KR101963504B1 - 신규한 호열·내염기성의 통성혐기성균주들과 이를 함유한 가축의 사체 분해용 미생물제제 - Google Patents
신규한 호열·내염기성의 통성혐기성균주들과 이를 함유한 가축의 사체 분해용 미생물제제 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 신규한 호열·내염기성의 통성혐기성균주들과 이를 이용한 미생물 제제 및 상기 미생물제제를 이용하여 가축의 사체를 처리하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는, 고온(40 ~ 70℃)과 pH 8 - 10의 알칼리성 환경조건에서 생장이 가능하고 그 조건하에서 가축 사체의 지방과 단백질의 분해를 촉진하는 능력을 가진 호열·내염기성의 통성혐기성 균주 지오바실러스 서모디니트리피컨스 (Geobacillus thermodenitrificans) OP4 (수탁번호: KCCM11668P), 아네우리니바실러스 서모아에로필러스 (Aneurinibacillus thermoaerophilus) OP11 (수탁번호: KCCM11669P), 및 바실러스 (Bacillus sp .) AL2 (수탁번호: KCCM11667P) 균주에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 고온과 알칼리성 환경조건에서 생장이 가능하고, 가축의 지방과 단백질에 대해 우수한 분해능을 가진 신규한 호열·내염기성의 통성혐기성균주를 이용함으로써 가축의 사체 분해용 미생물제제를 제공할 수 있다.
Description
본 발명은 전염병으로 감염된 가축 사체의 처리과정에서 발생되는 온실가스를 호열성과 내염기성의 통성 혐기성균이나 미생물 제제를 사용하여 근원적으로 저감하면서 고온에서 고속으로 퇴비화하여 처리하는 방법에 관한 것이다.
호열성과 내염기성의 통성 혐기성 균 지오바실러스 어모디니트리피컨스 OP4 (Geobacillus thermodenitrificans) KCCM11668P, 아네우리니바실러스 서모아에로필러스 OP11 (Aneurinibacillus thermoaerophilus) KCCM11669P, 및 바실러스 AL2 (Bacillus sp .) KCCM11667P 이 단독 또는 혼합으로 포함하는 미생물 제제를 사축의 분해를 촉진시키기 위하여 사축에 액상 제제를 경구 또는 항문 투입을 통해 내장으로 주입하거나, 감염가축의 도축 직전에 사료 등과 같은 먹이에 미생물 제제를 혼합하여 먹이는 것을 특징으로 한다.
상기 미생물 제제가 적용된 사축을 매몰 웅덩이의 퇴비 층에 매몰한 후 pH 8.5~10 의 염기성 조건과 40-70oC의 고온에서 사축을 고속으로 분해 처리하여 메탄 생성균의 활성을 억제시켜 사축 분해과정에서 발생되는 온실가스인 메탄의 발생량을 최소화시키면서 고속으로 분해하는 방법을 제공한다.
본 발명은 환경기술개발사업/환경산업선진화기술개발사업의 일환으로 출원된 특허이며, 관련 사항은 아래와 같다.
부처명 : 환경부
전담기관 : 한국환경산업기술원
연구과제명 : 고온기능성 미생물과 메탄산화세균을 이용한 감염사축 처리과정의 악취와 온실가스 동시저감기술
연구기관(주관기관) : 숭실대학교 산학협력단
연구기관(위탁기관) : 그린환경종합센터
과제번호 : 2014000110009
일반적인 토양 매몰 처리법의 경우 사체가 분해되는 동안 온도는 5 ~ 30℃ 범위로 유지되어 병원성균들이 사멸되지 않아 매몰지에 생석회층을 형성시켜야 한다. 이로 인해 매몰 처리한 감염 가축을 분해하는 미생물은 중온성균들로 분해속도가 느리고 생석회 투입에 의해 토양 서식 분해미생물들의 활성이 억제되어 사체가 완전 분해하는 데 4 - 5년의 긴 시간이 소요된다. 이로 인해 매몰지 주변으로 침출수 유출로 인한 토양오염과 지하수오염 등의 2차 환경오염문제를 유발하고 관련 민원들이 발생하는 문제점들이 있다. 또한 분해가 느리기 때문에 매몰지의 토지를 장기간에 걸쳐 이용을 하지 못하게 된다.
고온(40 ~ 70℃)과 pH 8 - 10의 알칼리성 조건에서 가축의 사체(이하 사축)를 분해할 경우 가축 전염성 병균(고병원성 조류인플루엔자, 구제역 바이러스 등)뿐 아니라 일반 병원성균들(대장균, 살모넬라균, 황색포도상구균, 노로바이러스 등)의 멸균이 가능하다. 또한, 고온세균의 경우 생장과 대사속도가 빨라 사축의 빠른 분해가 가능할 것이다.
이에 본 발명자들은 고온(40 ~ 70℃)과 pH 8 - 10의 알칼리성 조건에서 생장이 가능하고 가축의 단백질과 지방을 빠르게 분해할 수 있는 호열·내염기성의 통성혐기성 미생물들을 분리하기 위하여 예의 노력한 결과, 퇴비를 접종원으로 하고 돼지의 지방과 단백질을 각각 유일탄소원으로 공급하여 농화배양을 수행함으로써, 지오바실러스 서모디니트리피컨스 OP4 (Geobacillus thermodenitrificans), 아네우리니바실러스 서모아에로필러스 OP11 (Aneurinibacillus thermoaerophilus), 및 바실러스 AL2 (Bacillus sp .) 균주를 분리하고, 상기 균주들이 가축 사체의 생분해능이 높다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
선행기술에 대한 종래 문헌은, 아래 특허문헌을 예시할 수 있고, 이로써 아래 특허문헌의 내용 전부는, 본 명세서 상의 종래기술로서 모두 인용·합체된다.
본 발명의 주된 목적은 고온(40 ~ 70℃)과 pH 8 - 10의 알칼리성 환경조건에서 생장이 가능하고 그 조건하에서 가축 사체의 지방과 단백질의 분해를 촉진하는 능력을 가진 호열·내염기성의 통성혐기성 균주 지오바실러스 서모디니트리피컨스 (Geobacillus thermodenitrificans) OP4 (수탁번호: KCCM11668P), 아네우리니바실러스 서모아에로필러스 (Aneurinibacillus thermoaerophilus) OP11 (수탁번호: KCCM11669P), 및 바실러스 (Bacillus sp .) AL2 (수탁번호: KCCM11667P)를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 지오바실러스 서모디니트리피컨스 (Geobacillus thermodenitrificans) OP4 (수탁번호: KCCM11668P), 아네우리니바실러스 서모아에로필러스 (Aneurinibacillus thermoaerophilus) OP11 (수탁번호: KCCM11669P), 및 바실러스 (Bacillus sp .) AL2 (수탁번호: KCCM11667P)의 단독 또는 혼합으로 함유하는 가축 사체 분해용 미생물제제를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 지오바실러스 서모디니트리피컨스 (Geobacillus thermodenitrificans) OP4 (수탁번호: KCCM11668P), 아네우리니바실러스 서모아에로필러스 (Aneurinibacillus thermoaerophilus) OP11 (수탁번호: KCCM11669P), 및 바실러스 (Bacillus sp .) AL2 (수탁번호: KCCM11667P) 균주 또는 상기 미생물제제를 이용하여 가축의 사체를 처리하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 사축의 분해를 촉진시키기 위하여 사축에 액상 제제를 경구 또는 항문 투입을 통해 내장으로 주입하거나, 사료 등과 같은 먹이에 미생물제제를 혼합하여 살처분 직전에 감염가축에게 먹이는 것을 특징으로 하는 미생물제제를 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 고온(40 ~ 70℃)과 pH 8 - 10의 알칼리성 환경조건에서 생장이 가능하고, 육류의 지방과 단백질의 분해를 촉진하는 호열·내염기성의 통성혐기성 지오바실러스 서모디니트리피컨스 (Geobacillus thermodenitrificans) OP4 (수탁번호: KCCM11668P) 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 고온(40 ~ 70℃)과 pH 8 - 10의 알칼리성 환경조건에서 생장이 가능하고, 육류의 지방과 단백질의 분해를 촉진하는 호열·내염기성의 통성혐기성 아네우리니바실러스 서모아에로필러스 (Aneurinibacillus thermoaerophilus) OP11 (수탁번호: KCCM11669P) 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 고온(40 ~ 70℃)과 pH 8 - 10의 알칼리성 환경조건에서 생장이 가능하고, 육류의 지방과 단백질의 분해를 촉진하는 호열·내염기성의 통성혐기성 바실러스 종 (Bacillus sp .) AL2 (수탁번호: KCCM11667P) 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 지오바실러스 서모디니트리피컨스 (Geobacillus thermodenitrificans) OP4 (수탁번호: KCCM11668P) 균주 또는 그 배양액을 유효성분으로 포함하는 가축 사체 분해용 미생물 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 아네우리니바실러스 서모아에로필러스 (Aneurinibacillus thermoaerophilus) OP11 (수탁번호: KCCM11669P) 균주 또는 그 배양액을 유효성분으로 포함하는 가축 사체 분해용 미생물 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 바실러스 종 (Bacillus sp .) AL2 (수탁번호: KCCM11667P) 균주 또는 그 배양액을 유효성분으로 포함하는 가축 사체 분해용 미생물 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 지오바실러스 서모디니트리피컨스 (Geobacillus thermodenitrificans) OP4 (수탁번호: KCCM11668P) 균주 또는 그 배양액을 유효성분으로 포함하는 가축 사체 분해용 미생물 제제가 아네우리니바실러스 서모아에로필러스 (Aneurinibacillus thermoaerophilus) OP11 (수탁번호: KCCM11669P) 균주를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 지오바실러스 서모디니트리피컨스 (Geobacillus thermodenitrificans) OP4 (수탁번호: KCCM11668P), 아네우리니바실러스 서모아에로필러스 (Aneurinibacillus thermoaerophilus) OP11 (수탁번호: KCCM11669P) 균주 또는 그 배양액을 유효성분으로 포함하는 가축 사체 분해용 미생물 제제가 바실러스 종 (Bacillus sp .) AL2 (수탁번호: KCCM11667P) 균주를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 아네우리니바실러스 서모아에로필러스 (Aneurinibacillus thermoaerophilus) OP11 (수탁번호: KCCM11669P) 균주 또는 그 배양액을 유효성분으로 포함하는 가축 사체 분해용 미생물 제제가 바실러스 종 (Bacillus sp .) AL2 (수탁번호: KCCM11667P) 균주를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 미생물 제제를 이용하여 가축의 사체를 분해시키는 것을 특징으로 하는 사축의 처리방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 사축의 분해를 촉진시키기 위하여 사축에 액상 제제를 경구 또는 항문 투입을 통해 내장으로 주입하거나, 사료 등과 같은 먹이에 미생물 제제를 혼합하여 도축 직전의 감염가축에게 먹이는 것을 특징으로 하는 미생물 제제를 제공한다.
상술한 바와 같이 본 발명에 의하면 고온과 알칼리성 환경조건에서 생장이 가능하고, 가축의 지방과 단백질에 대해 우수한 분해능을 가진 신규한 호열 ? 내염기성 통성혐기성균주를 이용함으로써 가축의 사체 분해용 미생물제제를 제공할 수 있다.
도 1은 매몰부숙재인 퇴비를 분리원으로 호기 및 혐기성 지방 및 단백질 분해균주를 농화배양한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 PCR 시료의 전기영동 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 분리균주의 pH 변화에 따른 상대 생장율, 분리균주의 온도 변화에 따른 상대 생장율을 나타낸 도면이다.
도 4는 분리균주를 이용한 돼지 살코기와 지방의 분해를 나타낸 도면이다.
도 2는 PCR 시료의 전기영동 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 분리균주의 pH 변화에 따른 상대 생장율, 분리균주의 온도 변화에 따른 상대 생장율을 나타낸 도면이다.
도 4는 분리균주를 이용한 돼지 살코기와 지방의 분해를 나타낸 도면이다.
이하, 본 발명을 더 상세하게 설명한다.
본 발명은 고온과 알칼리성 환경조건에서 생장이 가능하고, 육류의 지방과 단백질의 분해를 촉진하는 호열·내염기성의 통성혐기성 지오바실러스 서모디니트리피컨스 (Geobacillus thermodenitrificans) OP4 (수탁번호: KCCM11668P) 균주, 아네우리니바실러스 서모아에로필러스 (Aneurinibacillus thermoaerophilus) OP11 (수탁번호: KCCM11669P) 균주, 바실러스 종 (Bacillus sp .) AL2 (수탁번호: KCCM11667P) 균주를 제공한다.
본 발명의 균주는 40 ~ 70℃, pH 8 - 10에서 생장이 가능하고, 육류의 지방과 단백질의 분해를 촉진한다.
사축의 주성분은 단백질과 지방으로 구성되어 있으며 이들 물질들이 부패단계에서 많은 악취성 가스를 분해산물로 발생시킨다. 따라서 본 연구에서는 단백질과 지방의 분해과정에서 악취성 분해산물의 발생을 최소화할 수 있는 미생물 자원을 확보하여 감염가축의 처리에 활용하고자 한다. 또한 사축의 분해를 빠르게 하고 온실가스의 발생을 저감할 수 있는 고온기능성 미생물을 확보하기 위하여 하기 실시예와 같은 배양과정을 통해 농화 배양균을 얻는다.
이하, 본 발명에 대하여 실시예를 들어 보다 더 상세히 설명한다.
이하의 실시예는 발명의 상세한 설명을 위한 것일 뿐, 이에 의해 권리범위를 제한하려는 의도가 아님을 분명히 한다.
재료 및 방법
1) 균주
분리원
및 배지
고온기능성 균주를 분리하기 위한 분리원으로 매몰부숙재인 퇴비를 사용하였다. 퇴비는 가축분퇴비로 농장에서 직접 만들어진 것을 사용하였다. 돼지고기의 지방과 살코기를 각각 지방과 단백질원으로 사용하였다. 지방과 살코기 150 g씩을 퇴비에 매몰하고 55℃ incubator에서 5일 동안 보관하여 단백질과 지방을 분해하는 균주가 활성이 될 수 있도록 하였다. 호기와 혐기 조건으로 각각 실험하였으며, 5일이 경과한 후 매몰지 주변의 퇴비를 100 g씩 채취하여 농화배양 시료로 사용하였다. 분리된 시료 100 g을 무기염 배지 0.8 L에 넣어 현탁시킨 후 고형물을 침전시켜 제거하고 상등액을 접종원으로 사용하였다. 본 연구에서 사용된 무기염 배지의 조성은 Na2B4O7 ? 10H2O 4.765 g/L, NaOH 1.352 g/L, Na2HPO4 ? 12H2O 3 g/L, KH2PO4 1 g/L이며, 이때의 무기염 배지 pH는 9.5이었다.
2)
농화배양과
순수균
분리
단백질과 지방 분해균주의 농화배양은 다음과 같은 방법을 사용하였다. 호기성 단백질 분해균주는 무기염배지가 첨가된 현탁액(200 mL)과 단백질원으로 돼지살코기 50 g을 500 mL flask에 첨가한 후 55℃ 150 rpm 조건하에서 shaking incubator에서 10일 동안 배양하였고, 혐기성 단백질 분해균주는 무기염배지가 첨가된 현탁액(200 mL)과 단백질원으로 돼지살코기 50 g을 1 L 용량의 혈청병에 첨가한 후 55℃ incubator에서 10일 동안 배양하였다. 마찬가지로 호기성 지방 분해균주와 혐기성 지방 분해균주는 돼지지방 50 g씩을 이용하여 위와 같은 조건하에서 10일 동안 배양하였다. 10일 동안 농화 배양한 균주들을 새 배지에 5%(v/v) 접종하여 3 ~ 4차례 교대 배양하여 최종 농화배양균을 수득하였다. 농화배양하는 동안 배지의 pH를 측정하여 9 이상이 유지되도록 하였으며, pH 조절을 위해 2N-NaOH를 사용하였다. 농화배양균을 멸균수로 희석하여 nutrient agar 배지에 도말하여 incubator에서 배양하여 순수균(single colony)을 분리하였다.
3)
분리균주의
단백질과 지방 분해능 평가
농화배양균 및 분리균주의 단백질 분해능은 3%의 gelatin을 함유한 gelatin agar 배지를 사용하여 clear zone을 측정하였다. Gelatin agar 배지의 조성은 nutrient agar 23 g/L, porcine gelatin 30 g/L, bovine gelatin 30 g/L이다. 농화 배양균 및 분리균주를 gelatin agar 배지에 도말한 후 55℃에서 1 - 2일 동안 배양하며 평가하였다.
농화배양균 및 분리균주의 지방 분해능은 Wesson oil (3% v/v)을 포함한 spirit blue agar 배지를 사용하여 halo 형성을 분석하였다. Spirit blue agar 배지는 blue agar 35 g/L, Wesson oil 30 mL/L로 구성되어 있다. Blue agar와 Wesson oil은 분리해서 121℃에서 15분 동안 멸균한 다음 blue agar가 식은 후 굳기 전에 Wesson oil을 혼합하여 Petri dish에 부어서 준비하였다. 준비된 spirit blue agar 배지에 균주를 도말한 후 55℃에서 1 - 2일 동안 배양하며 halo 형성을 관찰하였다.
단백질 분해균주의 지방 분해능을 평가하기 위하여 단백질 분해능이 확인된 분리균주들을 spirit blue agar에 배양하여 지방분해능을 평가하였고, 반대로 지방분해균주의 단백질 분해능을 평가하기 위하여 gelatin agar에 배양하여 단백질 분해능을 평가하였다. 또한, 호기성 균주들의 통성혐기성 여부를 확인하기 위하여 호기성 균주들을 혐기적 배양조건에서 각각 단백질과 지방분해능을 평가하였다.
실시예
1:
분해균주의
농화배양과
활성
매몰부숙재인 퇴비를 분리원으로 호기 및 혐기성 지방 및 단백질 분해균주를 농화배양하였다(도 3). 55℃의 고온 및 pH가 9이상으로 조절된 배지의 조건하에서 호기 및 혐기성 지방 및 단백질의 분해는 모두 빠르게 진행이 되었으며, 4일이 경과한 후에는 형태를 알아볼 수 없을 정도로 분해가 되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 이렇게 농화 배양된 균주들은 새 배지에 5%(v/v) 접종하여 3 - 4차례 교대 배양하여 최종 농화배양균을 얻었다.
계대배양을 거친 농화배양균의 단백질 및 지방 분해능을 각각 nutrient gelatin 배지와 spirit blue agar 배지를 사용하여 평가하였다(표 1). 표 1과 같이 농화배양균의 단백질과 지방 분해능이 양호함을 확인하였다. 단백질 분해균주의 농화배양액은 clear zone을 형성하였고, 지방분해균주들은 blue agar의 색상이 옅어지는 halo가 뚜렷하게 형성되었다.
| 분류 | 농화배양균 10배 희석액 | 농화배양균 100배 희석액 |
| 호기성 지방분해 |
 |
 |
| 호기성 단백질 분해 |
 |
 |
| 혐기성 지방분해 |
 |
 |
| 혐기성 단백질 분해 |
 |
 |
실시예
2:
분리균주의
단백질과 지방 분해능 평가
농화배양을 통해 얻은 분해균주들을 nutrient agar 배지를 이용하여 순수균으로 분리하였고, 분리균주들의 단백질과 지방 분해능을 평가하였다. 호기성 단백질 분해균주로 9종(OP1, OP2, OP3, OP4, OP5, OP6, OP7, OP11, OP12), 혐기성 단백질 분해균주 5종(APJ1, APJ2, APJ3, APJ4, APJ5), 호기성 지방 분해균주는 4종(OL1, OL2, OL11, OL12), 혐기성 지방 분해균주 10종(ALS21, ALS22, ALJ1, ALJ2, ALS1, ALS3, ALS12, AL1, AL2, AL3)를 순수분리 하였다.
분리 균주들의 단백질 분해능은 Gelatin agar 배지(Beef extract 3 g/L, 펩톤 5 g/L, 젤라틴 120 g/L)를 사용하여 평가하였고, 지방 분해능은 Sprit blue agar 배지(casein enzymic hydrolysate 10 g/L, yeast extract 5 g/L, spirit blue 0.15 g/L. agar 17 g/L)를 사용하여 평가하였다. 분리 균주들의 단백질 분해능과 지방 분해능을 표 2에 정리하였다. 호기성 분해균주 중 단백질의 분해가 우수한 균주는 총 7균주(OP11, OP12, OP3, OP4, OP5, OP6, OP7) 였고, 이들 중 OP11, OP12, OP3, OP4균주는 지방과 단백질 모두 분해능이 우수한 균주이었다. 또한, 지방분해능이 있는 OL 균주들 중 2개 균주(OL11, OL12)의 지방 분해능이 우수하였으나, 단백질 분해능은 약한 것으로 확인되었다.
혐기성 분해균주 중 단백질의 분해가 우수한 균주는 총 2개 균주(APJ4, APJ5)였으며 이중 APJ4 균주는 지방분해능도 우수하였다. 또한, 지방분해 농화배양균으로부터 분리한 AL 균주들 중에서는 단백질과 지방을 동시 분해하는 능력을 가진 균주는 AL2로 확인되었다.
| 균주명 | 지방분해능 | 단백질 분해능 | 균주명 | 지방분해능 | 단백질 분해능 |
| APJ1 | + | - | OL1 | - | ++ |
| APJ2 | + | - | OL2 | - | + |
| APJ3 | + | - | OL11 | ++ | + |
| APJ4 | +++ | +++ | OL12 | +++ | - |
| APJ5 | - | +++ | OP1 | ++ | + |
| ALS21 | ++ | ++ | OP2 | + | - |
| ALS22 | ++ | + | OP3 | ++++ | ++ |
| ALJ1 | + | + | OP4 | +++ | ++ |
| ALJ2 | ++ | ++ | OP5 | + | ++ |
| ALS1 | ++ | ++ | OP6 | + | ++ |
| ALS3 | ++ | ++ | OP7 | - | ++ |
| ALS12 | ++ | ++ | OP11 | +++ | ++ |
| AL1 | + | - | OP12 | ++ | +++ |
| AL2 | ++++ | ++ | [clear zone 또는 halo 형성] -: 약함, + 보통, ++ 양호, +++ 우수, +++ 아주 우수 |
||
| AL3 | + | + | |||
대조군(대장균, E. coli)과 단백질/지방 분해 우수 균주들의 clear zone 형성과 halo 형성을 표 3에 정리하였다.
| 분해능 평가 항목 | 균주명 | |||
| 대조군 | OP4 | OP11 | AL2 | |
| Clear zone 형성 (단백질 분해능 평가) |
 |
 |
 |
 |
| Halo 형성 (지방 분해능 평가) |
 |
 |
 |
 |
고온·호염기성 조건에서 단백질 분해균주 14종(호기9종, 혐기5종), 지방분해균주 14종(호기 4종, 혐기 10종)으로 총 28종의 균주를 분리하였으며, 이중 단백질/지방 분해 우수 균주 6종 (APJ4, AL2, OP11, OP12, OP3, OP4), 단백질 분해 우수균주 APJ5, 지방 분해 우수균주 OL12를 확보하였다.
실시예
3:
OP4
,
OP11
,
AL2
,
APJ4
균주의 동정(
Colony
PCR
Result
)
고온(40 ~ 70℃)과 pH 8 - 10의 알칼리성 환경조건에서 생장이 가능하고, 육류의 지방과 단백질의 분해능이 확인된 호열·내염기성의 분리균 OP4, OP11, AL2, APJ4를 동정하기 위해 16S rDNA 분석방법을 이용하였다. 각 균주의 배양액을 serial dilution하여 LB 한천배지에 도말 하였다. 50℃에서 48시간 배양한 후 성장한 균의 colony를 피펫의 tip을 이용하여 0.5 N NaOH 30 ㎕에 현탁 시켰다. 95℃에서 15분간 가열시켜 균체를 용해시켜 교반과 원심분리를 하였다. 이 과정을 3번 반복하였다.
이에 따라 추출된 genomic DNA를 template로 이용하여 아래의 polymerase chain reaction (PCR) 과정을 통해 증폭시켰다. 증폭에 사용된 primer와 DNA 시료의 양은 아래 표 4와 같다.
아래 표 5의 조건에 맞추어 PCR을 진행하였다.
각 순수균의 partial 16S rDNA sequences는 BLAST search를 이용하여 분석하였다. PCR 시료의 전기영동 결과는 도 2와 같다.
16S rDNA 부분 염기서열을 분석한 결과 OP4, OP11, AL2, APJ4는 각각 지오바실러스 서모디니트리피컨스 (Geobacillus thermodenitrificans), 아네우리니바실러스 서모아에로필러스 (Aneurinibacillus thermoaerophilus), 및 바실러스 sp. (Bacillus sp .), 바실러스 sp. (Bacillus sp .)로 동정되었다. 각 균주의 염기서열은 각각 KP010265.1, KJ913706.1, KC493201.1, 및 KF403022.1 이었다.
상기 OP4 균주는 Geobacillus thermodenitrificans OP4로 명명하고, 2015년 2월 11일자로 KCCM에 수탁하였다(수탁번호 KCCM11668P). 또한 상기 OP11 균주를 Aneurinibacillus thermoaerophilus OP11로 명명하고 KCCM에 수탁하였다(수탁번호 KCCM11669P). 상기 AL2 균주를 Bacillus sp . AL2로 명명하고, KCCM에 수탁하였다(수탁번호 KCCM11667P).
| sample name |
Sequence |
동정결과 | ||
| Description | Ident | Accession | ||
| APJ4 | AGTTAGGAATTTTCCACAATGGGCGAAAGCCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGCGAAGAAGGTCTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTAAGGGAAGAACAAGCGCAGCAGTCACTGGCTGCGCCCTGACGGTACCTTACTAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTACCTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTCTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGGAGAGGGAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGCTATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTCCTGGCCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCCGGTACTCATCACCGACT | Bacillus sp. S13 16S ribosomal RNA gene, partial sequence | 99% | KF403022.1 |
| AL2 | AGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCGAAAGCCTGATGGAGCACGCCGCGTGAGCGAAGAAGGTCTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTAAGGGAAGAACAAGCACCGCAGTCACTGGCTGCGCCTTGACGGTACCTTACTAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTCTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGACGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGGAGAGGGAAGCGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTCCTGGCCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCCTGTAGTCATCAC | Bacillus sp . AT30 16S ribosomal RNA gene, partial sequence | 98% | KC493201.1 |
| OP4 | AGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCGACGCCGCGTGAGCGAAGAAGGCCTTCGGGTCGTAAAGCTCTGTTGTGAGGGACGAAGGAGCGCCGTTTGAATAAGGCGGCGCGGTGACGGTACCTCACGAGAAAGCCCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGGGCGAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTCCTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGGACTTGAGTGCAGGAGAGGAGAGCGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCCGGCTCTCTGGCCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCGTGTAGTCATCACCGAC | Geobacillus thermodenitrificans strain ET 159 16S ribosomal RNA gene, partial sequence | 99% | KP010265.1 |
| OP11 | GCAGCAGTTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCCGCGGTGAGTGAGGAAGGTCCTTCGGGATCGTAAAACTCTGTTGTCAGGGAAAGAACCGCCGGGATGACCTCCCGGTCTGACGGTACCTGACGAGAAAAGCCCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGCTTCTTAAGTCAGGTGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGCCATCTGAAACTGGGGAGCTTGAGTGCAGGAGAGGAGAGCGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGCCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCCAGTAGTCATCACCGACTGCC | Aneurinibacillus thermoaerophilus strain Billoris-VO22 16S ribosomal RNA gene, partial sequence | 98% | KJ913706.1 |
실시예
4:
분리균주의
생장 온도와
pH
지오바실러스 서모디니트리피컨스 (Geobacillus thermodenitrificans) OP4 (수탁번호: KCCM11668P), 아네우리니바실러스 서모아에로필러스 (Aneurinibacillus thermoaerophilus) OP11 (수탁번호: KCCM11669P), 바실러스 (Bacillus sp .) AL2 (수탁번호: KCCM11667P) 균주의 생장 가능 온도와 pH를 확인하기 위하여 다음과 같은 조건에서 배양하였다. 사용된 성장배지의 조성은 무기염 배지 1L에 포도당 20 g/L, tryptone 5g/L, yeast extract 1 g/L를 첨가하였다. 무기염배지의 조성은 MgSO4 · 7H2O 0.409 g/L, CaCl2·2H2O 0.0265 g/L, KH2PO4 1 g/L, NH4NO3 1 g/L, Na2HPO4 · 2H2O 6g/L, FeCl3·6H2O 0.0833 g/L였다. 250 mL 삼각플라스크에서 성장배지 100 mL씩 넣고 배지의 pH를 7 ~ 10으로 조정한 후 진탕배양기에서 온도를 40 ~ 70℃로 변화시켜 배양하였다. 생장은 배양액의 흡광도를 660 nm 에서 측정하여 상대생장율을 나타내었다(도 3). 3종류의 균주 모두 pH 7 ~ 10까지 생장이 가능하였으며 최적 생장 pH는 8 ~ 9이었다(도 3(a)). 또한 이들 균주들의 생장 가능한 온도는 40 ~ 70℃ 이었으며 최적 생장 온도는 60℃ 이었다(도 3(b)).
실시예
5:
분리균주
미생물 제제에 의한 가축 사체(단백질과 지방)의 처리
지오바실러스 서모디니트리피컨스 (Geobacillus thermodenitrificans) OP4 (수탁번호: KCCM11668P), 아네우리니바실러스 서모아에로필러스 (Aneurinibacillus thermoaerophilus) OP11 (수탁번호: KCCM11669P), 바실러스 (Bacillus sp .) AL2 (수탁번호: KCCM11667P) 균주 배양액을 0.5 mL 씩 뿌린 돼지 살코기와 지방 200 g을 각각 pH 9.0으로 조절한 퇴비가 들어있는 스티로폼으로 만든 용기에 매몰한 후 분해과정을 관찰하였다(도 4). 분해하는 동안 온도는 50 ~ 65℃ 사이로 유지되었으며, 살코기(단백질)과 지방 모두 약 5일 경과 후에 대부분이 분해되었다. 이들 3종의 균주 혼합 미생물 제제를 첨가함으로써 가축의 사체(단백질과 지방 덩어리)를 효율적이고 빠르게 분해 가능함을 확인하였다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (11)
- 40 ~ 70℃, 및 pH 8 - 10의 환경조건에서 생장이 가능하고, 육류의 지방과 단백질의 분해를 촉진하는 호열성 및 내염기성의 통성혐기성 지오바실러스 서모디니트리피컨스 (Geobacillus thermodenitrificans) OP4 (수탁번호: KCCM11668P) 균주로서,
최대 70℃의 고온과 최대 pH 10의 강알칼리성으로까지 변동되는 환경조건을 포함하는 가축의 사체를 분해시키는 사축의 처리방법에 사용될 수 있는 것을 특징으로 하는 지오바실러스 서모디니트리피컨스 (Geobacillus thermodenitrificans) OP4 (수탁번호: KCCM11668P) 균주. - 40 ~ 70℃, 및 pH 8 - 10의 환경조건에서 생장이 가능하고, 육류의 지방과 단백질의 분해를 촉진하는 호열성 및 내염기성의 통성혐기성 아네우리니바실러스 서모아에로필러스 (Aneurinibacillus thermoaerophilus) OP11 (수탁번호: KCCM11669P) 균주로서
최대 70℃의 고온과 최대 pH 10의 강알칼리성으로까지 변동되는 환경조건을 포함하는 가축의 사체를 분해시키는 사축의 처리방법에 사용될 수 있는 것을 특징으로 하는 아네우리니바실러스 서모아에로필러스 (Aneurinibacillus thermoaerophilus) OP11 (수탁번호: KCCM11669P) 균주. - 40 ~ 70℃, 및 pH 8 - 10의 환경조건에서 생장이 가능하고, 육류의 지방과 단백질의 분해를 촉진하는 호열성 및 내염기성의 통성혐기성 바실러스 종 (Bacillus sp.) AL2 (수탁번호: KCCM11667P) 균주로서,
최대 70℃의 고온과 최대 pH 10의 강알칼리성으로까지 변동되는 환경조건을 포함하는 가축의 사체를 분해시키는 사축의 처리방법에 사용될 수 있는 것을 특징으로 하는 바실러스 종 (Bacillus sp.) AL2 (수탁번호: KCCM11667P) 균주. - 청구항 1의 균주 또는 그 배양액을 유효성분으로 포함하는 가축 사체 분해용 미생물 제제.
- 청구항 2의 균주 또는 그 배양액을 유효성분으로 포함하는 가축 사체 분해용 미생물 제제.
- 청구항 3의 균주 또는 그 배양액을 유효성분으로 포함하는 가축 사체 분해용 미생물 제제.
- 청구항 4에 있어서, 상기 미생물 제제는 아네우리니바실러스 서모아에로필러스 (Aneurinibacillus thermoaerophilus) OP11 (수탁번호: KCCM11669P) 균주를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물 제제.
- 청구항 7에 있어서, 상기 미생물 제제는 호열·내염기성의 통성혐기성 바실러스 종 (Bacillus sp .) AL2 (수탁번호: KCCM11667P) 균주를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물 제제.
- 청구항 5에 있어서, 상기 미생물 제제는 호열·내염기성의 통성혐기성 바실러스 종 (Bacillus sp .) AL2 (수탁번호: KCCM11667P) 균주를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물 제제.
- 청구항 4 내지 9항 중 어느 한 항의 미생물 제제를 이용하여 가축의 사체를 분해시키되,
최대 70℃의 고온과 최대 pH 10의 강알칼리성으로까지 변동되는 환경조건에서 가축의 사체를 분해시키는 것을 특징으로 하는 사축의 처리방법. - 사축의 분해를 촉진시키기 위하여 사축에 액상 제제를 경구 또는 항문 투입을 통해 내장으로 주입하거나, 사료 등과 같은 먹이에 청구항 4 내지 9항 중 어느 한 항의 미생물 제제를 혼합하여 살처분 직전의 감염가축에게 먹이는 것을 특징으로 하는 사축의 처리방법.
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-
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