。此上清液经螯合琼脂糖凝胶(Chelating Sepharose)镍亲合柱层析纯化，得到的酶制剂在SDS-PAGE上显示一条带。利用已知的蛋白质化学标准方法测定此重组α-淀粉酶的基本特性。用SDS-PAGE测得的重组酶的分子量为60000道尔顿，与理论上推算的分子量(59894道尔顿)相似；等电点沉淀法测得的重组酶的等电点pI为5.828。

实施例三重组嗜热碱性α-淀粉酶水解淀粉活性测定

20ml旋盖试管中装有4ml下列反应体系：0.1％淀粉溶液1ml，20mMNa₂HPO₄(pH8.0)，上述实施例二中制得的重组嗜热碱性α-淀粉酶的纯化酶制剂1mg。60℃反应10min。加入1ml 0.1M H₂SO₄终止反应。取2ml总反应液加入0.5ml 0.5％ KI-I₂溶液，混匀，用吸光光度法在620nm下测定紫外分光光度值。

(1)最适酶活温度

标准反应条件下，在25-80℃范围内测定上述重组嗜热碱性α-淀粉酶的活性(如图2所示)，表明保持该酶活性的最适温度为60℃。

(2)最适pH值

在标准反应条件下(60℃)，在表1中的20mM不同缓冲液的条件下测定上述重组嗜热碱性α-淀粉酶的活性(如图3所示)，结果表明上述实施例一中构建的重组菌株E.Coli BL21AMY中表达的α-淀粉酶最适pH为10。

表1.嗜热碱性α-淀粉酶的酶活测定中所用的缓冲液。

pH范围	缓冲液1	缓冲液2
			pH2-8	0.1M Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>(pH9.0)	0.1M柠檬酸(pH2.0)
pH9-11	0.1M Na<sub>2</sub>CO<sub>3</sub>(pH11.8)	0.1M NaHCO<sub>3</sub>(pH8.4)

(3)pH稳定性

将纯化蛋白与pH2.0-12.0的缓冲液混合，25℃放置30min，测定酶活力，结果表明酶活在pH7-11.5的范围内比较稳定。

经上述实验证明，上述实施例2中构建的重组菌E.Coli BL21AMY表达高温碱性条件下的α-淀粉酶活性，其产生的重组嗜热碱性α-淀粉酶可水解淀粉产生葡萄糖和麦芽糖，最适温度约为60℃，最适pH值约为10，酶活在pH7-11.5的范围内比较稳定。

虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，可做些许的更动与改进，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。

序列表

<110>南开大学

<120>一种嗜热碱性α-淀粉酶及其编码基因

<130>5P13001-CN-A

<160>2

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>1536

<212>DNA

<213>嗜热脱氮芽胞杆菌(Geobacillus thermodenitrificans)NG80-2

<400>1

atggggaacc ggctttttat gctgttcatc cttccgttcc ttctttttta tgccatgccg     60

gttgcggcgg cggaaaaaga agaacggacg tggcaagacg aagcgattta ttttattatg    120

gtcgatcgtt ttaacaacat ggattcaacg aacgaccaag acgtcaatgt caatgatcca    180

aaagggtatt ttggcggtga cttaaaaggg gtgacagcga agctcgatta tattaaagaa    240

atgggcttca ctgccatttg gctgactccc atttttaaaa acaggccggg cggctatcat    300

ggctattgga tcgaggactt ttacgaagtc gacccgcatt ttggcacgct tgatgacctc    360

aagacgctcg tcaaagaggc gcataagcgc gatatgaaag tgattttgga tttcgtggct    420

aaccatgtcg gctacgacca tccgtggctt catgacccgg cgaaaaaaga ttggttccat    480

ccgaagaaag agattttcga ctggaacagc caagagcagg tggaaaacgg ttgggtgtat    540

ggacttcccg atttggcgca ggaaaatccg gaagtaaaaa actatttaat tgacgcagcc    600

aaatggtgga ttaaagaaac cgacattgac ggttaccgac tcgacatggt acgccatgtg    660

ccgaaatcgt tctggcaaga gtttgcgaaa gaagtgaaag cggtaaaaaa agactttttt    720

ctcctcggcg aagtgtggag tgatgatccg cgctatatcg ctgattacgg aaagtatggc    780

atcgacgggt ttgtcgatta cccgctgtac ggtgcggtga agcagtctct tgccaaacgt    840

gatgcatcgc ttcggccgct ctatgatgta tgggagtata acaagacatt ttacgaccgc    900

ccgtatttgc ttggatcatt tttggacaac catgataacg tccgatttac gaaactcgtc    960

attgatcatc ggaacaatcc gatttcacgc atgaaagtag cgatgacgta tttgttcact   1020

gcgccgggca ttccgattat gtactacgga acagaaattg cgatgactgg aggtcctgat   1080

ccggacaatc gccgcctgat ggacttccgt gccgatccag aaatcatcga ttatttaaag   1140

aaagtgggcc cgctccgcca acagttgcca tcattgcggc gcggcgattt tacgttgttg   1200

tatgaacaag acggcatggc ggtgtttaaa cgccaataca aagacgaaac gacggtcatt    1260

gccattaaca acacgagtga aacgaagcac gttcatctga cgaacgaaca gctgccgaaa    1320

aacaaggaat tgcgtggctt tttgctcgat gacctcgtcc gtggcgatga ggatggctat    1380

gatattgtct tggatcgtga aacagcagaa gtgtacaaat tacggaacaa aacgggagtt    1440

aacgtgccgt ttatcgttgc aatggttgcg gtttacgcac tatttatctt gtttttatac    1500

atggtgaaaa aacgaacaaa acggacaaat gaataa                              1536

<210>2

<211>511

<212>PRT

<213>嗜热脱氮芽胞杆菌(Geobacillus thermodenitrificans)NG80-2

<400>2

Met Gly Asn Arg Leu Phe Met Leu Phe Ile Leu Pro Phe Leu Leu Phe

1               5                   10                  15

Tyr Ala Met Pro Val Ala Ala Ala Glu Lys Glu Glu Arg Thr Trp Gln

            20                  25                  30

Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Ile Met Val Asp Arg Phe Asn Asn Met Asp

        35                  40                  45

Ser Thr Asn Asp Gln Asp Val Asn Val Asn Asp Pro Lys Gly Tyr Phe

    50                  55                  60

Gly Gly Asp Leu Lys Gly Val Thr Ala Lys Leu Asp Tyr Ile Lys Glu

65                  70                  75                  80

Met Gly Phe Thr Ala Ile Trp Leu Thr Pro Ile Phe Lys Asn Arg Pro

                85                  90                  95

Gly Gly Tyr His Gly Tyr Trp Ile Glu Asp Phe Tyr Glu Val Asp Pro

            100                 105                 110

His Phe Gly Thr Leu Asp Asp Leu Lys Thr Leu Val Lys Glu Ala His

        115                 120                 125

Lys Arg Asp Met Lys Val Ile Leu Asp Phe Val Ala Asn His Val Gly

    130                 135                 140

Tyr Asp His Pro Trp Leu His Asp Pro Ala Lys Lys Asp Trp Phe His

145                 150                 155                 160

Pro Lys Lys Glu Ile Phe Asp Trp Asn Ser Gln Glu Gln Val Glu Asn

                165                 170                 175

Gly Trp Val Tyr Gly Leu Pro Asp Leu Ala Gln Glu Asn Pro Glu Val

            180                 185                 190

Lys Asn Tyr Leu Ile Asp Ala Ala Lys Trp Trp Ile Lys Glu Thr Asp

        195                 200                 205

Ile Asp Gly Tyr Arg Leu Asp Met Val Arg His Val Pro Lys Ser Phe

    210                 215                 220

Trp Gln Glu Phe Ala Lys Glu Val Lys Ala Val Lys Lys Asp Phe Phe

225                 230                 235                 240

Leu Leu Gly Glu Val Trp Ser Asp Asp Pro Arg Tyr Ile Ala Asp Tyr

                245                 250                 255

Gly Lys Tyr Gly Ile Asp Gly Phe Val Asp Tyr Pro Leu Tyr Gly Ala

            260                 265                 270

Val Lys Gln Ser Leu Ala Lys Arg Asp Ala Ser Leu Arg Pro Leu Tyr

        275                 280                 285

Asp Val Trp Glu Tyr Asn Lys Thr Phe Tyr Asp Arg Pro Tyr Leu Leu

    290                 295                 300

Gly Ser Phe Leu Asp Asn His Asp Asn Val Arg Phe Thr Lys Leu Val

305                 310                 315                 320

Ile Asp His Arg Asn Asn Pro Ile Ser Arg Met Lys Val Ala Met Thr

                325                 330                 335

Tyr Leu Phe Thr Ala Pro Gly Ile Pro Ile Met Tyr Tyr Gly Thr Glu

            340                 345                 350

Ile Ala Met Thr Gly Gly Pro Asp Pro Asp Asn Arg Arg Leu Met Asp

        355                 360                 365

Phe Arg Ala Asp Pro Glu Ile Ile Asp Tyr Leu Lys Lys Val Gly Pro

    370                 375                 380

Leu Arg Gln Gln Leu Pro Ser Leu Arg Arg Gly Asp Phe Thr Leu Leu

385                 390                 395                 400

Tyr Glu Gln Asp Gly Met Ala Val Phe Lys Arg Gln Tyr Lys Asp Glu

                405                 410                 415

Thr Thr Val Ile Ala Ile Asn Asn Thr Ser Glu Thr Lys His Val His

            420                 425                 430

Leu Thr Asn Glu Gln Leu Pro Lys Asn Lys Glu Leu Arg Gly Phe Leu

        435                 440                 445

Leu Asp Asp Leu Val Arg Gly Asp Glu Asp Gly Tyr Asp Ile Val Leu

    450                 455                 460

Asp Arg Glu Thr Ala Glu Val Tyr Lys Leu Arg Asn Lys Thr Gly Val

465                 470                 475                 480

Asn Val Pro Phe Ile Val Ala Met Val Ala Val Tyr Ala Leu Phe Ile

                485                 490                 495

Leu Phe Leu Tyr Met Val Lys Lys Arg Thr Lys Arg Thr Asn Glu

            500                 505                 510

Claims (9)

1.一种编码嗜热碱性α-淀粉酶的基因，该基因具有选自于下列a)或b)的核苷酸序列：

a)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；

b)由于遗传密码的简并性，不同于SEQ ID NO：1但编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：1所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的编码嗜热碱性α-淀粉酶的基因，其特征是该基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

3.一种嗜热碱性α-淀粉酶，该酶具有选自于下列d)或e)的氨基酸序列：

d)权利要求1所述的核苷酸序列编码的氨基酸序列；

e)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求3所述的嗜热碱性α-淀粉酶，其特征是该酶具有SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列。

5.一种表达嗜热碱性α-淀粉酶的重组质粒，该质粒至少包括权利要求1或2所述的基因。

6.根据权利要求5所述的重组质粒，其特征是该重组质粒的载体为pET-28a(+)。

7.一种产生嗜热碱性α-淀粉酶的重组菌，该重组菌内导入了权利要求1或2所述的基因。

8.根据权利要求7所述的重组菌，其特征是该重组菌为大肠杆菌。

9.根据权利要求8所述的重组菌，其特征是上述大肠杆菌为大肠杆菌BL21菌株。

Images