CN111286476B - 一株高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌及其应用 - Google Patents

一株高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物领域，公开了一株高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌及其应用，本发明筛选得到了一株铜绿假单胞菌，该菌株具有异常出色的表面活性剂产鼠李糖脂能力，在经过发酵后鼠李糖脂的产量可达到127g/L，显著高于已发现的其他同类菌株。本发明的铜绿假单胞菌可应用于鼠李糖脂制备、植物抗蒸腾以及致密油脱水等领域。

Description

一株高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，尤其涉及一株高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌及其应用。
背景技术
表面活性剂一般由亲水疏油的极性基团和疏水亲油的非极性基团构成，少量添加便可大幅降低水的表面张力，显著改变体系中的界面性质及状态，具有破乳、发泡、增溶、分散、乳化、絮凝等多方面性能，可广泛应用于工业生产中，素有“工业味精”之称。但多年以来，表面活性剂的生产往往采用化学法合成，生产过程产生的废水废气对环境污染严重，且合成表面活性剂大部分不易被生物降解，易于在环境中大量沉积，降低土壤中污染物的移动性，增加水体有毒物质的溶解性，并能在动物细胞中积累，影响机体肝功能，降低免疫力。
目前，随着人们环保意识的提高，人们对清洁、安全、高效的生物表面活性剂的需求不断加大，在众多的生物表面活性剂中，糖脂类占有非常大的比例。而在糖脂中，鼠李糖脂在生物医药、环境保护、二次采油等方面具有很高的应用潜力。
当鼠李糖脂的临界胶束浓度在10～200mg/L时，鼠李糖脂能够使油/水界面张力43mN/降低至＜1mN/m，使水的表面张力从72mN/m降至30mN/m，与其他生物表面活性剂相比，具有更低的表面和界面张力。因而，鼠李糖脂在环境工业、石油工业、食品及化妆品行业、生物医疗等领域具有广阔的应用潜力。目前，人们更加关注鼠李糖脂在环境修复和提取采油率方面的应用。
生物表面活性剂因其良好的表面活性及环境友好性、生物可降解性及合成原料的巧单易得等优点受到人们的推崇，而鼠李糖脂作为其中研究最多、效果较好的一类，有望成为下一代市场上占据主要地位的表面活性剂。然而，由于鼠李糖脂是微生物发酵所产的，与人工合成量产相比，在产量上不占优势，因此需要我们不断发现一些高产鼠李糖脂的微生物以提升鼠李糖脂的生产效率。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一株高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌及其应用，本发明的铜绿假单胞菌具有异常出色的表面活性剂产鼠李糖脂能力，在经过发酵后鼠李糖脂的产量可达到127g/L，显著高于已发现的其他同类菌株。本发明的铜绿假单胞菌可应用于鼠李糖脂制备、植物抗蒸腾以及油田脱水等领域。
本发明的具体技术方案为：
第一方面，本发明提供了一株高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌，所述铜绿假单胞菌命名为zs1.1，已在2019年12月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC 19110，微生物分类命名为铜绿假单胞菌Pseudomonasaeruginosa。
本发明从舟山海域油污泥中筛选出了一株高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌，该菌株具有异常出色的表面活性剂产鼠李糖脂能力，在经过发酵后鼠李糖脂的产量可达到127g/L，显著高于已发现的其他同类菌株。
第二方面，本发明提供了一种高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌的突变体，所述突变体为对所述铜绿假单胞菌进行诱变、驯化、基因重组或者经自然突变而获得的突变体。
第三方面，本发明提供了一种含有所述铜绿假单胞菌或含有所述突变体的菌体培养物。
作为优选，所述菌体培养物为菌液或菌剂。
第四方面，本发明将所述铜绿假单胞菌或所述突变体或所述菌体培养物应用于鼠李糖脂的制备。
本发明提供了一种含有鼠李糖脂的发酵液的制备方法，包括以下步骤：
1)将产鼠李糖脂的菌株以1-3％的比例接入种子培养基中进行扩大培养，得到种子菌发酵液。
2)将种子菌发酵液以4-5％的接种量接种于灭菌后的发酵罐培养基中；所述发酵罐培养基中含有鱼油、樟树油和棕榈油中的至少一种。
3)对发酵过程中pH值的进行分段控制，同时补充加入碳源，经通气发酵得到含有鼠李糖脂的发酵液。
本发明采用鱼油、樟树油、棕榈油作为发酵培养基的主要成分，通过分段pH控制和分批补料发酵，可显著缩短发酵时间，提高产品得率，发酵结束发酵液中鼠李糖脂的浓度为120-127g/L，生产工艺简单且易于实现。能够解决传统鼠李糖脂发酵技术存在的生产成本高、发酵规模小、产品得率低等问题，实现了中试发酵水平上低成本制备鼠李糖脂的目标。
本发明采用鱼油、樟树油、棕榈油作为发酵培养基主要成分，其中，选用用鱼油的原因在于：1、浙江舟山或者沿海有大量的废弃物，可以产生大量鱼油，获取成本比较低，粗鱼油成本在5元1公斤以下，比玉米油等植物油价格都要低；2、鱼油发酵后清澈透明，呈橙红色，产品形态比较好。可以大规模的生产发酵。3、目前应用鱼油做鼠李糖脂的几乎没有。采用樟树油的原因在于：用樟树油做鼠李糖脂后产品透明易分离，并且目前还几乎没有用樟树油做鼠李糖脂的研究。采用棕榈油的原因在于：棕榈油饱和性脂肪酸含量高，导致在发酵时氧化较少，不会产生异味。同时目前应用棕榈油产鼠李糖脂的研究较少。
作为优选，步骤1)中，所述种子培养基为矿物盐培养基MSM，且含有质量体积比为1-3％的酵母粉。
作为优选，步骤1)中，扩大培养的条件为：在25-35℃环境下，摇床转速150-200r/min，培养7-8h。
作为优选，步骤2)中，所述发酵罐培养基中含有：鱼油和/或樟树油和/或棕榈油35-45g/L，NaNO3 5.0-5.5g/L，NH4NO3 2.5-3.0g/L，Na2PO4 8-12g/L，KH2PO4 7-8g/L，MgSO4·7H2O 0.2-0.4g/L，CaCl2 9.5-10.5g/L，微量元素溶液2.5-2.5mL/L，酵母粉0.3-0.7g/L。
作为优选，步骤2)中，所述微量元素溶液中含有：FeSO4·7H2O 15-20g/L；ZnSO4·7H2O 2.5-3.5g/L；MnSO4·2H2O 2.5-3.5g/L。
作为优选，步骤2)中，发酵罐培养基的培养基初始pH值调节为6.5-7.5，转速250-350rpm，溶氧量40-50％，罐压0.03-0.05mPa。
作为优选，步骤3)中：在发酵后的前24h内控制pH值为7.0-8.0，在发酵24h后将pH控制在6.0-6.5之间；在发酵24h后开始补加碳源，在20-30h、40-50h、70-80h时分别补加0.8-1.2wt％、1.5-2.5wt％、1.5-2.5wt％的碳源；所述碳源鱼油、樟树油和棕榈油中的至少一种。
本发明在前期将pH控制在7左右，能够使菌株快速生长，后期控制pH在6.0-6.5，可提高鼠李糖脂的产率。
作为优选，步骤3)中，发酵总时间为90h以上。
第五方面，本发明将所述铜绿假单胞菌或所述突变体或所述菌体培养物应用于植物抗蒸腾中。具体的，利用铜绿假单胞菌所产的鼠李糖脂作为抗蒸腾剂的组分。
第六方面，本发明将所述铜绿假单胞菌或所述突变体或所述菌体培养物应用于致密油脱水。
与现有技术对比，本发明的有益效果是：本发明从舟山海域油污泥中筛选出了一株高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌，该菌株具有异常出色的表面活性剂产鼠李糖脂能力，在经过发酵后鼠李糖脂的产量可达到127g/L，显著高于已发现的其他同类菌株。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
总实施例
第一方面，一株高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌，所述铜绿假单胞菌命名为zs1.1，已在2019年12月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC 19110，微生物分类命名为铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa。
第二方面，一种高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌的突变体，所述突变体为对所述铜绿假单胞菌进行诱变、驯化、基因重组或者经自然突变而获得的突变体。
第三方面，一种含有所述铜绿假单胞菌或含有所述突变体的菌体培养物。
作为优选，所述菌体培养物为菌液或菌剂。
第四方面，本发明将所述铜绿假单胞菌或所述突变体或所述菌体培养物应用于鼠李糖脂的制备。
第五方面，本发明将所述铜绿假单胞菌或所述突变体或所述菌体培养物应用于植物抗蒸腾中。具体的，利用铜绿假单胞菌所产的鼠李糖脂作为抗蒸腾剂的组分。
第六方面，本发明将所述铜绿假单胞菌或所述突变体或所述菌体培养物应用于致密油脱水。
第七方面，一种含有鼠李糖脂的发酵液的制备方法，包括以下步骤：
1)将产鼠李糖脂的菌株以1-3％的比例接入种子培养基中进行扩大培养，得到种子菌发酵液。
2)将种子菌发酵液以4-5％的接种量接种于灭菌后的发酵罐培养基中；所述发酵罐培养基中含有鱼油、樟树油和棕榈油中的至少一种。
3)对发酵过程中pH值的进行分段控制，同时补充加入碳源，经通气发酵得到含有鼠李糖脂的发酵液。
作为优选，步骤1)中，所述种子培养基为矿物盐培养基MSM，且含有质量体积比为1-3％的酵母粉。扩大培养的条件为：在25-35℃环境下，摇床转速150-200r/min，培养7-8h。
作为优选，步骤2)中，所述发酵罐培养基中含有：鱼油和/或樟树油和/或棕榈油35-45g/L，NaNO3 5.0-5.5g/L，NH4NO3 2.5-3.0g/L，Na2PO4 8-12g/L，KH2PO4 7-8g/L，MgSO4·7H2O 0.2-0.4g/L，CaCl2 9.5-10.5g/L，微量元素溶液2.5-2.5mL/L，酵母粉0.3-0.7g/L。微量元素溶液中含有：FeSO4·7H2O 15-20g/L；ZnSO4·7H2O 2.5-3.5g/L；MnSO4·2H2O 2.5-3.5g/L。
作为优选，步骤2)中，发酵罐培养基的培养基初始pH值调节为6.5-7.5，转速250-350rpm，溶氧量40-50％，罐压0.03-0.05mPa。
作为优选，步骤3)中：在发酵后的前24h内控制pH值为7.0-8.0，在发酵24h后将pH控制在6.0-6.5之间；在发酵24h后开始补加碳源，在20-30h、40-50h、70-80h时分别补加0.8-1.2wt％、1.5-2.5wt％、1.5-2.5wt％的碳源；所述碳源鱼油、樟树油和棕榈油中的至少一种。发酵总时间为90h以上。
具体实施例
配制种子培养基：矿物盐培养基(MSM)+2％酵母粉(质量体积比)，取甘油管中的铜绿假单胞菌zs1.1以2％的比例接入种子培养基，在30℃，摇床转速180r/min的条件下，培养7h。
配制发酵培养基：鱼油15g/L、樟树油15g/L、棕榈油10g/L，NaNO3 5.43g/L，NH4NO32.56g/L，Na2PO4 10g/L，KH2PO4 7.7g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，CaCl2 10.01g/L，微量元素溶液3mL/L(FeSO4·7H2O 18g/L；ZnSO4·7H2O 3.0g/L；MnSO4·2H2O 3.0g/L)，酵母粉0.5g/L。
在50L罐中装入30L发酵培养基，调节培养基初始pH值为7，采用立式原位灭菌。初始条件为：转速300rpm，溶氧量45％，罐压0.04mPa左右。
将扩培后的种子菌发酵液以4.5％的接种量接种于灭菌后的发酵罐培养基中，进行通气发酵。
在发酵前期(前24h)控制pH值为7.0-8.0之间，在发酵中后期(24h)将pH控制在6.0-6.5之间。
在发酵24h后开始补料，在24h、48h、72h时分别补加1％、2％、2％的碳源(鱼油、樟树油和棕榈油)。共发酵96h。
通过排油圈法测定发酵液中鼠李糖脂产量：鼠李糖脂作为表面活性剂具有亲水亲油两性基团可以用排油圈法进行检测，直接测定鼠李糖脂活性。经检测，发酵结束发酵液中鼠李糖脂的浓度为127g/L。
对比例
选用其他的铜绿假单胞菌，与实施例采用相同的发酵工艺，并进行产量对比，结果如下：
铜绿假单胞菌 96h内最高产量g/L
Zs1.1(实施例) 127
Zs2(对比例) 57
注：Zs2为分离自与本发明菌株同一样品的菌株。
应用实施例1(植物抗蒸腾)
一种植物抗蒸腾剂，包括鼠李糖脂和溶剂。
作为优选，所述鼠李糖脂的浓度为0.1-2wt％。作为优选，植物抗蒸腾剂还包括聚谷氨酸。作为优选，所述聚谷氨酸的浓度为0.1-2wt％。作为优选，所述溶剂为水。
一种植物抗蒸腾剂的制备方法，包括以下步骤：
A)通过产鼠李糖脂的菌株发酵制得鼠李糖脂发酵液；
B)从发酵液中分离鼠李糖脂：发酵完成后，经过双效真空浓缩，得到高浓度的鼠李糖脂样品。然后经过酸沉和乙酸乙酯提取，进一步浓缩，最后经过干燥得到鼠李糖脂样品。
C)将鼠李糖脂与其他组分复配，得到植物抗蒸腾剂。
抗蒸腾强度实验
选择舟山本地石楠叶片，于清晨采回，洗去污物，轻轻擦干。叶片根部插入装有50毫升植物抗蒸腾剂溶液的100毫升烧杯中。以蒸馏水作对照。将装好叶片的烧杯置于26℃室温中，用5000米烛光荧光灯照光24小时。量出每杯失水量，用面积仪求出叶面积，计算出蒸腾强度，结果如下表所示。
从表中可以看出，24h后添加了鼠李糖脂和聚谷氨酸溶液的叶片都体现出了较好的抗蒸腾的作用，其中0.5％的鼠李糖脂+0.5％的聚谷氨酸的蒸腾强度最小，也就是抗蒸腾效果最好，较溶液为水的一组抗蒸腾效果提高了33％。
Figure GDA0002461090750000061
倒掉溶液，用蒸馏水冲洗三次。再将所有叶片插入装有50毫升蒸馏水的100毫升烧杯中，置26℃室温中照光24小时。量出每杯失水量，用面积仪求出叶面积，计算出蒸腾强度。以对照失水量为基数，计算出各叶片的相对失水率，结果如下表所示。
从表中可以看出，48h后添加了鼠李糖脂和聚谷氨酸溶液的叶片都体现出了较好的抗蒸腾的作用，其中0.5％的鼠李糖脂蒸腾强度最小，也就是抗蒸腾效果最好，较溶液为水的一组抗蒸腾效果提高了19％。
Figure GDA0002461090750000062
结论
本发明的植物抗蒸腾剂是通过植物吸收后减弱植物自身的蒸腾作用来实现抗蒸腾效果的，与现有的喷涂型植物抗蒸腾剂相比，无需喷涂于植物叶片表面，因此不会影响植物光合作用和呼吸作用，并且不易被雨淋落(现有的植物抗蒸腾剂的使用方式都是将植物抗蒸腾剂喷于植物叶片或枝干表面，通过物理作用来阻隔植物自身水分的蒸腾，该方法虽然能够有效降低植物水分的过度流失，但是同时也会影响植物必要的光合作用和呼吸作用，阻碍植物对氧气的吸收和二氧化碳的排放。另外，喷洒完毕后容易被雨淋落，从而失去效果)。
应用实施例2(致密油脱水)
一种致密油脱水剂，包括鼠李糖脂剂和破乳剂。
作为优选，所述鼠李糖脂剂的浓度为25-35wt％，所述破乳剂为由摩尔比为(0.8-1.2)：(0.8-1.2)的聚氧乙烯与聚氧丙烯聚合所得的聚氧乙烯聚氧丙烯醚(以多乙烯多胺为引发剂)；所述鼠李糖脂剂与破乳剂质量比为(45：55)～(70：30)。
作为优选，所述致密油脱水剂的使用浓度大于200mg/L。
一种致密油脱水剂的制备方法，包括以下步骤：
A)通过产鼠李糖脂的菌株发酵制得鼠李糖脂发酵液。
B)从发酵液中分离鼠李糖脂：发酵完成后，经过双效真空浓缩，得到高浓度的鼠李糖脂样品。然后经过酸沉和乙酸乙酯提取，进一步浓缩，最后经过干燥得到鼠李糖脂。
C)将鼠李糖脂配制为鼠李糖脂剂后再与破乳剂复配，得到致密油脱水剂。
作为优选，发酵总时间为90h以上。
一种致密油脱水方法，采用上述致密油脱水剂。作为优选，脱水时间至少为8h，脱水温度为60-80℃。
微生物表面活性剂筛选试验
(1)试验油样：吉祥联合站分离器出口油样
(2)试验温度：65℃
(3)试验加药浓度：100mg/L、200mg/L、500mg/L、800mg/L、1000mg/L
(4)微生物表面活性剂：浙江大学章春芳博士提供6个微生物表面活性剂(3wt％鼠李糖脂、30wt％鼠李糖脂、Hy Ser 1LTn量、CH1鼠李糖脂、铜绿假单胞菌、不动杆菌乳化层)，将上述微生物表面活性剂配制为10％水溶液备用；
微生物表面活性剂与破乳剂复配试验
(1)试验油样：吉祥联合站分离器出口油样
(2)试验温度：70℃
(3)试验加药浓度：100mg/L、200mg/L
微生物表面活性剂筛选试验
试验油样采用吉祥联合站分离器出口油样，对吉祥联合站分离器出口油样进行脱水评价试验，以标准SY/T 5280-2000《原油破乳剂使用性能检测方法(瓶试法)》进行脱水评价试验。
本次试验油样含水28.0％，温度分别在65℃，加药量为100mg/L、200mg/L、500mg/L、800mg/L、1000mg/L的条件下进行破乳剂评价试验。具体实验数据见下表。
昌吉致密油微生物表面活性剂筛选试验结果
Figure GDA0002461090750000081
由以上实验数据可知，在65℃下，加入30％鼠李糖脂达200mg/L时，热化学沉降4h后脱水率为71.3％，加入30％鼠李糖脂达500mg/L时，热化学沉降4h后脱水率为74.8％，当30％鼠李糖脂加药浓度大于200mg/L，其脱水率基本无较大变化，因此针对昌吉致密油，在65℃下，30％鼠李糖脂具有良好的脱水效果，加药浓度应不小于200mg/L。
微生物表面活性剂3％鼠李糖脂、Hy Ser 1LTn量、CH1鼠李糖脂、铜绿假单胞菌、不动杆菌乳化层，该5种微生物表面活性剂均未表现出良好的脱水效果；
微生物表面活性剂与破乳剂复配试验
试验油样采用吉祥联合站分离器出口油样，对吉祥联合站分离器出口油样进行脱水评价试验，以标准SY/T 5280-2000《原油破乳剂使用性能检测方法(瓶试法)》进行脱水评价试验。
本次试验油样含水28.0％，温度在70℃，加药量为200mg/L的条件下进行破乳剂评价试验。具体实验数据见下表。
微生物表面活性剂与破乳剂KL-7(聚氧乙烯聚氧丙烯醚(HO(C2H4O)10-15(C3H6O)18-23(C2H4O)10-15H)复配试验结果
Figure GDA0002461090750000091
根据上表可知，当加药浓度在200mg/L下，破乳剂热化学沉降8h后脱水率达80.5％，当掺入不同比例的30％鼠李糖脂后，前1h脱水速率显著增快，最终8h后脱水率最高可达89.8％。
结论
(1)在65℃下，30％鼠李糖脂具有良好的脱水效果，而微生物表面活性剂3％鼠李糖脂、HySer 1LTn量、CH1鼠李糖脂、铜绿假单胞菌、不动杆菌乳化层，该5种微生物表面活性剂均未表现出良好的脱水效果；
(2)当在破乳剂KL-7中掺入不同比例的30％鼠李糖脂后，不仅可提高前期脱水速率，还能够保持理想的终脱水率。
(3)本发明通过将鼠李糖脂和破乳剂进行复配，发现不仅能够保持很高的最终脱水率，并且还能够提升在致密油脱水前期的脱水效率。1、前期添加后起效快，可以提高脱水效率，缩短脱水时间；2、对含水率高、乳化程度高的致密油品经预脱水后，二次脱水效率提高。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (6)

1.一株高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌，其特征在于：所述铜绿假单胞菌命名为zs1.1，已在2019年12月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC 19110，微生物分类命名为铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa。
2.一种含有如权利要求1所述铜绿假单胞菌的菌体培养物。
3.如权利要求2所述的菌体培养物，其特征在于，所述菌体培养物为菌液或菌剂。
4.如权利要求1所述铜绿假单胞菌或权利要求2所述菌体培养物在制备鼠李糖脂中的应用。
5.如权利要求1所述铜绿假单胞菌或权利要求2所述菌体培养物在植物抗蒸腾中的应用。
6.如权利要求1所述铜绿假单胞菌或权利要求2所述菌体培养物在致密油脱水中的应用。
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