CN106987545A - 一株鼠李糖脂高产菌及其应用 - Google Patents

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徐帆莉
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Abstract

本发明公开了一株鼠李糖脂高产菌及其应用，所述鼠李糖脂高产菌的分类命名为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）KT1115，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏号CCTCC M 2016686。本发明通过ARTP诱变，进行蓝色凝胶平板筛选，通过复筛得到遗传性状稳定且高产鼠李糖脂的优良菌株。该菌株发酵液的性质：液体的表面张力降低至24.8 mN/m2，乳化值达到了80%。经过碳源和氮源单因素等发酵条件的优化，最终选用价格低廉的粗甘油和地沟油为复合碳源，大幅降低生产成本。同时，该菌株生产的鼠李糖脂达到较高产量为50.7 g/L，比出发菌株提高了18.1倍，转化率为0.75 g/g也达到了较高水平。因此该菌株在进一步工业化应用中有较好的前景。

Description

一株鼠李糖脂高产菌及其应用
技术领域
本发明涉及生物发酵技术领域，具体涉及一株通过诱变选育得到的铜绿假单胞菌，以及该铜绿假单胞菌的应用。
背景技术
生物表面活性剂是一种由微生物合成的，结构多样的表面活性剂，包括糖脂、脂肽、脂蛋白、磷脂及中性类脂衍生物等。表面活性剂一般由亲水性基团和疏水性基团构成。鼠李糖脂属于糖脂类的一种阴离子生物表面活性剂，具有良好的洗涤、乳化、增溶、润湿、渗透等性能，且具有良好的生物降解性。在生物能源、石油化工、生物医药、食品及日化等领域有较大应用前景。
鼠李糖脂的亲水基团一般由1-2分子的鼠李糖构成，疏水基团则由1-2分子具有不同碳链长度的饱和或不饱和酸构成。在发酵产物中，一般存在4种主要组成成分，分别是Rha2C10C10，RhaC10C10，Rha2C10，RhaC10。一般鼠李糖脂能使水的表面张力从72 mN/m2降到30mN/m2左右，有良好的表面活性。鼠李糖脂能乳化长链烷烃化合物、芳香族化合物、油脂等，并保持其稳定性。
目前鼠李糖脂产量一般为30-40 g/L 左右，底物转化率相对较低。例如，CN1891831A公开的RL最大产量仅为23g/L，时进刚等报道的铜绿假单胞菌AB93066鼠李糖脂产量为30-40 g/L，产率为0.67g/g 底物。一般主要以植物油为碳源发酵生产鼠李糖脂，原料成本较高。目前较低的产量和过高的生产成本限制了鼠李糖脂在工业上广泛的应用，因此获得一株高产菌株和能利用低成本或废弃的原料，对于鼠李糖脂工业化生产至关重要。
发明内容
本发明的目的之一在于：培育一株新的铜绿假单胞菌菌株，使其能够遗传稳定且高产鼠李糖脂；
本发明的目的之二在于：提供所述铜绿假单胞菌菌株的应用，可同时利用廉价的粗甘油和地沟油协同作用，有利于菌体生长和鼠李糖脂的生产；
本发明的目的之三在于：提供所述铜绿假单胞菌菌株产物鼠李糖脂的分离提取方法。
为了解决本发明的技术问题，本发明采用的技术方案为：
一株鼠李糖脂高产菌，其分类命名为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）KT1115，已于2016年11月28日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址：中国 武汉 武汉大学，保藏号CCTCC M 2016686。
所述菌株的分类学特征：菌体大小0.5-0.8 μm×1.5-3.0 μm，菌落扁平，边缘不整齐。
所述的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）KT1115，采用ARTP生物诱变，并利用蓝色凝胶平板筛选，经摇瓶发酵复筛获得遗传性状稳定且高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌目的菌株。
所述鼠李糖脂高产菌在发酵生产鼠李糖脂中的应用，包括如下步骤：
1）种子培养：将保存于-80℃的铜绿假单胞菌KT1115取5-10 μL接种至LB种子培养基中，37℃，200 rpm，过夜培养；
2）产脂培养基：将种子液按1-8%的接种量接种至发酵培养基中，pH 6.0-8.0，30-37℃，200 rpm，培养6-9天；
3）将步骤2）得到的发酵液进行鼠李糖脂的提取，依次将发酵液离心取上清、酸沉降、有机溶剂萃取后得鼠李糖脂。
所述发酵培养基配方为（%为质量分数）：碳源 1.0%~10%、氮源0.5%~5.0%、磷酸盐0.05%~0.5%、金属离子0.01%~0.05%，所述碳源为葡萄糖、蔗糖、豆油、粗甘油、地沟油等，所述氮源为硝酸钠、酵母粉、酵母浸膏、蛋白胨等，所述磷酸盐为KH2PO4、Na2HPO4·12H2O ，所述金属离子Mg2+、Fe2+或者Ca2+中的至少一种，pH 6.0。
经过优化实验，最终得到最佳的发酵培养基配方为（%为质量分数）：粗甘油 1.0%，地沟油6.0%，酵母浸膏1.0%，NaNO30.8%，KH2PO4 0.1%，Na2HPO4·12H2O 0.1%，MgSO4 0.01%，FeSO4.7H2O 0.02%，CaCl2·2H2O 0.01%，pH 6.8。
步骤3）中从发酵液中提取鼠李糖脂的具体过程如下：
a) 离心取上清：加入等体积的正己烷，离心（4100 rpm，4℃，30 min）取上清；
b) 酸沉降：将上述上清液调节pH2-3，4℃过夜沉降，离心（4100 rpm，4℃，30 min）收集沉淀；
c) 有机溶剂萃取：用原发酵液1:1.25的乙酸乙酯萃取两次，蒸干溶剂得鼠李糖脂粗品，待测。
上述步骤a）中，加入正己烷为了分离未转化的地沟油。
先用2-溴代苯乙酮和三乙胺对鼠李糖脂进行衍生化，再进行HPLC-UV检测，详见Markus Michael Müller。
所述菌株发酵液的性质：排油圈直径为7.9 cm，水的表面张力降低至为24.8 mN/m2，乳化值为80%。
有益效果：
本发明采用ARTP生物诱变，利用蓝色凝胶平板筛选，再经摇瓶发酵复筛获得遗传性状稳定且高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌目的菌株。
利用本发明的菌株和工艺进行发酵，以廉价的粗甘油和地沟油为复合碳源，大幅降低生产成本，粗甘油促进菌体生长，同时地沟油提供长链脂肪酸，有助于鼠李糖脂的生成，以NaNO3和酵母浸膏为复合氮源，按5%的接种量接至发酵培养基中，培养温度为35℃，初始pH为6.8进行发酵，最终得到鼠李糖脂的产量达到较高水平50.7 g/L，相较于未诱变的菌体产量提高了18.1倍，并具有较高的转化率0.75 g/g。该菌株能利用廉价的粗甘油和地沟油，并且鼠李糖脂的产量和转化率均在较高水平，因此该菌株在进一步工业化应用中有较好的前景。同时鼠李糖脂能将水的表面张力降低至24.8 mN/m2，对石蜡的乳化值达到了80%，具有优良的表面活性。
附图说明
图1不同碳源条件下菌株KT1115的生长量和鼠李糖脂的产量；
图2 在不同浓度的地沟油对菌株KT1115的生长量和鼠李糖脂的产量的影响；
图3不同氮源条件下菌株KT1115的生长量和鼠李糖脂的产量；
图4 不同浓度的NaNO3对菌株KT1115生长量和鼠李糖脂产量的影响。
具体实施方式
以下实施例中所采用的粗甘油为甘油含量小于93%的甘油。
地沟油来源：食堂的油炸废油和剩饭、剩菜的浮油—南京工业大学江浦校区东苑食堂。从食堂收集的地沟油，先静置12 h，用定性滤纸过滤；再将滤液静置12 h，用定性滤纸过滤，得滤液为实验用地沟油。
实施例1
本实施例说明将铜绿假单胞菌原始菌株进行ARTP诱变，并进行初筛、复筛，筛选优良铜绿假单胞菌的方法。
铜绿假单胞菌原始菌株CICC 21100来源于CICC，具体方法如下：
以氦气为气体，通气流量为10 L/min，作用距离2 mm，作用功率120 W。将培养好铜绿假单胞菌CICC 21100的种子用0.9% 的生理盐水稀释至OD600=0.6，取10 μL菌液均匀涂布于无菌小铁片上，风干后放入育种机中进行诱变120 s，获得正向突变株。
其中，所使用的培养基配方（%为质量百分比）：
蓝色凝胶平板初筛：葡萄糖 2.0%，KH2PO40.07%，Na2HPO4 0.09%，NaNO3 0.2%，MgSO4·7H2O 0.04%，CaCl2·2H2O 0.01%，CTAB 0.02%，亚甲基蓝 0.0005%，琼脂 1.5%，2 mL/L微量元素溶液。微量元素溶液（%）：FeSO4·7H2O 0.2%，MnSO4·H2O 0.15%。
种子培养基：蛋白胨 1.0%，酵母浸出物 0.5%，氯化钠 1.0%，pH 7.0。
产脂培养基：粗甘油 1%，NaNO3 0.5%，KH2PO4 0.1%，Na2HPO4·12H2O 0.1%，MgSO40.01%，FeSO4·7H2O 0.02%，CaCl2·2H2O 0.01%，pH 6.0。
筛选步骤：
1、蓝色凝胶平板筛选：
将经ARTP生物诱变处理后的样品进行一定的稀释倍数，以未处理的样品作为对照涂布于蓝色凝胶平板上，温度37℃培养3-4天，挑选蓝色晕圈直径与菌落直径之比大的菌落，在蓝色凝胶平板进行转点。
2、试管复筛：
将上述筛出的30个菌落分别接种于5 mL种子培养基中，培养温度37℃，200 rpm震荡培养12 h，进行试管发酵。
3、发酵摇瓶筛选：
将种子液（接种量6%）转接到产脂培养基（50 mL/250 mL）中，培养温度30℃，200 rpm，培养6-9天。
通过测定排油圈、表面张力和乳化值来进一步筛选菌株。
1）排油圈的测定
在培养皿中倒入20mL无菌水，在表层中央滴入20μL液体石蜡，使石蜡在水层表面均匀铺开，然后在油膜中央滴加10μL稀释一定倍数的发酵液上清，测定排油圈直径，选取排油圈直径较大的菌株。 2）表面张力的测定 将发酵液在4℃、12000rpm、离心20min，去除细胞沉淀，留下发酵液上清。采用QBZY-1型表面张力测定仪测定经过适当稀释发酵液上清的表面张力。 测定时，以去离子水和空白发酵液培养基为对照。每次测量前铂金板分别用蒸馏水和丙酮冲洗干净，然后再放到火焰上烧干。 3）乳化性能的测定 取若干带有刻度的试管，试管中加入5 mL液体石蜡和5 mL发酵液上清，旋涡震荡5 min，室温下使其静置24 h，测定乳化性能。乳化性力用乳化指数E24来表示。E24=乳化层高度/液面总高度×100%
出发菌株铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）经 ARTP 生物诱变处理后，通过蓝色凝胶平板筛得30株菌，将其进行摇瓶复筛产鼠李糖脂实验，得到7株表面活性较好的菌株，结果见表1。
表1 菌株21100的诱变选育结果
注：带*为突变株KT1115在实施例3以地沟油为唯一碳源所生产鼠李糖脂的产量
采用蓝色凝胶平板初筛，后经摇瓶复筛，筛得上述7株增幅较大的菌株。其中正突变株KT1115产鼠李糖脂量最高，为5.2 g/L，比出发菌株提高了85.7% 。
实施例2
本实施例说明突变株KT1115的传代稳定性及分类学特征。
将突变株KT1115每隔12 h进行传代发酵培养，并检测每一代发酵液的鼠李糖脂产量，观察是否出现回复突变。其结果见表2所示。
表2 不同代数菌株KT1115的鼠李糖脂产量
从实验结果可知，经过7次连续传代，突变株KT1115产鼠李糖脂的量较稳定，具有较好的传代稳定性，可作为进一步研究和开发的生产菌株。
突变株KT1115的分类学特征：菌体大小0.5-0.8 μm ×1.5-3.0μm，有单端鞭毛。菌落扁平，边缘不整齐。
实施例3
本实施例说明铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）菌株KT1115发酵生产鼠李糖脂以地沟油为唯一碳源。
地沟油的预处理：从食堂收集的地沟油，先静置12 h，用定性滤纸过滤；再将滤液静置12 h，用定性滤纸过滤，得滤液为实验用地沟油。
本实施例所述的培养基配方（%为质量分数）：
种子培养基：蛋白胨 1.0%，酵母浸出物 0.5%，氯化钠 1.0%，pH 7.0。
发酵培养基：地沟油 1.0%，NaNO3 0.5%，KH2PO4 0.1%，Na2HPO4·12H2O 0.1%，MgSO40.01%，FeSO4·7H2O 0.02%，CaCl2·2H2O 0.01%，pH6.0。
将保存于-80℃的铜绿假单胞菌KT1115取5 μL接种至5 mL LB种子培养基中，37℃，200 rpm，过夜培养。将种子液按6%的接种量接种至产脂培养基（50 mL/250 mL）中，30℃，200 rpm，培养6-9天，结果见表1。如表所示，以地沟油为唯一碳源时，突变菌株KT1115产鼠李糖脂最高为10.0 g/L。
实施例4
本实施例说明铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）菌株KT1115发酵生产鼠李糖脂的优化工艺。
本实施例所述的培养基配方（%为质量分数）：
种子培养基：蛋白胨 1.0%，酵母浸出物 0.5%，氯化钠 1.0%，pH 7.0。
发酵培养基：葡萄糖、蔗糖、豆油、粗甘油、地沟油中取其一 1.0%，NaNO3 0.5%，KH2PO4 0.1%，Na2HPO4·12H2O 0.1%，MgSO4 0.01%，FeSO4·7H2O 0.02%，CaCl2·2H2O 0.01%，pH6.0。
将保存于-80℃的铜绿假单胞菌KT1115取5 μL接种至5 mL LB种子培养基中，37℃，200 rpm，过夜培养。将种子液按6%的接种量接种至发酵培养基（50 mL/250 mL）中，30℃，200 rpm，培养6-9天，发酵结果见图1。发酵8天以后，以地沟油为碳源的发酵培养基，产鼠李糖脂的量最大为10.0 g/L，以粗甘油为碳源的发酵培养基，菌体生长最好，因此决定以地沟油和粗甘油两者为复合碳源。
确定再次优化发酵培养基（%为质量分数）：粗甘油 1.0%，NaNO3 0.5%，KH2PO40.1%，Na2HPO4·12H2O 0.1%，MgSO4 0.01%，FeSO4·7H2O 0.02%，CaCl2·2H2O 0.01%，pH 6.0。添加不同浓度的地沟油，分别为 2.0%、4.0%、6.0%、8.0%、10.0%。
将保存于-80℃的铜绿假单胞菌KT1115取5 μL接种至5 mL LB种子培养基中，37℃，200 rpm，过夜培养。将种子液按6%的接种量接种至发酵培养基（50 mL/250 mL）中，30℃，200 rpm，培养6-9天，结果见图2。发酵8天以后，当添加有机碳源地沟油的浓度为6.0%的时候，鼠李糖脂的产量达到了最大为36.6 g/L。
实施例5
本实施例说明铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）菌株KT1115发酵生产鼠李糖脂的工艺。
本实施例所述的培养基配方（%为质量分数）：
平板培养：蛋白胨 1.0%，酵母浸出物 0.5%，氯化钠 1.0%，琼脂 2.0%，pH7.0。
种子培养基：蛋白胨 1.0%，酵母浸出物 0.5%，氯化钠 1.0%，pH7.0。
发酵培养基：粗甘油1.0%，地沟油 6.0%，硝酸钠、酵母粉、蛋白胨中取其一，无机氮源 0.5%，有机氮源 1.0%，KH2PO4 0.1%，Na2HPO4·12H2O 0.1%，MgSO4 0.01%，FeSO4·7H2O0.02%，CaCl2·2H2O 0.01%，pH 6.0。
将保存于-80℃的铜绿假单胞菌KT1115取5 μL接种至5 mL LB种子培养基中，37℃，200 rpm，过夜培养。将种子液按6%的接种量接种至发酵培养基（50 mL/250 mL）中，30℃，200 rpm，培养6-9天，结果见图3。发酵8天以后，以NaNO3为氮源的已优化碳源的发酵培养基，产鼠李糖脂的量最大为25.5 g/L，以酵母浸膏为氮源的发酵培养基中，菌体生长最好，因此以NaNO3和酵母浸膏为复合氮源。
确定再次优化发酵培养基（%为质量分数）：粗甘油1.0%，地沟油 6.0%，酵母粉1.0%，KH2PO4 0.1%，Na2HPO4·12H2O 0.1%，MgSO4 0.01%，FeSO4·7H2O 0.02%，CaCl2·2H2O0.01%，pH 6.0。添加不同浓度的NaNO3，分别为0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%。
将保存于-80℃的铜绿假单胞菌KT1115取5 μL接种至5 mL LB种子培养基中，37℃，200 rpm，过夜培养。将种子液按6%的接种量接种至发酵培养基（50 mL/250 mL）中，30℃，200 rpm，培养6-9天，结果见图4。发酵8天以后，当添加无机氮源NaNO3的浓度为0.8%的时候，鼠李糖脂的产量达到了最大为42.3 g/L。
实施例6
本实施例说明铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）菌株KT1115发酵生产鼠李糖脂的工艺。
本实施例所述的培养基配方（%为质量分数）：
种子培养基：蛋白胨 1.0%，酵母浸出物 0.5%，氯化钠 1.0%，pH7.0。
发酵培养基：粗甘油1.0%，地沟油 6.0%，酵母粉 1.0%，NaNO3 0.8%，KH2PO4 0.1%，Na2HPO4·12H2O 0.1%，MgSO4 0.01%，FeSO4.7H2O 0.02%，CaCl2·2H2O 0.01%，pH 6.0-8.0。
将保存于-80℃的铜绿假单胞菌KT1115取5 μL接种至5 mL LB种子培养基中，37℃，200 rpm，过夜培养。将种子液按6%的接种量接种至发酵培养基（50 mL/250 mL）中，pH分别为6.0、6.5、6.8、7.0、7.5、8.0，30℃，200 rpm，培养6-9天。当pH为6.8时，在中性偏酸条件下，鼠李糖脂产量最高为45.2 g/L，因此 6.8为最佳的初始pH。
实施例7
本实施例说明铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）菌株KT1115发酵生产鼠李糖脂的工艺。
本实施例所述的培养基配方（%为质量分数）：
种子培养基：蛋白胨 1.0%，酵母浸出物 0.5%，氯化钠 1.0%，pH7.0。
发酵培养基：粗甘油1.0%，地沟油 6.0%，酵母粉 1.0%，NaNO3 0.8%，KH2PO4 0.1%，Na2HPO4·12H2O 0.1%，MgSO4 0.01%，FeSO4.7H2O 0.02%，CaCl2·2H2O 0.01%，pH 6.8。
将保存于-80℃的铜绿假单胞菌KT1115取5 μL接种至5 mL LB种子培养基中，37℃，200 rpm，过夜培养。将种子液按6%的接种量接种至发酵培养基（50 mL/250 mL）中，pH6.8，在不同温度条件下，30℃、35℃、37℃，200 rpm，培养6-9天。当温度为35℃时，菌体产鼠李糖脂最高为48.7 g/L。
实施例8
本实施例说明铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）菌株KT1115发酵生产鼠李糖脂的工艺。
本实施例所述的培养基配方（%为质量分数）：
种子培养基：蛋白胨 1.0%，酵母浸出物 0.5%，氯化钠 1.0%，pH7.0。
发酵培养基：粗甘油1.0%，地沟油 6.0%，酵母粉 1.0%，NaNO3 0.8%，KH2PO4 0.1%，Na2HPO4·12H2O 0.1%，MgSO4 0.01%，FeSO4.7H2O 0.02%，CaCl2·2H2O 0.01%，pH 6.8。
将保存于-80℃的铜绿假单胞菌KT1115取5 μL接种至5 mL LB种子培养基中，37℃，200 rpm，过夜培养。发酵产鼠李糖脂将种子液按2%、4%、5%、6%、8%的接种量接种至发酵培养基（50mL/250mL）中，pH 6.8，35℃，200 rpm，培养6-9天。当接种量为5%时，测得的鼠李糖脂产量最高为50.7 g/L。
实施例8
本实施例说明绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）菌株KT1115发酵生产鼠李糖脂的提取和检测方法。
取适当发酵液加入等体积的正己烷，离心（4100 rpm，4℃，30 min）取上清；将上述上清液调节至pH2-3，4℃过夜沉降，离心（4100 rpm，4℃，30 min）收集沉淀；用原发酵液1:1.25的乙酸乙酯萃取两次，蒸干溶剂得鼠李糖脂粗品，待测。
先用1：1的40 mM的2-溴代苯乙酮和20 mM的三乙胺对鼠李糖脂进行衍生化，60℃反应1h，再进行HPLC-UV检测，条件如下：
HPLC仪器：Agilent 1260；色谱柱：C18 5μm 4.6*250mm；流动相：5%甲醇（溶液A）、95%甲醇（溶液B）；洗脱条件：0-17 min 溶液B 80%-100%、
17-25 min 溶液B 100%、25-30 min 溶液B 100%-80%、30-35 min 溶液B 80%；流速：0.4 mL/min；检测波长：254 nm。

Claims (8)

1.一株鼠李糖脂高产菌，其分类命名为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）KT1115，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏号CCTCC M 2016686。
2.权利要求1所述鼠李糖脂高产菌在发酵生产鼠李糖脂中的应用。
3.权利要求1所述鼠李糖脂高产菌在以粗甘油和/或地沟油发酵生产鼠李糖脂中的应用。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
1）种子培养 ：将保存于-80℃的铜绿假单胞菌KT1115取5 μL接种至LB种子培养基中，37℃，200 rpm，过夜培养；
2）产脂培养：将种子液按1-8%的接种量接种至发酵培养基中，pH 6.0-8.0，30-37℃，200 rpm，培养6-9天；
3）将步骤2）得到的发酵液进行鼠李糖脂的提取，依次将发酵液离心取上清、酸沉降、有机溶剂萃取后得鼠李糖脂。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基为碳源 1.0%~10%、氮源0.5%~5.0%、磷酸盐0.05%~0.5%、金属离子0.01%~0.05%，所述碳源为葡萄糖、蔗糖、豆油、粗甘油或者地沟油中的至少一种，所述氮源为硝酸钠、酵母粉、酵母浸膏、蛋白胨中的至少一种，所述磷酸盐为KH2PO4或者Na2HPO4，所述金属离子为Mg2+、Fe2+或者Ca2+中的至少一种，pH6.0。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，发酵得到的鼠李糖脂的液体的表面张力为24.8 mN/m2，乳化值达到80%。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤4）中发酵液离心取上清过程中加入等体积的正己烷，离心转速为4100 rpm，4℃，离心30 min，取上清。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基为：粗甘油 1.0%，地沟油6.0%，酵母浸膏1.0%，NaNO30.8%，KH2PO4 0.1%，Na2HPO4·12H2O 0.1%，MgSO4 0.01%，FeSO4·7H2O 0.02%，CaCl2·2H2O 0.01%，pH 6.8，培养6-9天，所述百分比为质量百分比。
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Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107557324A (zh) * 2017-10-26 2018-01-09 南京工业大学 一株铜绿假单胞菌及其应用
CN107555571A (zh) * 2017-08-25 2018-01-09 徐云丽 重金属废水的环保处理工艺
CN108342431A (zh) * 2018-05-15 2018-07-31 南京工业大学 一种鼠李糖脂的高效发酵工艺
CN108823251A (zh) * 2018-06-21 2018-11-16 华东理工大学 一种基于微量金属离子调控的生物表面活性剂发酵生产工艺
CN110997927A (zh) * 2017-07-31 2020-04-10 罗格斯技术有限责任公司 使用至少两种碳源增强鼠李糖脂类的生产
CN111286358A (zh) * 2020-02-17 2020-06-16 浙江大学舟山海洋研究中心 一种致密油脱水剂及致密油脱水方法
CN111892254A (zh) * 2020-09-02 2020-11-06 浙江一清环保工程有限公司 一种资源化利用餐厨废水、鱼粉废水发酵产鼠李糖脂的方法
CN112126598A (zh) * 2020-09-04 2020-12-25 上海恒什生物科技有限公司 一种生产鼠李糖脂的低温特性菌株及其应用和生产方法
CN114196716A (zh) * 2021-12-17 2022-03-18 万华化学集团股份有限公司 一种生产鼠李糖脂的方法
CN114621990A (zh) * 2020-12-14 2022-06-14 中国科学院沈阳应用生态研究所 一种利用铜绿假单胞菌发酵生产鼠李糖脂的培养基
CN115290765A (zh) * 2022-04-28 2022-11-04 华东理工大学 一种羧酸标记hplc-uv定量检测鼠李糖脂的方法
CN117126904A (zh) * 2023-10-26 2023-11-28 万华化学集团股份有限公司 一种循环持续发酵鼠李糖脂的方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101177696A (zh) * 2007-11-05 2008-05-14 大庆沃太斯化工有限公司 一种鼠李糖脂生物发酵液的工业化制备方法
CN101182560A (zh) * 2007-11-29 2008-05-21 湖南大学 一种提高铜绿假单胞菌产鼠李糖脂的方法
CN101845468A (zh) * 2010-03-30 2010-09-29 湖州紫金生物科技有限公司 一种鼠李糖脂的制备方法及其应用
CN101948786A (zh) * 2010-09-03 2011-01-19 中国石油天然气股份有限公司 高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌及其应用
CN105567581A (zh) * 2015-09-28 2016-05-11 中国石油化工股份有限公司 一株高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌db及其应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101177696A (zh) * 2007-11-05 2008-05-14 大庆沃太斯化工有限公司 一种鼠李糖脂生物发酵液的工业化制备方法
CN101182560A (zh) * 2007-11-29 2008-05-21 湖南大学 一种提高铜绿假单胞菌产鼠李糖脂的方法
CN101845468A (zh) * 2010-03-30 2010-09-29 湖州紫金生物科技有限公司 一种鼠李糖脂的制备方法及其应用
CN101948786A (zh) * 2010-09-03 2011-01-19 中国石油天然气股份有限公司 高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌及其应用
CN105567581A (zh) * 2015-09-28 2016-05-11 中国石油化工股份有限公司 一株高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌db及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
顾生辉等: "以甘油为底物鼠李糖脂高产菌株的诱变选育", 《生物加工过程》 *

Cited By (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11142782B2 (en) 2017-07-31 2021-10-12 Stepan Company Enhanced production of rhamnolipids using at least two carbon sources
EP3662075A4 (en) * 2017-07-31 2021-05-19 Stepan Company IMPROVED PRODUCTION OF RHAMNOLIPIDS USING AT LEAST TWO SOURCES OF CARBON
CN110997927A (zh) * 2017-07-31 2020-04-10 罗格斯技术有限责任公司 使用至少两种碳源增强鼠李糖脂类的生产
AU2018309664B2 (en) * 2017-07-31 2023-09-28 Stepan Company Enhanced production of rhamnolipids using at least two carbon sources
CN107555571A (zh) * 2017-08-25 2018-01-09 徐云丽 重金属废水的环保处理工艺
CN107557324A (zh) * 2017-10-26 2018-01-09 南京工业大学 一株铜绿假单胞菌及其应用
CN107557324B (zh) * 2017-10-26 2019-09-03 南京工业大学 一株铜绿假单胞菌及其应用
CN108342431A (zh) * 2018-05-15 2018-07-31 南京工业大学 一种鼠李糖脂的高效发酵工艺
CN108823251A (zh) * 2018-06-21 2018-11-16 华东理工大学 一种基于微量金属离子调控的生物表面活性剂发酵生产工艺
CN108823251B (zh) * 2018-06-21 2022-06-10 华东理工大学 一种基于微量金属离子调控的生物表面活性剂发酵生产工艺
CN111286358A (zh) * 2020-02-17 2020-06-16 浙江大学舟山海洋研究中心 一种致密油脱水剂及致密油脱水方法
CN111286358B (zh) * 2020-02-17 2022-05-27 浙江大学舟山海洋研究中心 一种致密油脱水剂及致密油脱水方法
CN111892254B (zh) * 2020-09-02 2022-08-16 浙江一清环保工程有限公司 一种资源化利用餐厨废水、鱼粉废水发酵产鼠李糖脂的方法
CN111892254A (zh) * 2020-09-02 2020-11-06 浙江一清环保工程有限公司 一种资源化利用餐厨废水、鱼粉废水发酵产鼠李糖脂的方法
CN112126598B (zh) * 2020-09-04 2022-08-05 上海恒什生物科技有限公司 一种生产鼠李糖脂的低温特性菌株及其应用和生产方法
CN112126598A (zh) * 2020-09-04 2020-12-25 上海恒什生物科技有限公司 一种生产鼠李糖脂的低温特性菌株及其应用和生产方法
CN114621990A (zh) * 2020-12-14 2022-06-14 中国科学院沈阳应用生态研究所 一种利用铜绿假单胞菌发酵生产鼠李糖脂的培养基
CN114196716B (zh) * 2021-12-17 2023-05-26 万华化学集团股份有限公司 一种生产鼠李糖脂的方法
CN114196716A (zh) * 2021-12-17 2022-03-18 万华化学集团股份有限公司 一种生产鼠李糖脂的方法
CN115290765B (zh) * 2022-04-28 2024-02-13 华东理工大学 一种羧酸标记hplc-uv定量检测鼠李糖脂的方法
CN115290765A (zh) * 2022-04-28 2022-11-04 华东理工大学 一种羧酸标记hplc-uv定量检测鼠李糖脂的方法
CN117126904A (zh) * 2023-10-26 2023-11-28 万华化学集团股份有限公司 一种循环持续发酵鼠李糖脂的方法
CN117126904B (zh) * 2023-10-26 2024-02-02 万华化学集团股份有限公司 一种循环持续发酵鼠李糖脂的方法

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