CN105154355A - 一株热反硝化地芽孢杆菌cf-1及其用途 - Google Patents

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汪卫东
宋永亭
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一株热反硝化地芽孢杆菌CF-1及其用途。本发明菌株是从胜利油田油水井样品中通过65℃、10MPa条件下以原油为碳源的富集培养和原油平板产扩油圈法筛选得到，并通过对烃类乳化、改变岩石润湿性性能考察反复筛选传代获得，其命名为Geobacillus？thermodenitrificans.CF-1，其保藏编号为CGMCC？No.10697。该菌培养基为蔗糖0.3％，蛋白胨0.3％，K2HPO4？0.2％，pH值为7.0-7.5。本发明提供的CF-1菌好氧，生长温度50～80℃，生长pH值范围4～9，NaCl的耐受性0～5％。该菌株以原油为唯一碳源生长，细菌浓度可达3×108个/mL；发酵液乳化系数大于95％。该菌株发酵液现场试验提高采收率大于5.0％；微生物单井吞吐平均增油量大于200吨；微生物防蜡平均延长热洗周期60天以上。因此，本发明提供的CF-1菌可广泛地应用于微生物采油的现场试验中。

Description

一株热反硝化地芽孢杆菌CF-1及其用途
一、技术领域
本发明属于微生物生物技术和环境生物技术领域，具体地说，它涉及一株热反硝化地芽孢杆菌Geobacillusthermodenitrificans.CF-1菌株及其在微生物采油中的应用。
二、背景技术
当前，微生物采油技术在全球范围蓬勃发展，不断取得重大突破，成为石油开发领域的研究热点。其中，高效的微生物采油菌种是各项微生物技术的基础和关键，菌种性能的好坏直接影响到各项技术的应用效果。因此，获取高性能的采油菌种是微生物采油的重要研究内容之一。微生物采油技术要求所用菌种最好能够在油藏条件下利用原油为碳源生存，并产生对驱油有利的代谢产物，例如生物表面活性剂、生物乳化剂、有机酸、醇以及溶剂和气体。
油藏是个高温、高压的极端环境，对采油菌种的要求很高。目前筛选得到的采油菌种性能各异，很难同时具有优良的驱油性能和很好的油藏环境适应性，矿场应用范围因此受到很大限制。
三、发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种热反硝化地芽孢杆菌(Geobacillusthermodenitrificans)CF-1菌株和该菌在微生物采油中的应用。
本发明提供的热反硝化地芽孢杆菌(Geobacillusthermodenitrificans)CF-1菌株，以下简称CF-1，于2015年4月8日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”(北京市朝阳区北辰西路1号中国科学院微生物研究所)，其保藏编号为“CGMCCNo.10697”，分类命名中文名称为“热反硝化地芽孢杆菌”，拉丁文名称为“Geobacillusthermodenitrificans”。
本发明提供的热反硝化地芽孢杆菌CF-1CGMCCNo.10697菌株，是从胜利油田油水井样品中通过65℃、10MPa条件下以原油为碳源的富集培养和原油平板产扩油圈法筛选得到，并通过耐温耐盐性能考察反复筛选传代获得。
热反硝化地芽孢杆菌CF-1CGMCCNo.10697的形态学特性：在好氧固体培养基下培养3～5d出现大小一般为0.5～1.0mm纯白色菌落，细胞形态为长杆状，大小5-10μm×0.2-0.5μm。
热反硝化地芽孢杆菌CF-1CGMCCNo.10697的生理生化特性：好氧，生长温度50～80℃，生长pH值范围4～9，最佳生长pH范围7～7.5，NaCl的耐受性0～5％。
热反硝化地芽孢杆菌CF-1CGMCCNo.10697的营养培养基：蔗糖0.3％，蛋白胨0.3％，K2HPO40.2％，pH值为7.0～7.5。
热反硝化地芽孢杆菌CF-1CGMCCNo.10697发酵条件：接种量1％，接种龄12h，初始pH7.5，温度65℃，搅拌速度150rpm，pH＝7，通气量：1L/min。
热反硝化地芽孢杆菌CF-1CGMCCNo.10697的性能评价参数：以原油为唯一碳源的生长能力、发酵液乳化能力、改变岩石润湿性能力、物理模拟实验提高采收率值。
热反硝化地芽孢杆菌CF-1CGMCCNo.10697的性能评价方法：
(1)以原油为唯一碳源的生长能力评价
将热反硝化地芽孢杆菌CF-1CGMCCNo.10697接种于以原油为唯一碳源的烃类培养基中，65℃、160rpm下振荡培养3d，进行细菌密度测试。
(2)发酵液乳化能力测试
取一试管，加等体积的热反硝化地芽孢杆菌CF-1CGMCCNo.10697发酵液和柴油后利用微型旋涡混合仪高速涡旋震荡2min后混匀，65℃下静置24h，分别测定乳化层和总烷烃层的体积，相比即为乳化系数，用乳化系数表示其乳化能力的大小。
(3)改变岩石润湿性能力评价
取亲油石英矿片分别放入热反硝化地芽孢杆菌CF-1CGMCCNo.10697发酵液中，置摇床65℃培养7天，取出试片，采用SY/T5153-2007“油藏岩石润湿性测定方法”中方法测试接触角θc。
(4)物理模拟实验提高采收率值评价
①岩心准备：包括岩心的洗刷和灭菌，测定空气渗透率；
②抽真空、饱和地层水，测定岩心孔隙度；
③饱和原油，岩心老化7天，计算束缚水饱和度；
④一次水驱，水驱至采出水含水98％以上，计算一次水驱采收率；
⑤注入热反硝化地芽孢杆菌CF-1CGMCCNo.10697发酵液0.2PV～0.3PV；
⑥二次水驱，水驱至含水100％以上，产出液破乳后，计算热反硝化地芽孢杆菌CF-1CGMCCNo.10697发酵液提高采收率值。
热反硝化地芽孢杆菌CF-1CGMCCNo.10697的性能：以原油为唯一碳源生长，细菌浓度可达3×108个/mL；发酵液乳化系数大于95％；发酵液可将石英矿片接触角θc由90～150°降低至25～50°，由亲油转变为亲水；物理模拟实验提高采收率值大于15％。
热反硝化地芽孢杆菌CF-1CGMCCNo.10697的现场应用工艺：一种是微生物驱油，即直接利用发酵液与油田注入水混合注入油藏中进行驱油；一种是微生物单井吞吐，即通过油井向地层注入发酵液，利用热反硝化地芽孢杆菌CF-1CGMCCNo.10697繁殖代谢提高单井产能；另外一种是微生物防蜡，将发酵液注入油井井筒，利用热反硝化地芽孢杆菌CF-1CGMCCNo.10697在井筒中与原油及井筒表面作用，减缓井筒结蜡。
所述的利用发酵液与油田注入水混合注入油藏中进行驱油，是将发酵液与注入水按照体积比为1∶500～1000比例混合后注入油藏，混合液注入总量为油藏孔隙体积的20％～30％，注入速度为500～1000m3/d。
所述的通过油井向地层注入发酵液，利用热反硝化地芽孢杆菌CF-1CGMCCNo.10697繁殖代谢提高单井产能，是根据油井的油层有效厚度、孔隙度和处理半径，计算得出发酵液注入量；用泵车将配制好的发酵液经油井油套环空注入地层；油井关井培养10～20d后开井生产。
所述的将发酵液注入油井井筒，利用热反硝化地芽孢杆菌CF-1CGMCCNo.10697在井筒中与原油及井筒表面作用，减缓井筒结蜡，是用加药泵将200～400Kg热反硝化地芽孢杆菌CF-1CGMCCNo.10697发酵液由油井的套管加入油套环空，加入速度为300～600L/min，每20～30d投加一次发酵液。
本发明的优点和有益效果在于：
本发明提供的热反硝化地芽孢杆菌CF-1CGMCCNo.10697生长温度50～80℃，生长pH值范围4～9，耐盐0～5％，能够以原油为唯一碳源生长，发酵液乳化系数大于95％；发酵液可将石英矿片接触角θc由90～150°降低至25～50°，物理模拟实验提高采收率大于15％，该菌株发酵液应用于现场微生物驱油，提高采收率大于5.0％，应用于现场微生物单井吞吐，平均单井增油量大于200吨，应用于现场微生物防蜡，平均延长油井免热洗周期60天以上。
四、附图说明
附图1为CF-1菌株的形态图；
附图2为CF-1在不同温度下培养的生长曲线；
附图3为CF-1在不同pH培养的细菌浓度；
附图4为CF-1在不同盐度条件下培养的细菌浓度；
附图5为CF-1以原油为碳源的生长曲线；
附图6为CF-1发酵液对柴油的乳化性能测试结果；
附图7为CF-1改变岩石润湿性的测试结果。
五、具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细的说明。
实施例1：
本发明提供的热反硝化地芽孢杆菌CF-1CGMCCNo.10697的形态特征和生理生化特征。
参照《Bergey’sMannualofSystematicBacteriology》的实验方法进行，检测其革兰氏染色，菌体大小和形态，有无鞭毛和芽孢，生长温度，以及触酶、淀粉水解、明胶液化、半乳糖、木糖、乳糖等生化特征。
研究结果表明，如图1所示，该菌株为革兰氏染色阳性、菌体呈长杆状、周生鞭毛、能运动、好氧、有芽孢生成，细胞大小5-10μm×0.5μm。生长温度50～80℃，最适生长温度65℃，生长pH范围4～9，NaCl耐受性0～5％(图2～图4)。接触酶、淀粉水解酶、明胶液化、麦芽糖、D-半乳糖、α-D-葡萄糖、柠檬酸、D-松三糖、蔗糖、D-海藻糖均表现为阳性，D-阿拉伯醇、山梨醇、琥珀酸、L-亮氨酸、龙胆二糖等均表现为阴性。
实施例2：
本发明提供的热反硝化地芽孢杆菌CGMCCNo.10697培养发酵及发酵液性能评价
发酵培养基：蔗糖0.3％，蛋白胨0.3％，K2HPO40.2％，pH值为7.5。
发酵条件：接种量1％，接种龄12h，初始pH7.5，温度65℃，搅拌速度150rpm，pH＝7，通气量：1L/min，培养48小时后评价。
发酵液的性能参数评价方法：
(1)以原油为唯一碳源的生长能力评价
将热反硝化地芽孢杆菌CF-1CGMCCNo.10697接种于以原油为唯一碳源的烃类培养基中，65℃、160rpm下振荡培养，不同时间取样进行细菌密度测试。
(2)发酵液乳化能力测试
取一试管，加等体积的热反硝化地芽孢杆菌CF-1CGMCCNo.10697发酵液和柴油后利用微型旋涡混合仪高速涡旋震荡2min后混匀，65℃下静置24h，分别测定乳化层和总烷烃层的体积，相比即为乳化系数，用乳化系数表示其乳化能力的大小。
(3)改变岩石润湿性能力评价
取亲油石英矿片分别放入热反硝化地芽孢杆菌CF-1CGMCCNo.10697发酵液和蒸馏水中，置摇床65℃培养7天，取出试片，采用SY/T5153-2007“油藏岩石润湿性测定方法”中方法测试接触角θc。
(4)物理模拟实验提高采收率值评价
①岩心准备：包括岩心的洗刷和灭菌，测定空气渗透率；
②抽真空、饱和地层水，测定岩心孔隙度；
③饱和原油，岩心老化7天，计算束缚水饱和度；
④一次水驱，水驱至采出水含水98％以上，计算一次水驱采收率；
⑤注入热反硝化地芽孢杆菌CF-1CGMCCNo.10697发酵液0.2PV～0.3PV；
⑥二次水驱，水驱至含水100％以上，产出液破乳后，计算热反硝化地芽孢杆菌CF-1CGMCCNo.10697发酵液提高采收率值。
实验结果表明(见附图5～图7)，该菌种以原油为唯一碳源生长，细菌浓度可达3×108个/mL，发酵液乳化系数大于95％，发酵液可将石英矿片接触角θc由90～150°降低至25～50°，物理模拟实验提高采收率值见表1。
表1CF-1菌株发酵液物理模拟提高原油采收率性能评价结果
从表1可以看出CF-1发酵液可以在水驱基础上提高采收率15.8％。
实施例3：
本发明提供的热反硝化地芽孢杆菌CF-1CGMCCNo.10697发酵液在胜利油田区块A中的应用
区块概况：地层温度60℃，地层水矿化度2×104mg/L，地质储量28×104t，孔隙体积25×104m3。
实施步骤：将发酵液与注入水按照1∶1000比例混合后注入油藏，混合液注入总量为5×104m3，注入速度为1000m3/d。
试验结果：试验完成后，该区块累计增油1.74×104t，提高采收率6.2％。
实施例4：
本发明提供的热反硝化地芽孢杆菌CF-1CGMCCNo.10697发酵液在胜利油田油井B的应用。
油井概况：地层温度75℃，地层水矿化度1.5×104mg/L，油层有效厚度7.0m，孔隙度0.30，渗透率1375×10-3μm2。
实施步骤：油层有效厚度H＝7.0m，孔隙度φ＝0.30代入计算式V＝3.14R2Hφβ，并取处理半径R＝4m，用量系数β＝1.3，得CF-1发酵液用量V＝137m3。
将热反硝化地芽孢杆菌CF-1CGMCCNo.10697发酵液用泵车经油井B油套环空以12m3/h的注入速度注入地层，关井15天后恢复生产。该井恢复生产后产液和产油上升，6个月累计增油300t。
试验结果：试验完成后，该井产液和产油上升，6个月累计增油300t。
实施例5：
本发明提供的热反硝化地芽孢杆菌CF-1CGMCCNo.10697发酵液在胜利油田油井C的应用。

Claims (8)

1.一株热反硝化地芽孢杆菌CF-1，已于2015年4月8日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，命名为Geobacillusthermodenitrificans.CF-1，其保藏编号为CGMCCNo.10697。
2.根据权利要求1所述的热反硝化地芽孢杆菌CF-1，其特征在于，所述菌株形态学特性为好氧固体培养基下培养3～5天出现大小一般为0.5～1.0mm纯白色菌落，细胞形态为长杆状，大小5-10μm×0.2-0.5μm；生理生化特性为好氧，生长温度50～80℃，生长pH值范围4～9，最佳生长pH范围7～7.5，NaCl的耐受性0～5％；其营养培养基为蔗糖0.3％，蛋白胨0.3％，K2HPO40.2％，pH值为7.0～7.5；其发酵条件为接种量1％，接种龄12h，初始pH7.5，温度65℃，搅拌速度150rpm，pH＝7，通气量：1L/min。
3.根据权利要求2所述的热反硝化地芽孢杆菌CF-1，其特征在于，所述菌株生长温度为65℃。
4.根据权利要求1所述的热反硝化地芽孢杆菌CF-1，其特征在于，所述菌株发酵液性能为以原油为唯一碳源生长，细菌浓度可达3×108个/mL；发酵液乳化系数大于95％；发酵液可将石英矿片接触角θc由90～150°降低至25～50°，由亲油转变为亲水；物理模拟实验提高采收率大于15％。
5.根据权利要求1所述的热反硝化地芽孢杆菌CF-1在微生物采油中的应用，其特征在于，所述的应用工艺包括以下三种：(1)微生物驱油，即直接利用发酵液与油田注入水混合注入油藏中进行驱油；(2)微生物单井吞吐，即通过油井向地层注入发酵液，利用热反硝化地芽孢杆菌CF-1繁殖代谢提高单井产能；(3)微生物防蜡，将发酵液注入油井井筒，利用热反硝化地芽孢杆菌CF-1在井筒中与原油及井筒表面作用，减缓井筒结蜡。
6.根据权利要求5所述热反硝化地芽孢杆菌CF-1在微生物采油中的应用，其特征在于，所述的直接利用发酵液与油田注入水混合注入油藏中进行驱油，是将发酵液与注入水按照体积比为1∶500～1000比例混合后注入油藏，混合液注入总量为油藏孔隙体积的20％～30％，注入速度为500m3/d～1000m3/d。
7.根据权利要求5所述热反硝化地芽孢杆菌CF-1在微生物采油中的应用，其特征在于，所述的通过油井向地层注入发酵液，利用热反硝化地芽孢杆菌CF-1繁殖代谢提高单井产能，是根据油井的油层有效厚度、孔隙度和处理半径，计算得出发酵液注入量；用泵车将配制好的发酵液经油井油套环空注入地层；油井关井培养10～20d后开井生产。
8.根据权利要求5所述热反硝化地芽孢杆菌CF-1在微生物采油中的应用，其特征在于，所述的将发酵液注入油井井筒，利用热反硝化地芽孢杆菌CF-1在井筒中与原油及井筒表面作用，减缓井筒结蜡，是用加药泵将200～400kgCF-1发酵液由油井的套管加入油套环空，加入速度为300～600L/min，每20～30d投加一次发酵液。
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