CN104371940A - 一种铜绿假单胞菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种铜绿假单胞菌及其应用；该铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa QHH S1-27-2，其微生物保藏编号为CCTCC NO:M2012468；其应用于高矿化度油藏微生物采油中；本发明的铜绿假单胞菌能够以原油为唯一碳源进行生长，其代谢产物中的生物表面活性剂成分可降低油水界面张力，一定程度增加储层的有效渗透率，提高注入水的驱油效率，提高原油采收率。

Description

一种铜绿假单胞菌及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中的铜绿假单胞菌及其应用，特别涉及一株产生物表面活性剂的铜绿假单胞菌及其在高矿化度油藏微生物采油中的应用。
背景技术
石油是不可再生的资源，但二次采油后仍有60-70%的剩余油和残余油存留在地层中，这对于提高采收率、增加可采储量都是一个巨大的潜力。据估计油田的采收率提高1％，就可满足全世界2～3年的石油消费量，因此如何提高提高三次采油技术水平，具有重要的经济价值和战略意义。
三次采油主要包括物理采油、化学采油以及微生物采油。物理采油技术主要通过将高温、高压蒸汽灌入油藏，促进原油剥脱、流动从而进行开采，但成本很高、提高采收率不明显；化学采油技术主要应用表面活性剂促进原油剥脱、流动、聚集进行开采，主要不足在于对地层水水型要求苛刻、成本很高。微生物采油技术（microbial enhanced oilrecovery，MEOR）是一项利用微生物及代谢产物来提高原油产量和采收率的综合技术，具有工艺简单、成本低、环境友好等优点，目前已经成为颇具应用前景的三次采油技术。
菌种是微生物采油的关键，成功用于采油的菌株一般都具有产生生物表面活性剂的能力。目前，已有研究发现铜绿假单胞菌能够产生糖脂类生物表面活性剂，起到降低油水界面张力的作用，相对于其他微生物菌种具有较强的优势，因此在石油工业和其他行业中展示出独特的应用前景。但是由普通环境筛选得到的铜绿假单胞菌对油藏储层环境不具适应性，特别是对于油藏地层水矿化度耐受性很差，矿化度超过10g/l很难生长繁殖，无法在高矿化度油藏进行微生物采油工程。
发明内容
本发明的目的是提供一种高产生物表面活性剂的微生物采油菌株——铜绿假单胞菌，及其在高矿化度油藏的应用。本发明由高矿化度油藏油井采出水中筛选得到一株铜绿假单胞菌，高产生物表面活性剂，能够以原油为唯一碳源进行生长，并对目标油田的水质具有良好的适应性，在高矿化度油藏微生物采油方面具有良好的应用前景。
本发明提供的铜绿假单胞菌，是铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）QHH S1-27-2，已于2012年11月21日保藏于“中国典型培养物保藏中心”，其保藏编号为CCTCC NO:M2012468，保藏地址为：湖北省武汉市武汉大学保藏中心。
本发明还公开了所述的铜绿假单胞菌QHH S1-27-2在高矿化度油藏微生物采油中的应用。
本发明铜绿假单胞菌QHH S1-27-2菌株从青海油田油井采出水样中分离，采用富集培养、血平板分离、纯化得到。其中富集培养基配方为：原油10%、酵母膏0.01%、NaCl3%、KH2PO40.5%、NaNO30.07%、NH4NO30.07%、MgSO4·7H2O0.05%、微量元素液0.5mL%、pH7.0-7.2，121℃下高压蒸汽灭菌30min。血平板培养基配方为：蛋白胨1%、牛肉粉0.3%、NaCl0.5%、脱纤维羊血5mL%、琼脂1.8%，pH7.0，121℃下高压蒸汽灭菌15min。
本发明还公开了所述的铜绿假单胞菌QHH S1-27-2，其高产生物表面活性剂的方法，是将所述铜绿假单胞菌株按3%接种量接种于发酵培养基中，37℃，150r/min，振荡培养72h，即得。其中所述的发酵培养基配方为植物油10g/L，MgSO40.2g/L，K2HPO41.0g/L，KH2PO41.0g/L，蛋白胨1.0g/L，FeSO40.05g/L，CaCl20.02g/L，初始pH值7.0。
本发明公开了所述的铜绿假单胞菌QHH S1-27-2在高矿化度油藏微生物采油中的应用方法，是先通过封堵体系对地层高渗带、大孔道进行深部调剖后，做好微生物驱施工前期准备，使后期注入的微生物更均匀地驱替到对应的油井，提高注入水的波及系数和降低油水界面张力，改变油藏岩石孔表面性质、油藏原油性能，从而降低油井含水，提升原油采油率。
本发明一株高产生物表面活性剂且能以原油为唯一碳源生长的菌株铜绿假单胞菌QHH S1-27-2，该菌株能够很好的适应高矿化度的油藏环境，能在该油藏环境中大量繁殖；微生物发酵液中的表面活性剂成分可降低油水界面张力，一定程度增加储层的有效渗透率，提高注入水的驱油效率，提高采收率。室内驱油模拟实验中，经微生物驱替段塞作用后，采收率可提高平均16%，说明筛选的菌株驱油性能较强。利用该菌株制备相应的微生物采油产品，是一项对环境、对经济、对社会生产都友好的优良产业链。
附图说明
图1是QHH S1-27-2菌落形态（a）图和光镜照片（b）图；
图2是QHH S1-27-2系统进化树；
图3是温度对铜绿假单胞菌生长的影响图；
图4是矿化度对铜绿假单胞菌生长的影响图；
具体实施方式
实施例1：
铜绿假单胞菌QHH S1-27-2的获得
采集青海油田采油井油水样，用无菌的聚苯乙烯瓶装样，带回实验室。
（1）富集：取10g油水样加入到富集培养基中，l00mL发酵培养基装入250mL三角瓶中，密封瓶口，50℃，120r/min，恒温振荡培养3d。
（2）血平板分离
富集培养后，观察发酵液形态，从能够使石油分散成油滴的摇瓶培养物中吸取0.lmL做10-5-10-7梯度稀释，然后用灭菌的涂布器，均匀涂布血平板，37℃恒温培养箱培养2d。利用生物表面活性剂能够使红细胞溶解的特性，在血平板上表现为产生溶血圈。因此挑取产生大直径溶血圈的单菌落，转接到斜面培养基上放入冰箱中保存。
（3）菌株的生理生化分析及系统分类鉴定
QHH S1-27-2从青海油田花土沟工区S1-27-2下井油水样中分离，其平板生长菌落呈圆形，直径3～4mm，扁平且表曲光滑，边缘波状，菌落呈黄绿色。细胞直杆状，端圆，大小为0.5～0.9×2～5.0μm，光镜照片见附图1。
表1QHH S1-27-2(铜绿假单胞菌)主要的生理生化特征
注：“+”表示阳性反应；“-”表示阴性反应
16S rRNA序列分析：以细菌基因组为模板，16S rRNA的PCR扩增引物采用细菌通用引物B14926(5′
-CCGGATCCAGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT-3′)和B14927（5′-CGGGATCCTACGCCTACCTTGTTACGACTTCACCC-3′）。反应体系为20μl，条件：94℃10min；94℃45s，55℃60s，72℃70s。30个循环；72℃10min。取2μl反应液进行电泳检测。PCR产物测序由上海美吉生物科技有限公司完成。将菌株的16S rRNA序列输入GenBank核酸序列数据库进行比对，采用MEGA4.1软件进行多重序列比对绘制进化树。见附图2。
QHH S1-27-2序列与铜绿假单胞菌的同源性高达99%，命名为铜绿假单胞菌QHH S1-27-2。2012年11月21日送往“中国典型培养物保藏中心”，保藏编号为CCTCC NO:M2012468，保藏单位地址为：湖北省武汉市武汉大学保藏中心。
实施例2：
铜绿假单胞菌QHH S1-27-2对原油脱油作用测定
将青海油田花土沟工区原油与石英砂按照1:1体积比混合，37℃老化1周。取烘干带油石英砂20g，加入3%的菌株发酵液50ml，空白对照加入花土沟地层水，模拟地层温度35℃恒温培养48h。分别于0.5，1，3，6，12，24，48小时后取出并计量浮于液体表面的原油。检测驱油菌株发酵液的脱油效率。随着菌株发酵液作用时间的延长，加入驱油微生物发酵液的烧杯内液面油层慢慢变厚，底层石英砂逐渐露出本色，脱油效果十分显著，经实验测定3%的驱油微生物发酵液作用油砂混合物48h后的脱油效率为90.3%。
表2微生物溶液脱油效率检测结果
实施例3：
铜绿假单胞菌QHH S1-27-2对环境的适应性测定
（1）菌株繁殖能力测定
按3%接种于培养基后，35℃条件下60r/min转速震荡培养，每4h测定一次OD值。根据菌浓度与OD值之间的线性关系，计算出不同OD值所对应的菌浓度。铜绿假单胞菌QHH S1-27-2在8-12h后进入对数生长期，约24-32h后进入稳定期，OD值对应菌数均大于107CFU/mL。
（2）菌株对温度的适应性测定
设计30、35、40℃3个温度梯度，按照3%接种量接菌种于培养基中，震荡培养28h(稳定期菌数相对恒定)后测定OD值。菌种在30～40℃之间生长速度较快，48h后OD值对应菌数大于107CFU/mL，可以达到油田现场要求的技术指标。图3。
（3）高矿化度对菌种的影响
花土沟工区地层水矿化度为200000mg/l，设计纯净水、50%地层水、100%地层水为溶剂配制培养基，接种铜绿假单胞菌QHH S1-27-2，35℃下振荡培养40h，每4小时测定菌株OD值，用以检测菌株对矿化度的适应性。矿化度在10-200000mg/l范围内，菌株都可以生长繁殖，高矿化度会延缓其生长繁殖速度，相比低矿化度，菌株的对数生长期延缓了10小时，但仍然能在2天内达到对数生长期，生物量达到107-108个/ml。图4
实施例4：
铜绿假单胞菌QHH S1-27-2生物驱油室内模拟实验
为了验证铜绿假单胞菌QHH S1-27-2菌株的驱油效果，采用青海油田花土沟工区原油，在原油饱和的花土沟岩心中注入菌液来模拟地层条件，计算原油采收率，作为矿场试验的实施参考。
(1)实验流体
经高速离心脱水后的花土沟油藏原油，测量35℃花土沟油藏的原油粘度为10.3mPa.s；注入水是花土沟地层水，CaCl2型，总矿化度为20×104mg/L，采用0.22μm的滤膜抽滤；3%菌株发酵液。
(2)注入参数
①注入速度:0.25mL/min
②注入量:1PV
③注入时机:98%含水率
④实验温度:35℃
(3)岩心参数
表3花土沟工区岩心参数
岩心编号 长度cm 直径cm 气相渗透率um2*10-3 孔隙度%
H10 3.2 2.3 123.034 18.44
H13 3.2 2.3 30.896 15.22
H17 3.5 2.3 657.699 22.43
(4)实验步骤
抽真空饱和地层水测量孔隙体积并计算出孔隙度；
将岩心放入恒温箱内，在35℃温度下油驱水建立束缚水，测量原始含油饱和度，岩心在试验温度下老化24h；
用地层水进行驱油至极限含水率(98%)时停止水驱，计算水驱采收率；
按照设计注入驱油菌液段塞；
关闭岩心进出口，在岩心内培养24h；
打开岩心进出口，并用地层水进行后续水驱，岩心流出液中含水率达到98%时停止实验，计算总采收率。
(5)实验结果
挑选三根渗透率范围分别小于50毫达西、小于100毫达西、大于500毫达西的岩心进行了驱油率测定，结果显示(见表4)，花土沟驱油菌株有一定的驱油功效。
表4各岩心提高采收率数据
驱油试验结果表明，经微生物驱替段塞作用后，岩心驱替效率可提高3.0%～25%。水驱实验时，随着注入量的增加，采收率可达到40%；换为微生物驱后，注入压力逐渐增大，后续水驱时，水相渗透率逐渐上升，累计增油4%(657×10-3μm2)、17%(123×10-3μm2)、20%(30×10-3μm2)，岩心渗透率越低，微生物驱替后采收率提高越多，室内微生物驱能提高采收率平均13个百分点，说明注入微生物有洗油功效，从而提高了驱替效率。
实施例5：
青海省柴达木盆地花土沟油田新N7-3-3井现场应用
青海省柴达木盆地花土沟油田新N7-3-3井对应7口油井，日产液48.8m3,日产油14.1t,综合含水70.47%。开始注入时间为2013年4月17日，截至2013年7月1日，累计注入3%微生物原液约41.26t，累计注入液量约2928m3，现场试验正在进行中。
表5新N7-3-3井组对应油井产量动态
目前日增油3.47t，日净增油1.9t。新N7-3-3井组对应的7口油井累计增油109.32吨。

Claims (2)

1.一株铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）QHH S1-27-2，其特征在于，该菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO:M2012468。
2.一种权利要求1所述的铜绿假单胞菌的应用，其特征在于：应用于高矿化度油藏微生物采油中；
（1）将所述铜绿假单胞菌株接种于培养基中，振荡发酵培养，得生物表面活性剂；
所述的培养基为植物油10g/L，MgSO40.2g/L，K2HPO41.0g/L，KH2PO41.0g/L，蛋白胨1.0g/L，FeSO40.05g/L，CaCl20.02g/L，初始pH值7.0；
所述的发酵培养条件为培养温度为37℃，搅拌转速为150rpm，接种量为5%，发酵时间为72h；
（2）现场施工选择复合微生物驱油条件的井组进行，总注入量按照下述公式计算。
V=S×H×P        V=0.003PV
其中：PV—孔隙体积，m3；V—生物性驱油剂用量，m3；
生物性驱油剂段塞使用量（V）按0.003PV计算；S为水驱控制面积；H为油层有效厚度（m）；P为孔隙度。
现场注入一般等分为3-4个段塞，段塞间间隔3-5天，间隔期内正常注水。每个段塞通过注水井将3%微生物菌液注入地层，每日注入量按配注进行。
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