CN111808784B - 一株产耐高温α-淀粉酶的热反硝化地芽孢杆菌Y62及其应用 - Google Patents

一株产耐高温α-淀粉酶的热反硝化地芽孢杆菌Y62及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一株产耐高温α‑淀粉酶的热反硝化地芽孢杆菌Y62及其应用。所述热反硝化地芽孢杆菌Y62的分类命名为热反硝化地芽孢杆菌Geobacillus thermodenitrificans，保藏编号为CGMCC No.17559，其菌落为不规则形状，具有叶状边缘，米白色，表面平坦，直径4‑5 mm；其菌体为直杆状，两端为圆形，周生鞭毛，该菌株具有能够生产耐高温α‑淀粉酶的特性。所述热反硝化地芽孢杆菌Y62能够在最佳产酶发酵培养基和最适接种量的条件下生产出回收率高于90%的耐高温α‑淀粉酶，为热反硝化地芽孢杆菌Y62和耐高温α‑淀粉酶的工程化生产奠定了基础。

Description

一株产耐高温α-淀粉酶的热反硝化地芽孢杆菌Y62及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株产耐高温α-淀粉酶的热反硝化地芽孢杆菌Y62及其应用。
背景技术
淀粉酶是水解淀粉和糖原的一类酶的总称，在酶制剂中占有很重要的位置，分布非常广泛，在几乎所有的动植物和微生物中都存在。α-淀粉酶是淀粉酶中应用最广泛的酶，淀粉、糖原中的葡萄糖大多数是以α-1，4-苷键的形式连接，它随机地从内部切断淀粉、糖原内的α-1，4-葡萄糖苷键，将淀粉水解为麦芽糖、葡萄糖等低聚糖。水解产物的末端残基碳原子的构型为A构型，所以称为α-淀粉酶。目前α-淀粉酶广泛应用于食品、纺织、洗涤、制药等行业，其中以在食品行业中的应用最为广泛，主要是啤酒酿造和烘焙等。
根据催化温度的不同，α-淀粉酶可以分为低温α-淀粉酶、中温α-淀粉酶和耐高温α-淀粉酶。而耐高温α-淀粉酶以其特有的热稳定性和较宽的pH适应范围等特质，可直接在温度要求严苛的高温环境中发挥作用，有着较高的开发价值及应用价值。与常温α-淀粉酶相比，耐高温α-淀粉酶热稳定性更好，在工业生产的高温条件下更难失活，发挥作用的时间更长；能够使淀粉液化的更加彻底，缩短糊化和过滤的时间，从而节约能源、降低生产成本；保存条件范围广、易于储存和运输等。因此，耐高温α-淀粉酶已经逐渐发展为主流淀粉酶品种，被广泛应用于味精、制糖、啤酒等食品发酵行业以及纺织印染行业等。然而，在工业生产中，很多生产工艺都需要高温过程，所以市场上对于耐高温、热稳定性好的淀粉酶需求量很大。
最早应用于工业化生产的α-淀粉酶来自真菌，曾被用作治疗消化系统疾病的药物辅助剂。而随着研究的不断进行，也发现了一些分离自极端环境的细菌，例如Bacillus属细菌的48个种中有32个种可以分泌α-淀粉酶，但却只有极少数能够产生耐高温α-淀粉酶。因此，就需要技术人员不断地寻找和筛选能够产耐高温α-淀粉酶的菌株，为以后的菌和酶的工程化生产奠定基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一株能够产耐高温α-淀粉酶的热反硝化地芽孢杆菌Y62，及其在用于生产耐高温α-淀粉酶中的应用。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了一株产耐高温α-淀粉酶的热反硝化地芽孢杆菌Y62，其分类命名为热反硝化地芽孢杆菌Geobacillus thermodenitrificans，保藏编号为CGMCC No.17559。
进一步的，所述热反硝化地芽孢杆菌Y62的菌落为不规则形状，具有叶状边缘，米白色，表面平坦，直径4-5mm；其菌体为直杆状，两端为圆形，周生鞭毛。
进一步的，所述热反硝化地芽孢杆菌Y62能够生产耐高温α-淀粉酶。
进一步的，所述热反硝化地芽孢杆菌Y62的适宜生长温度为55-65℃。
进一步的，所述热反硝化地芽孢杆菌Y62的最适生长温度为65℃。
进一步的，所述热反硝化地芽孢杆菌Y62的适宜生长pH为5-9。
进一步的，所述热反硝化地芽孢杆菌Y62的最适生长pH为9。
进一步的，所述热反硝化地芽孢杆菌Y62为革兰氏阴性菌；其培养3-9h进入对数生长期，培养9h以后进入稳定期。
本发明还提供了所述的热反硝化地芽孢杆菌Y62在制备用于生产耐高温α-淀粉酶的制剂中的应用。
进一步的，所述热反硝化地芽孢杆菌Y62生产耐高温α-淀粉酶的步骤为：
(1)将所述热反硝化地芽孢杆菌Y62接种于种子培养基中，65℃摇瓶培养16h，得到热反硝化地芽孢杆菌Y62种子液；
(2)在50L发酵罐中加入20L所述热反硝化地芽孢杆菌Y62的最佳产酶发酵培养基并灭菌40min，按摇瓶最适接种量1％将热反硝化地芽孢杆菌Y62种子液接种于发酵罐中进行发酵，得到发酵菌液；
(3)将所述发酵菌液4℃、8000rpm条件下冷冻离心后，去除沉淀，保留上清液，再向上清液中加入终浓度为50％-60％的硫酸铵充分溶解，冰中静置沉淀后2h后4℃、8000rpm冷冻离心15min，保留上清液，再一次加入终浓度为50％-60％的硫酸铵充分溶解，冰中静置沉淀后2h后，4℃、8000rpm冷冻离心15min后，保留沉淀，所得沉淀即为耐高温α-淀粉酶。
进一步的，所述步骤(2)中最佳产酶发酵培养基组分为30g/L麸皮，5g/L酵母粉，5g/L CaCl2，1g/L K2HPO4，pH 9.0。
进一步的，所述步骤(2)中的发酵条件为：温度设定为65℃，罐压设定为0.5公斤，pH为9，发酵8h以上。
进一步的，经硫酸铵分级沉淀后的所述耐高温α-淀粉酶的酶活为101.6U/mL。
进一步的，经硫酸铵分级沉淀后的所述耐高温α-淀粉酶的回收率为90.2％。
进一步的，所述耐高温α-淀粉酶在80-100℃温度下能够保持良好的酶活。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：
1、本发明通过从14份土壤样品中筛选得到一株热反硝化地芽孢杆菌Y62，该菌能够生产耐高温α-淀粉酶，而该酶能够50-80℃之间酶活都比较稳定，并且在80℃以上都能保持良好的酶活。所述热反硝化地芽孢杆菌Y62为革兰氏阴性菌，培养3-9h即可进入对数生长期，其最适生长温度为65℃，最适生长pH为9。
2、本发明还通过碳源、氮源、无机盐离子的种类和浓度、接种量等方面对热反硝化地芽孢杆菌Y62的产酶性能进行优化，并通过单因素正交实验，得出了热反硝化地芽孢杆菌Y62的最佳产酶发酵培养基和最适接种量。本发明并在此基础上进行了50L中试规模液体深层发酵培养，利用发酵结束后收集的发酵液结合简单的硫酸铵一步法沉淀，即可有效提取发酵液中的耐高温α-淀粉酶，且回收率＞90％，这也为热反硝化地芽孢杆菌Y62和耐高温α-淀粉酶的工程化生产奠定了基础。
附图说明
图1为热反硝化地芽孢杆菌Y62的菌落形态特征。其中，a：LB平板上的菌落形态，b：淀粉平板上的透明圈。
图2为热反硝化地芽孢杆菌Y62的革兰氏染色和透射电镜结果图。其中，a：革兰氏染色结果，b：透射电镜图。
图3为热反硝化地芽孢杆菌Y62的系统发育树。
图4为pH值对热反硝化地芽孢杆菌Y62生长的影响。
图5为培养温度对热反硝化地芽孢杆菌Y62生长的影响
图6为热反硝化地芽孢杆菌Y62的生长曲线。
图7为不同碳源对热反硝化地芽孢杆菌Y62产α-淀粉酶的影响。
图8为不同麸皮浓度对热反硝化地芽孢杆菌Y62产α-淀粉酶的影响。
图9为不同氮源对热反硝化地芽孢杆菌Y62产α-淀粉酶的影响。
图10为不同酵母粉浓度对热反硝化地芽孢杆菌Y62产α-淀粉酶的影响。
图11为不同无机盐离子对热反硝化地芽孢杆菌Y62产α-淀粉酶的影响。
图12为不同CaCl2浓度对热反硝化地芽孢杆菌Y62产α-淀粉酶的影响。
图13为接种量对热反硝化地芽孢杆菌Y62产α-淀粉酶的影响。
图14为热反硝化地芽孢杆菌Y62在发酵罐中的OD600和菌液pH值变化。
图15为50％-60％硫酸铵浓度区间所得蛋白；其中M为marker，1为α-淀粉酶。
图16为α-淀粉酶的热稳定性结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件；未注明的材料、试剂等，均为市售产品。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
而本发明中所需要的培养基的配方如下：
(1)LB培养基：10g/L NaCl，10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母粉；
(2)牛肉膏培养基：5g/L NaCl，10g/L蛋白胨，5g/L牛肉浸粉；
(3)淀粉培养基：10g/L NaCl，10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母浸出物，2g/L可溶性淀粉，20g/L琼脂。
(4)V-P培养基：5g/L蛋白胨，5g/L葡萄糖，0.5g/L K2PO4，pH 7.0-7.2，分装试管，每管约4-5cm，115℃灭菌20min。
(5)脲酶培养基：1g/L蛋白胨，5g/L NaCl，2g/L KH2PO4，1g/L葡萄糖，15g/L琼脂，0.012g/L酚红。
(6)吲哚培养基：5g/L蛋白胨，5g/L葡萄糖，0.5g/L K2PO4，pH 7.0-7.2。
(7)硝酸盐培养基：10g/L蛋白胨，5g/L NaCl，1-2g/L KNO3，pH 7.4。
(8)种子培养基：10g/L蛋白胨，5g/L NaCl，5g/L牛肉浸粉，pH 9.0。
(9)初始发酵培养基：20g/L蛋白胨，5g/L NaCl，5g/L牛肉浸粉，1g/L K2HPO4，pH9.0。
实施例1：热反硝化地芽孢杆菌Y62的筛选和鉴定
一、平板初筛
收集来自青岛的14份土壤，包括常年浇有热油的油土、烧烤摊煤炭灰等。
取1g土样加入50mL LB液体培养基中，在摇床内65℃、180rpm富集培养24h。取1mL培养液加入到9mL无菌水中进行梯度稀释，取10-3、10-5、10-7梯度的稀释液涂布于LB固体培养基上，65℃过夜培养。待长出单菌落后，利用划线法进行分离纯化，纯化得到的菌株在淀粉平板上进行点板，65℃过夜培养，筛选得到12个可以产淀粉酶的菌株，分别测量各个菌株的D/d(透明圈直径/菌落直径)值，选择其中D/d值较大的4个菌株进行复筛。
二、液体复筛
在LB培养基中，65℃、180rpm摇床培养72h，测定液体酶活，选取液体酶活最高的菌株作为出发菌株。本发明中酶活测定按照新编酶制剂实用技术手册中提供的方法进行，具体的测定方法如下：
(1)吸取4mL淀粉溶液于试管中，加入1mL磷酸盐缓冲液振荡试管使溶液混合均匀，在70℃恒温水浴中预热5min。
(2)加入0.2mL菌液振荡试管使溶液混合均匀，立即计时，准确反应5min。
(3)立即用移液枪吸取0.4mL反应液，加入到预先盛有0.1mL盐酸溶液和2mL稀碘液的试管中，振荡试管混匀溶液。
(4)将2mL稀碘液和0.1mL盐酸溶液的混合液作为空白对照，在660nm波长下，用10mm比色皿迅速测定其吸光度(A)。根据吸光度(A)查吸光度与α-淀粉酶浓度对照表，求得测试α-淀粉酶浓度。
(5)耐高温α-淀粉酶的酶活力大小按下式计算：X＝c×n×16.67；
式中：X-为测试酶活力，单位U/mL；c-测试酶液浓度，单位U/mL；n-酶液稀释倍数。
其中，获得一株酶活最高为51U/mL的菌株，并将其命名为Y62，将菌株Y62进行纯化培养并鉴定，保存于斜面培养基，4℃保藏。
三、菌株Y62的形态学、生理生化鉴定
1、菌株Y62的形态学鉴定
菌株Y62分别在LB和淀粉平板上划线后，培养16h后观察其菌落形态和透明圈大小。菌株Y62在LB平板上的菌落呈米白色、直径约4-5mm、菌落平坦、不规则、有叶状边缘的形态(图1a)；在淀粉平板上呈现较为突出的降解效果(图1b)。
然后对菌株Y62进行革兰氏染色和透射电镜检测。革兰氏染色结果显示，菌株Y62为革兰氏阴性菌，呈直杆状(图2a)；透射电镜结果显示，菌株Y62的菌体两端为圆形，周生鞭毛(图2b)。
2、菌株Y62的生理生化鉴定
按照《Bergey’s
Figure BDA0002616511420000061
OF Systematic Bacteriology Second Edition》(第九版)和《常见细菌系统鉴定手册》对菌株Y62进行生理生化鉴定。
(1)淀粉水解试验
取菌种接种于淀粉培养基平板上，65℃培养过夜，在菌落上滴加碘液直至铺满菌落周围，淀粉因与碘液反应使得平板呈蓝色。菌落周围如果出现透明圈，表明淀粉被水解。
(2)乙醇甲基甲醇(V.P)试验
判断细菌能否分解葡萄糖产生丙酮酸。菌株首先接种于V.P试验培养基中，37℃培养3天，吸取2.5mL培养液于一支试管中，向试管中加入0.6mL 5％的a-萘酚纯酒精溶液和0.2mL 40％的NaOH水溶液，轻轻振荡试管2-5min观察溶液是否变色，如果培养液变成红色，则为V.P阳性，如果不变色，再在37℃下静置2h，仍不变色，则为V.P阴性。
(3)尿酶(Urease)试验
判断细菌能否产生尿素酶。挑取大量菌落穿刺接种于尿酶(Urease)试验所用的琼脂斜面，在37℃条件下培养1-4天观察结果，变为粉红色则为阳性。如果不变色可以继续培养，仍不变色则为阴性。
(4)吲哚试验
如果细菌具有色氨酸酶，就能够分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚。将菌株接种于吲哚试验培养基中，在37℃条件下培养2天后，培养液中加入1-2mL乙醚，轻轻振荡后静置几分钟，加入5-10滴吲哚试剂，出现红色为阳性，不变色为阴性。
(5)过氧化氢酶试验
如果细菌具有过氧化氢酶，就能够催化过氧化氢产生氧和水，从而形成分子氧出现气泡。将菌株接种于种子培养基中培养至对数期后，向培养液中滴加3％过氧化氢，立即观察，如果有大量气泡产生则为阳性，没有气泡则为阴性。
(6)硝酸盐还原实验
判断细菌能否将硝酸盐还原成亚硝酸盐。将菌株接种于硝酸盐还原试验培养基中，在37℃条件下培养2天后，培养液和不带菌株的培养基作为试验管和对照管。对照管加入少量锌粉并加热，再加入格里斯试剂A和B各一滴，观察是否出现红色。试验管同样步骤，如果没有变成红色，则表明硝酸盐被还原。
生理生化鉴定如表1所示，菌株Y62可以运用多种化合物作为碳源，比如葡萄糖、蔗糖、麦芽糖等，能够催化过氧化氢产生氧和水，也可以将硝酸盐还原成亚硝酸盐，不能分解葡萄糖产生丙酮酸，不会产生尿素酶，也不含有色氨酸酶。
表1菌株Y62的生理生化实验结果
Figure BDA0002616511420000071
四、菌株Y62的16S rRNA扩增和序列测定
菌株在摇床65℃、180rpm培养过夜，菌液作为模板进行16S rRNA扩增，所用通用引物为：上游引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；下游引物1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’；PCR反应体系为：模板1μL；上下游引物各1μL；2×PCR MasterMix 12.5μL；ddH2O 9.5μL；将上述组分加入到200μL小离心管中(冰上进行)，混匀后短暂离心使各组分混匀，放进PCR扩增仪中进行目的片段的PCR扩增。PCR扩增条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火90s，72℃延伸1min，重复34个循环；72℃延伸10min。PCR扩增产物用1％的琼脂糖凝胶在TAE缓冲液中100V进行电泳40min，最后用紫外凝胶成像仪观察条带。
将所得的PCR产物送往上海生工生物工程有限公司进行测序，获得的菌株16SrRNA核苷酸序列输入到GenBamk数据库中进行BLAST比对。结果显示菌株Y62与地芽孢杆菌属Geobacillus thermodenitrificans菌株的16S rRNA序列同源性最高，利用系统发育树软件MEGA 4.0构建菌株Y62的系统发育树如图3所示。结合菌株Y62的形态学、生理生化特性和16S rRNA的鉴定结果，初步断定菌株Y62为热反硝化地芽孢杆菌Geobacillusthermodenitrificans。
将筛选到的菌株Y62进行菌种保藏，所述热反硝化地芽孢杆菌Y62的保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2019年04月11日；热反硝化地芽孢杆菌Geobacillus thermodenitrificans的保藏编号为CGMCC No.17559。
实施例2：热反硝化地芽孢杆菌Y62的生长特性
(1)最适生长初始pH
将热反硝化地芽孢杆菌Y62接种在不同pH值(4、5、6、7、8、9、10、11)的牛肉膏液体培养基中，恒温振荡培养箱设为65℃、180rpm培养16h后，用紫外分光光度计在波长为600nm下检测菌液的吸光度，牛肉膏液体培养基作为空白对照。
不同初始pH值对热反硝化地芽孢杆菌Y62的生长影响如图4所示，从图中可知，热反硝化地芽孢杆菌Y62在pH为4和10时几乎不生长，pH值为9时，生长状况最为良好，OD600达到最大，为1.764。
(2)最适生长温度
将热反硝化地芽孢杆菌Y62接种在不同温度(50℃、55℃、60℃、65℃、70℃)的pH为9的牛肉膏液体培养基中，恒温振荡培养箱设为180rpm培养16h后，紫外分光光度计在波长为600nm下检测菌液的吸光度，牛肉膏液体培养基作为空白对照。
不同生长温度对菌株生长特性的影响如图5所示，从图中可知，热反硝化地芽孢杆菌Y62在50℃和70℃时几乎不生长，在55-65℃时生长良好，在65℃下生长状况最好，OD600达到最大，为2.99。
(3)菌株生长曲线的测定
从冷冻斜面培养基上取样接种于种子培养基，摇床65℃、180rpm条件下培养16h后，取2mL培养液加入到200mL种子培养基中65℃、180rpm进行培养，每2h取2mL培养液在波长600nm下测OD值，待OD值稳定后停止测定，记录相关数据，并绘制生长曲线图。
通过对热反硝化地芽孢杆菌Y62生长曲线的测定(图6)，结果显示0-3h为细菌的生长延滞期，3-9h为细菌的对数生长期，9h之后，细菌不再继续生长，进入稳定期，OD600达到1.80。
综上，经过热反硝化地芽孢杆菌Y62的生长特性研究，菌株的种子培养基设为10g/L蛋白胨，5g/L NaCl，5g/L牛肉膏；适宜生长的pH为5-9，最适pH为9；适宜生长温度为55-65℃，最适生长温度为65℃；并且培养3-9h的菌株Y62进入对数生长期，9h之后，菌株Y62进入稳定期。
实施例3：热反硝化地芽孢杆菌Y62发酵培养基的优化与α-淀粉酶的提取
由于热反硝化地芽孢杆菌Y62在LB液体培养基中的的原始产酶量较小，不符合用于工业生产淀粉酶的要求，故本发明拟通过优化发酵培养基来提高菌株Y62的产耐高温α-淀粉酶效果。
1、热反硝化地芽孢杆菌Y62产α-淀粉酶活力的不同影响因素
(1)不同碳源对菌株Y62产α-淀粉酶活力的影响
将菌株Y62在种子培养基中培养至对数期时，二次接种在氮源为5g/L牛肉膏，无机盐离子为5g/L NaCl，1g/L K2HPO4，pH值为9的培养基中，设置碳源分别为乳糖、蔗糖、淀粉、玉米粉、麸皮，在恒温振荡培养箱中65℃、180rpm培养16h后，按照实施例1中所述的方法对菌液里的α-淀粉酶酶活进行测定，结果用相对酶活进行表示。
不同种类碳源对菌株产α-淀粉酶活力的影响如图7所示，麸皮作为碳源时，菌株Y62产α-淀粉酶能力最强。
(2)最优碳源的浓度对菌株Y62产α-淀粉酶活力的影响
将菌株Y62在种子培养基中培养至对数期时，二次接种在氮源为5g/L牛肉膏，无机盐离子为5g/L NaCl，1g/L K2HPO4，pH为9的培养基中，设置最优碳源浓度为10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L，在恒温振荡培养箱中65℃、180rpm培养16h后，按照实施例1中所述的方法对菌液里的α-淀粉酶酶活进行测定，结果用相对酶活进行表示。
不同麸皮浓度对菌株产α-淀粉酶活力的影响如图8所示，麸皮浓度为30g/L时，菌株Y62产α-淀粉酶能力最强。
(3)不同氮源对菌株Y62产α-淀粉酶活力的影响
将菌株Y62在种子培养基中培养至对数期时，二次接种在碳源为20g/L蛋白胨，无机盐离子为5g/L NaCl，1g/L K2HPO4，pH值为9的培养基中，设置氮源为NH4Cl、(NH4)2SO4、尿素、牛肉膏、酵母粉，在恒温振荡培养箱中65℃、180rpm培养16h后，按照实施例1中所述的方法对菌液里的α-淀粉酶酶活进行测定，结果用相对酶活进行表示。
不同氮源对菌株产α-淀粉酶活力的影响如图9所示，酵母粉作为氮源时，菌株Y62产α-淀粉酶能力最强。
(4)最优氮源的浓度对菌株Y62产α-淀粉酶活力的影响
将菌株Y62在种子培养基中培养至对数期时，二次接种在碳源为20g/L蛋白胨，无机盐离子为5g/L NaCl，1g/L K2HPO4，pH值为9的培养基中，设置最优氮源浓度为3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L，在恒温振荡培养箱中65℃、180rpm培养16h后，按照实施例1中所述的方法对菌液里的α-淀粉酶酶活进行测定，结果用相对酶活进行表示。
不同酵母粉浓度对菌株产α-淀粉酶活力的影响如图10所示，结果表明，酵母粉浓度为5g/L时，菌株Y62产α-淀粉酶能力最强。
(5)不同无机盐离子对菌株Y62产α-淀粉酶活力的影响
将菌株Y62在种子培养基中培养至对数期时，二次接种在碳源为20g/L蛋白胨，氮源为5g/L牛肉膏，1g/L K2HPO4，pH值为9的培养基中，设置无机盐离子分别为KCl、MgSO4、CaCl2、NaCl、CuCl2，在恒温振荡培养箱中65℃、180rpm培养16h后，按照实施例1中所述的方法对菌液里的α-淀粉酶酶活进行测定，结果用相对酶活进行表示。
不同无机盐离子对菌株产α-淀粉酶活力的影响如图11所示，结果显示CaCl2作无机盐离子时，菌株Y62产α-淀粉酶能力最强。
(6)最优无机盐离子的浓度对菌株Y62产α-淀粉酶活力的影响
将菌株Y62在种子培养基中培养至对数期时，二次接种在碳源为20g/L蛋白胨，氮源为5g/L牛肉膏，1g/L K2HPO4，pH值为9的培养基中，设置最优无机盐离子浓度为3g/L、5g/L、7g/L、9g/L、11g/L，在恒温振荡培养箱中65℃、180rpm培养16h后，按照实施例1中所述的方法对菌液里的α-淀粉酶酶活进行测定，结果用相对酶活进行表示。
不同CaCl2浓度对菌株产α-淀粉酶活力的影响如图12所示，CaCl2浓度为5g/L时，菌株Y62产α-淀粉酶能力最强。
(7)接种量对菌株Y62产α-淀粉酶活力的影响
将菌株Y62在种子培养基中培养至对数期时，二次接种在碳源为20g/L蛋白胨，氮源为5g/L牛肉膏，无机盐离子为5g/L NaCl，1g/L K2HPO4，pH值为9的培养基中，设置接种量分别为1％、2％、3％、4％、5％，在恒温振荡培养箱中65℃、180rpm培养16h后，按照实施例1中所述的方法对菌液里的α-淀粉酶酶活进行测定，结果用相对酶活进行表示。
不同接种量对菌株产α-淀粉酶活力的影响如图13所示，结果显示接种量为1％时，菌株Y62产α-淀粉酶能力最强，接种量增加时α-淀粉酶合成水平反而降低。
(8)发酵培养基优化试验
本试验选择最适碳源的浓度、最适氮源的浓度、最适无机盐离子浓度、接种量进行四因素三水平L9(34)的发酵培养基优化实验，具体因素水平如表2所示。以α-淀粉酶相对酶活大小作为考察对象，利用正交分析试验软件进行分析，正交试验分析结果如表3所示。
由表3可以看出，菌株Y62产酶发酵培养基的最佳组合A2B2C2D1。在麸皮、酵母粉、CaCl2的浓度接种量这四个因素中，麸皮的浓度影响最为显著，酵母粉的浓度影响最小，可能是麸皮提供了一些关键物质，在菌株生长过程中为微生物细胞的骨架合成提供所需的碳架，促进微生物的大量生长和产酶性能增加。因此，最终可得热反硝化地芽孢杆菌Y62的最佳产酶发酵培养基为30g/L麸皮，5g/L酵母粉，5g/L CaCl2，1g/L K2HPO4，pH 9.0，接种量为1％。
表2正交试验因素水平表
Figure BDA0002616511420000111
表3发酵培养基优化正交试验结果
Figure BDA0002616511420000112
Figure BDA0002616511420000121
2、热反硝化地芽孢杆菌Y62中试规模液体深层发酵中α-淀粉酶的提取
(1)热反硝化地芽孢杆菌Y62的液体深层发酵
将热反硝化地芽孢杆菌Y62接种于种子培养基中，65℃摇瓶培养16h。在50L发酵罐中加入20L配好的热反硝化地芽孢杆菌Y62的最佳产酶发酵培养基并灭菌40min，按最适接种量1％将一级种子液接种于发酵罐中。发酵温度设定为65℃，罐压设定为0.5公斤，pH为9。每隔2h监测发酵液pH值和菌液OD值变化。48h后结束发酵，并保留发酵菌液，测定酶活。
48h内发酵菌液pH值和OD值变化如图14所示，随着发酵时间的增加，菌液的pH值不断下降。菌株Y62在发酵罐中的延滞期较摇瓶中缩短，对数期坡度也明显增加，发酵8h后，OD值逐渐稳定，没有明显变化。菌株Y62经过50L液体深层发酵48h后，酶活为112.7U/mL，高于最优摇瓶酶活水平。
(2)硫酸铵分级沉淀耐高温α-淀粉酶
将所得发酵菌液在4℃、8000rpm条件下冷冻离心15min，去除沉淀，保留上清液。在4℃条件下，向上清液中分别加入终浓度为30％、40％、50％、60％、70％的硫酸铵，搅拌使硫酸铵充分溶解，冰中静置沉淀2h后，4℃、8000rpm冷冻离心15min，保留上清液，去除沉淀；再向上清液中分别加入终浓度为40％、50％、60％、70％、80％的硫酸铵，搅拌使硫酸铵充分溶解，冰中静置沉淀2h后，4℃、8000rpm冷冻离心15min，保留沉淀，倒掉上清液。所得沉淀用适量的PBS缓冲液溶解，分别取5μL点淀粉平板，置65℃培养过夜后，平板中加入适量碘液静置1-2min，观察透明圈。同时溶解液加入等量的Loading Buffer，沸水浴10min后进行SDS-PAGE检测。
经硫酸铵分级沉淀后可知，在50％-60％硫酸铵浓度区间所得的蛋白具有降解淀粉的作用。同时溶解液加入等量的Loading Buffer，沸水浴10min后进行SDS-PAGE，结果如图15所示，50％-60％硫酸铵浓度区间具有单一的蛋白条带，蛋白条带在60kDa左右，由此确定该蛋白为菌株Y62所产的α-淀粉酶。
(3)α-淀粉酶热稳定性检测
将经过硫酸铵分级沉淀后所得的α-淀粉酶在50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100℃下放置10min，以实施例1的酶活检测方法观察α-淀粉酶的失活率。结果如图16所示：α-淀粉酶在不同的温度下水浴10min后，50-80℃之间酶活都比较稳定，80℃温度下α-淀粉酶仍有80％左右的酶活性，即使温度升至90、95、100℃时，该酶仍能保持58.4％、49.2％、37.8％的酶活性，说明热反硝化地芽孢杆菌Y62所产的α-淀粉酶有相当的耐高温的特质，即为耐高温α-淀粉酶。
(4)耐高温α-淀粉酶的回收率检测
先对发酵液中的酶活进行酶活检测，再对硫酸铵沉淀得到的α-淀粉酶酶活进行测定，求比值计算α-淀粉酶的回收率。
热反硝化地芽孢杆菌Y62经过中式规模50L液体深层发酵48h后，酶活为112.7U/mL。经过硫酸铵提取过后的α-淀粉酶酶活为101.6U/mL，α-淀粉酶的回收率达90.2％，说明采用简单的硫酸铵沉淀法即可获得不错的对该耐高温α-淀粉酶的分离提取，因此，上述结果也显示了热反硝化地芽孢杆菌Y62可以用于制备耐高温α-淀粉酶的潜力，也为将来该酶的工程化生产奠定了一定的基础。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (6)

1.一株产耐高温α-淀粉酶的热反硝化地芽孢杆菌（Geobacillusthermodenitrificans）Y62，其特征在于，保藏编号为CGMCC No.17559；所述热反硝化地芽孢杆菌Y62的菌落为不规则形状，具有叶状边缘，米白色，表面平坦，直径4-5mm；其菌体为直杆状，两端为圆形，周生鞭毛；所述热反硝化地芽孢杆菌Y62能够生产耐高温α-淀粉酶；所述热反硝化地芽孢杆菌Y62的适宜生长温度为55-65℃；所述热反硝化地芽孢杆菌Y62的最适生长pH为9。
2.权利要求1所述的热反硝化地芽孢杆菌Y62在制备用于生产耐高温α-淀粉酶的制剂中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述热反硝化地芽孢杆菌Y62生产耐高温α-淀粉酶的步骤为：
（1）将所述热反硝化地芽孢杆菌Y62接种于种子培养基中，摇瓶培养得到热反硝化地芽孢杆菌Y62种子液；
（2）在发酵罐中加入所述热反硝化地芽孢杆菌Y62的最佳产酶发酵培养基并灭菌，接种上热反硝化地芽孢杆菌Y62种子液并进行发酵，得到发酵菌液；
（3）将所述发酵菌液4℃冷冻离心后，去除沉淀，保留上清液，再向上清液中加入50%-60%的硫酸铵充分溶解，冰中静置沉淀后离心，重复上述操作两次，最后一次离心后保留沉淀，所得沉淀即为耐高温α-淀粉酶。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤（2）中最佳产酶发酵培养基组分为30g/L麸皮，5g/L酵母粉，5g/L CaCl2，1g/L K2HPO4，pH 9.0。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤（2）中热反硝化地芽孢杆菌Y62种子液的最适接种量为1%。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤（2）中的发酵条件为：温度设定为65℃，罐压设定为0.5公斤，pH为9，发酵8 h以上。
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