CN105567581A

CN105567581A - 一株高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌db及其应用

Info

Publication number: CN105567581A
Application number: CN201510626827.8A
Authority: CN
Inventors: 林军章; 冯云; 谭晓明; 段传慧; 王静; 徐登霆; 孙刚正; 胡婧; 刘涛; 巴燕; 宋永亭
Original assignee: China Petroleum and Chemical Corp; Sinopec Research Institute of Petroleum Engineering Shengli Co
Current assignee: China Petroleum and Chemical Corp; Sinopec Research Institute of Petroleum Engineering Shengli Co
Priority date: 2015-09-28
Filing date: 2015-09-28
Publication date: 2016-05-11

Abstract

一株高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌DB及其应用。本发明菌株是从胜利油田油水井样品中通过血平板和扩油圈方法筛选得到，并通过耐温耐盐性能考察反复筛选传代获得，其命名为Pseudomonas？aeruginosa.DB，其保藏编号为CGMMCC？No.10618。其种子液培养基为葡萄糖10.0g/L、酵母粉3.0g/L、KH₂PO4？1.0g/L、Na₂HPO₄？1.0g/L、MgSO₄·7H₂O？0.5g/L；其发酵培养基糖蜜70g/L，废油脂120g/L，pH值为7.0～7.5；生长温度30～60℃，最佳生长温度40～45℃，生长pH值范围4～9，最佳生长pH范围7.0～7.5，NaCl的耐受性0～5％。物理模拟实验提高采收率大于13％，现场试验提高采收率大于8％。因此，本发明提供的高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌DB可广泛地应用于提高原油采收率的现场试验中。

Description

一株高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌DB及其应用

技术领域

本发明属于微生物生物技术和环境生物技术领域，具体涉及一株高产鼠李糖脂的假单胞菌Pseudomonasaeruginosa.DB及其应用。

技术背景

在能源日趋紧张的情况下，提高石油采收率已成为石油开采研究的焦点，近年来三次采油技术日益得到广泛重视和现场应用，因此，三次采油驱油剂的研发也越来越引起科研工作者的关注，现在常用的驱油剂主要以化学表面活性剂，如：石油磺酸盐、烷基苯磺酸盐和石油羧酸盐等。目前，石油开采中驱油剂以化学表面活性剂为主，但由于化学表面活性剂耐温耐盐性能与油藏适应性差，产量降低，生产成本较高，环境污染，表/界面活性较差等问题，因此在一定程度上限制了其在现场应用，生物表面活性剂不但具有相容性好，无毒，能被微生物降解，而且具有较低的临界胶团浓度、较高的表界面活性，良好的乳化性能以及耐温耐盐等特性，因此具备高效、环保的特性，并且不以石油为原料，在石油开采、环境治理等领域应用越来越广泛，特别是在石油开采过程中可以直接利用微生物发酵液，省去分离纯化过程，因而可大幅度降低成本。

鼠李糖脂作为生物表面活性剂具有绿色环保和良好的表界面活性和乳化功能，在油田驱油中表现出巨大的应用潜力，但受到菌种性能和发酵工艺制约使鼠李糖脂产率低导致产品成本较高，很难实现其大规模工业化应用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足而提供一株高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)DB及其在微生物采油中的应用。

本发明提供的高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)DB菌株，以下简称DB，于2015年3月12日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”(北京市海淀区中关村北一条13号中国科学院微生物研究所)，其保藏编号为“CGMCCNo.10618”，分类命名中文名称为“铜绿假单胞菌”，拉丁文名称为“Pseudomonasaeruginosa”。

本发明提供的铜绿假单胞菌DBCGMMCCNo.10618菌株，是从胜利油田油水井样品中通过血平板和扩油圈方法筛选得到，并通过耐温耐盐性能考察反复筛选传代获得。

铜绿假单胞菌DBCGMMCCNo.10618的形态学特性：在好氧固体培养基下培养1～2天出现大小一般为1.0～5.0mm乳白色菌落，细胞形态为短杆状，大小1-5μm×0.5～1.0μm。

铜绿假单胞菌DBCGMMCCNo.10618的生理生化特性：好氧，生长温度30～60℃，最佳生长温度30～45℃，生长pH值范围4～9，最佳生长pH范围7.0～7.5，NaCl的耐受性0～5％。

铜绿假单胞菌DBCGMMCCNo.10618的种子液培养基为：葡萄糖10.0g/L、酵母粉3.0g/L、KH₂PO41.0g/L、Na₂HPO₄1.0g/L、MgSO₄·7H₂O0.5g/L。

铜绿假单胞菌DBCGMMCCNo.10618的发酵培养基：糖蜜70g/L，废油脂120g/L，pH值为7.0～7.5。

铜绿假单胞菌DBCGMMCCNo.10618发酵条件：接种量8％，接种龄10h，初始pH7.5，温度40℃，搅拌速度200rpm，pH＝7，体积10m³，通气量：1.5L/min。

铜绿假单胞菌DBCGMMCCNo.10618在常温常压、上述营养培养基和发酵条件下产量为55g/L～80g/L。

铜绿假单胞菌DBCGMMCCNo.10618发酵液的性能评价参数：耐温性、耐盐性、乳化性能、表面张力、物理模拟实验提高采收率值。

铜绿假单胞菌DBCGMMCCNo.10618发酵生产的鼠李糖脂发酵液性能参数评价方法：

(1)耐温性能测定

取已经配制好的不同浓度鼠李糖脂发酵液，在恒温器中加热到150℃维持两个小时后，在室温或60℃下测其表面张力。

(2)耐盐性能测定

分别用不同浓度的NaCl溶液配制鼠李糖脂发酵液，配制后观察是否有浑浊和沉淀产生。

(3)乳化性能测定

以石蜡做模型油相，配制不同浓度的鼠李糖脂发酵液，分别将25mL的鼠李糖脂发酵液与25mL油相加入到50mL的比色管中，然后在震荡器上充分混合3min后，在60℃下静止，记录乳化情况。

(4)表面张力测定

用蒸馏水将液体样品配制成质量分数为1％的溶液，固体样品配制成质量分数为0.3％的溶液，按GB/T5549的规定用挂片法测定。

(5)物理模拟实验提高采收率值测定

①填装模拟岩心；

②抽真空、饱和地层水，测定岩心PV(孔隙体积)；

③饱和原油，岩心老化7天；

④一次水驱，水驱至采出水含水98％以上，计算一次水驱采收率；

⑤注入该菌发酵生产的鼠李糖脂发酵液0.2PV～0.3PV；

⑥二次水驱，水驱至含水100％以上，计算鼠李糖脂发酵液提高采收率值。

铜绿假单胞菌DBCGMMCCNo.10618发酵生产的鼠李糖脂发酵液性能：耐温150℃，耐盐12×10⁴mg/L，乳化指数大于90％，表面张力最低25mN/m，物理模拟实验提高采收率值大于13％。

铜绿假单胞菌DBCGMMCCNo.10618发酵生产鼠李糖脂的发酵液现场应用工艺是直接利用发酵液与油田注入水混合注入油藏中进行驱油，具体方法为：将鼠李糖脂发酵液与油田注入水按照体积比为1∶1000～2000比例混合后注入油藏，混合液注入总量为油藏孔隙体积的25％～30％，注入速度为100m³/d～150m³/d，注入方式为段塞式。

本发明与现有技术相比具有如下优点和积极效果：

(1)本发明的菌种可以利用糖蜜和废油脂廉价底物发酵生产鼠李糖脂，发酵工艺简单、成本低；

(2)本发明提供的铜绿假单胞菌DBCGMMCCNo.10618发酵生产的鼠李糖脂最高耐温150℃，耐盐12×10⁴mg/L，乳化指数大于90％，表面张力最低25mN/m，物理模拟实验提高采收率值大于13％，现场试验提高采收率大于8％。

附图说明

附图1为DB菌株的形态结构电镜图；

附图2为DB分子生物学鉴定系统发育树。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1

本发明提供的铜绿假单胞菌DBCGMMCCNo.10618的形态特征和生理生化特征以及假单胞菌DB菌株分子生物学鉴定。

如图1所示，本发明提供的铜绿假单胞菌DBCGMMCCNo.10618的形态学特性：在好氧固体培养基下培养1～2天出现大小一般为1.0～5.0mm乳白色菌落，细胞形态为短杆状，大小1-5μm×0.5～1.0μm。铜绿假单胞菌DBCGMMCCNo.10618的生理生化特性：好氧，生长温度30～60℃，最佳生长温度30～45℃，生长pH值范围4～9，最佳生长pH范围7.0～7.5，NaCl的耐受性0～5％。如附图2所示，分子生物学鉴定表明该菌株为铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)。

实施例2：

本发明提供的铜绿假单胞菌DBCGMMCCNo.10618培养发酵及发酵液性能评价

种子液培养基：葡萄糖10.0g/L、酵母粉3.0g/L、KH₂PO41.0g/L、Na₂HPO₄1.0g/L、MgSO₄·7H₂O0.5g/L。

发酵培养基：糖蜜70g/L，废油脂120g/L，pH值为7.0～7.5。

发酵条件：接种量8％，接种龄10h，初始pH7.5，温度40℃，搅拌速度200rpm，pH＝7，体积10m³，通气量：1.5L/min。

发酵液中检测到鼠李糖脂产物浓度达到75g/L。

发酵液的性能参数评价：

(1)耐温性能测定

取已经配制好的不同浓度表面活性剂溶液，在恒温器中加热到150℃维持两个小时后，在室温或60℃下测其(表)界面张力。

(2)耐盐性能测定

分别用不同浓度的NaCl溶液配制生物表活剂，配制后观察是否有浑浊和沉淀产生。

(3)乳化性能测定

以石蜡做模型油相，配制不同浓度的生物表面活性剂溶液，分别将25mL的生物表面活性剂溶液与25mL油相加入到50mL的比色管中，然后在震荡器上充分混合3min后，在60℃下静止，记录乳化情况。

(4)表面张力测定

(5)物理模拟实验提高采收率值测定

①填装模拟岩心，气测渗透率985mD；

②抽真空、饱和地层水，测定岩心孔隙体积为240mL；

③饱和原油，岩心老化7天；

④模拟油藏90℃，一次水驱，水驱至采出水含水率98％以上，计算一次水驱采收率；

⑤注入该菌发酵生产的生物表面活性剂产品72mL；

⑥二次水驱，水驱至含水100％以上，计算该菌发酵产物提高采收率值。

实验结果表明，该菌发酵液表面张力达到26mN/m，最高耐温150℃，耐盐15.0×10⁴mg/L，柴油乳化指数95.5％，驱油物理模拟实验提高采收率值15.0％。

实施例3假单胞菌DB发酵液在胜利油田区块A现场驱油应用

本发明提供的本发明提供的发酵液在胜利油田区块A中的应用区块概况：地层温度90℃，地层水矿化度7.1×10⁴mg/L，地质储量3.5×10⁴t，孔隙体积3.5×10⁴m³。

实施步骤：将鼠李糖脂发酵液与油田注入水按照体积比为1∶1000比例混合后注入油藏，混合液注入总量为油藏孔隙体积的25％为0.875×10⁴m³，注入速度为100m³/d，注入方式为段塞式。

试验结果：试验完成后，该区块累计增油4200t，提高采收率12.0％。

实施例4：假单胞菌DB发酵液在胜利油田区块B现场驱油应用

区块概况：地层温度75℃，地层水矿化度9.5×10⁴mg/L，地质储量7.2×10⁴t，孔隙体积3.8×10⁴m³。

实施步骤：将鼠李糖脂发酵液与油田注入水按照体积比为1∶2000比例混合后注入油藏，混合液注入总量为油藏孔隙体积的30％为1.14×10⁴m³，注入速度为150m³/d，注入方式为段塞式。

试验结果：试验完成后，该区块累计增油7500t，提高采收率10.4％。

Claims

1.一株高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌DB，已于2015年3月12日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，命名为Pseudomonasaeruginosa.DB，其保藏编号为CGMMCCNo.10618。

2.根据权利要求1所述的高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌DB，其特征在于，

所述菌株形态学特性为在好氧固体培养基下培养1～2天出现大小一般为1.0～5.0mm乳白色菌落，细胞形态为短杆状，大小1～5μm×0.5～1.0μm；生理生化特性为好氧，生长温度30～60℃，生长pH值范围4～9，NaCl的耐受性0～5％；其种子液培养基为：葡萄糖10.0g/L、酵母粉3.0g/L、KH₂PO41.0g/L、Na₂HPO₄1.0g/L、MgSO₄·7H₂O0.5g/L；其发酵培养基：糖蜜70g/L，废油脂120g/L，pH值为7.0～7.5；其发酵条件：接种量8％，接种龄10h，初始pH7.5，温度40℃，搅拌速度200rpm，pH＝7，体积10m³，通气量：1.5L/min。

3.根据权利要求2所述的高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌DB，其特征在于，所述菌株生长温度范围为40～45℃。

4.根据权利要求2所述的高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌DB，其特征在于，所述菌株生长pH值范围为7～7.5。

5.根据权利要求1或2所述的高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌DB的应用，其特征在于所述的应用工艺是直接利用发酵液与油田注入水混合注入油藏中进行驱油，具体方法为：将鼠李糖脂发酵液与油田注入水按照体积比为1:1000～2000比例混合后注入油藏，混合液注入总量为油藏孔隙体积的25％～30％，注入速度为100m³/d～150m³/d，注入方式为段塞式。