CN104342392B - 一种降解多环芳烃的氧化微杆菌及其应用 - Google Patents

一种降解多环芳烃的氧化微杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种降解多环芳烃的氧化微杆菌及其应用。具体地说，本发明提供了一株保藏编号为CGMCC No.9072氧化微杆菌Microbacterium oxydans吉2菌株，以及其乳化和降解原油和多环芳烃和室内物理模拟驱油的应用效果，本发明的氧化微杆菌菌株，能以原油或者多环芳烃为唯一的碳源和能源在好氧和厌氧条件下乳化降解原油；降解后的多环芳烃如萘的降解率达到100％，降解后的原油分析发现对原油组分中主要降解芳香烃和胶质部分。该菌株及其降解性质可以用于降解环境中的多环芳烃，也可以用于微生物采油，提高采油率。

Description

一种降解多环芳烃的氧化微杆菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物生物技术和环境生物技术领域，具体地说，本发明涉及一株保藏编号为CGMCC No.9072的氧化微杆菌Microbacterium oxydans吉2菌株及其用于乳化、降解原油和多环芳烃以及室内物理模拟驱油。
背景技术
目前我国大多数油田已经进入高含水开发阶段，原油剩余可采储量不足，难度增大，已开发的主力油田将面临总产量递减的严峻形势。因此提高原油采收率一直是世界采油业广泛关注的问题。近年来，微生物采油作为一项经济有效的接替技术已受到普遍重视，得到迅速的发展，并显示出良好的应用前景。
微生物提高石油采收率(MEOR)技术是利用微生物在地层中的繁殖活动及其代谢产物与原油或油藏的相互作用，达到提高石油采收率的目的，到目前已经有多年的历史，在国内外都有较为广泛的应用。其基本原理是：①就地生成的生物表面活性剂、CO2、CH4等气体和甲酸、乙酸等小分子有机酸改善原油的性质，增强原油在水中的溶解能力；②利用降解作用将大分子的烃类转化为低分子的烃，或对原油中的重质组分(如胶质、沥青质)进行降解，降低原油在地层中的绝对粘度，提高其流动性；③产生生物聚合物将固结的原油分散成滴状，或堵塞地层大孔道，使孔隙压力重新分布，改善地层渗流规律，扩大水驱波及体积。与其它三次采油技术相比，MEOR具有适用范围广、工艺简单、投资少、见效快、功能多、费用低、不损伤油层和无污染等优点，是目前最具发展前景的一项提高原油采收率的技术。
以往的微生物采油菌种筛选主要以降解长链烷烃、环烷烃、蜡质等饱和烃菌种为主，但一些稠油油藏中大分子或超大分子的多环芳烃含量高，饱和烃降解菌很难降解这些原油组分。而这些组分才是引起原油黏度上升的根本原因。因此有必要筛选出可降解多环芳烃等大分子的菌种。尽管在石油的组分中多环芳烃等大分子物质最为难于降解，但目前已经有一些关于微生物降解长链烷烃、多环芳烃，甚至胶质、沥青质的报道。利用微生物对原油中的多环芳烃和胶质等重质组分进行降解以提高原油采收率，这一技术在采油过程中得到了一定的应用并有继续发展的趋势。有数据表明，稠油中多环芳烃或胶质含量每降低5％，能使稠油粘度下降10％～30％。因此多环芳烃的专一降解对于稠油降黏更具有最直接、最本质的意义。
发明内容
本发明的目的在于针对石油资源的日益短缺和勘探费用不断增加的问题，提供一种可专一降解稠油多环芳烃的菌株，并提供其在微生物采油领域的应用的方法。
一方面，本发明提供了一株氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)菌株，本发明中亦命名其为吉2菌株，其是从新疆油田油水样采出水中分离、并以多环芳烃为唯一碳源的情况下在35℃反复驯化培养而获得。该菌株已于2014年4月18日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”(CGMCC)(保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，其保藏日期2014年4月18日；保藏号CGMCC No.9072；分类命名：氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)。即，本发明提供了保藏编号为CGMCC No.9072的氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)。本发明的氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)CGMCC No.9072(即，本发明的菌株吉2)在LB平板上培养一天的菌落特征：直径大小3～5mm，菌落表面扁平、不透明、边缘整齐、黄色。
本发明的氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)CGMCC No.9072的细胞形态特征：革兰氏染色阳性，菌体呈细长，不规则的杆状，有1～3根鞭毛，能运动，好氧生长，细胞大小1.0～4.0μm(长)×0.4～0.8μm(宽)，大多数菌体呈单个或成对，有的排列成直角或V字形。
本发明的氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)CGMCC No.9072的生理生化特征：菌落不透明，有光泽，黄色，较小，光滑，边缘规整，凸起。不生孢，不耐热，生长温度10～40℃，最适28～34℃，不抗酸，生长pH范围5-12，好氧，弱厌氧。NaCl耐受性0～7％。接触酶实验，运动性实验，革兰氏染色，V-P实验，氧化酶抗性实验，淀粉水解，硝酸盐还原到亚硝酸盐实验均为阳性，自养生长，葡萄糖产气实验，酪氨酸水解，苯丙氨酸脱氢酶实验，NaCl和KCl需求实验，尿囊素和尿素盐需求实验，溶菌酶抗性实验，H2S产气实验皆为阴性，能够利用D-葡萄糖，L-阿拉伯糖，D-甘露醇产酸，不能利用D-木糖产酸，能利用柠檬酸盐和丙酸盐。降解多环芳烃和胶质等大分子原油组分，产生生物乳化剂。
表1为本发明的氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)菌株吉2的部分生理生化实验结果。
表1吉2生理生化实验结果
注：+大于等于90％为阳性；－小于等于90％为阴性；+W弱反应；ND未测定。
本发明的氧化微杆菌(Microbacterium oxydans sp.)CGMCC No.9072的16S rDNA基因序列长度为1563bp，在GenBank中的登录号为KJ627769，与(Microbacterium oxydans)的16S rDNA(登录号为AB365061.1)序列相似性为99％。其16S rDNA的序列如SEQ ID No.1和图2所示。
参照《Bergey’s Mannual of Systematic Bacteriology》Vol.VIII的内容，根据其形态特征和生理生化特征，以及根据其16S rDNA基因序列在GenBank中的搜索结果，经多项分类鉴定吉2属于氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)。
本发明的氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)CGMCC No.9072可以在营养培养基，如：普通牛肉汁、LB、营养琼脂中生长，也可以在添加葡萄糖或蔗糖的无机盐培养基中生长，也可以以原油和芳香烃为碳源生长。菌株在10～40℃之间好氧生长，弱厌氧生长。吉2在半固体穿刺培养基中靠近底部能生长，但较表层生长慢。表明其具有兼性厌氧生长的特性，可以在低氧的环境中生长，具备环境修复和微生物采油的潜在应用价值。
另一方面，本发明还提供了一种能够好氧或者厌氧生长的微杆菌制剂，该微杆菌制剂中包含有保藏编号为CGMCC No.9072的氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)，该制剂为固态或者液态菌制剂。由CGMCC No.9072的氧化微杆菌制备所述微杆菌制剂的过程可以参照所属领域的常规操作进行。
另一方面，本发明还提供了所述的氧化微杆菌CGMCC No.9072或所述的氧化微杆菌制剂在发酵培养生产用于乳化油品的乳化剂中的应用。此外还提供了所述的氧化微杆菌CGMCC No.9072或所述的氧化微杆菌制剂在降解原油和/或多环芳烃中的应用。
本发明的氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)CGMCC No.9072生长繁殖过程中能够产生表面活性剂作为油品乳化剂，特别是能够以原油或多环芳烃为唯一碳源生产乳化剂并降解多环芳烃。在本发明的一研究实验中，将该菌在35℃温度条件下，通过无机盐培养基生长繁殖过程能同时降解加入的500mg/L的萘、菲、蒽、芘的多环芳烃混合物。其基础培养基组成为g/L：K2HPO41、KH2PO41、NaNO34、MgSO40.5、(NH4)2SO42，酵母粉0.2，pH 6.8-7.2。往复摇床120rpm转速培养14天，氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)吉2在3天时萘的降解率大约为70.0％，7天时萘降解率达到100％。吉2在7天时对菲的降解率达到95.4％。吉2在7天时对蒽的降解率达到是73.8％。以上结果说明，吉2能够降解不同系列的多环芳烃。
本发明的另一研究实验表明，氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)CGMCCNo.9072在5％的稠油中生长繁殖，降解7天后的原油脱水，气相-质谱对降解后的芳香烃分析后得出，该菌株能够降解原油中的萘系列(芳香烃中相对含量从3.82％到3.3％)，菲系列(芳香烃中相对含量从4.16％到3.72％)，噻吩系列(芳香烃中相对含量从1.43％到0.45％)，芴系列(芳香烃中相对含量从0.98％到0.65％)，屈系列(芳香烃中相对含量从6.51％到5.67％)，而对C21-三芳甾烷，芘系列和苯并芘的降解效果不明显。说明该菌株能够降解石油污染环境中的多环芳烃。
本发明的氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)CGMCC No.9072具有很高的降解石油及芳香烃的能力。用吉2生长细胞进行降解实验结果表明，该菌在35℃温度条件下，通过基础培养基生长繁殖过程能同时降解加入的20g/L的原油或20g/L的芳香烃，其基础培养基组成为g/L：K2HPO41，KH2PO41，NaNO34，MgSO40.5，(NH4)2SO42，酵母粉0.2，pH 6.8-7.2。往复摇床120rpm转速培养14d，一种在35℃下黏度为1036mPa·s的稠油降解率均可达46.9％，一种在37℃下黏度为101.2mPa·s的原油降解率均可达53.4％。傅立叶红外傅立叶红外光谱测定(IR)分析结果表明：微生物作用后的原油在3000～3200cm-1之间的吸收峰明显增加，说明原油中羟基含量增加，在500～2000cm-1之间出现了很多新的吸收峰，而且原来和新出现的吸收峰都明显增加，这些事碳碳单键，碳碳双键等官能团的吸收峰。表明微生物降解胶质后产生了许多新的官能基团。该菌作用50％在35℃下黏度为1036mPa·s的稠油，能降低原油粘度63.4％，作用50％在37℃下黏度为101.2mPa·s的原油，能降低原油粘度70.5％。
根据本发明的具体实施方案，本发明的氧化微杆菌CGMCC No.9072或氧化微杆菌制剂在发酵培养生产用于乳化油品的乳化剂时，具体而言，是将所述的氧化微杆菌或氧化微杆菌制剂在营养培养基中发酵培养，所得发酵液可直接作为油品乳化剂，或者，也可从发酵液中分离提取含有表面活性剂的组分作为油品乳化剂。更具体地，所述营养培养基可以为普通肉汤培养基、LB培养基、营养琼脂培养基、或包括碳源的无机盐培养基。包括碳源的无机盐培养基中，所述碳源可以是包括葡萄糖、蔗糖、原油、芳香烃等中的一种或多种；对于葡萄糖、蔗糖等糖类碳源，其在培养基中的含量通常为5～40g/L，而当本发明的培养基中采用原油和/或芳香烃(例如多环芳烃萘、菲、蒽、芘等中的一种或多种)作为菌种生长碳源时，原油在发酵培养基中的含量优选为0.5～10g/L，多环芳烃在发酵培养基中的含量优选为100～1000mg/L。优选地，无机盐培养基中除碳源为的其他成分可以为：K2HPO40.8～1.2g/L、KH2PO40.8～1.2g/L、NaNO33～5g/L、MgSO40.4～0.6g/L、(NH4)2SO41～3g/L、酵母粉0.1～0.3g/L，pH 6.8～7.2。具体的培养条件通常是在30～37℃，100～200rpm摇床培养3～14天，所得发酵液可直接作为油品乳化剂，或者通过进一步分离纯化制得用于乳化油品的乳化剂。
根据本发明的具体实施方案，本发明的氧化微杆菌CGMCC No.9072或氧化微杆菌制剂在降解原油和/或多环芳烃时，具体而言，是将本发明所述的氧化微杆菌或氧化微杆菌制剂与待降解的原油和/或多环芳烃混合，使氧化微杆菌在混合体系中培养生长，从而降解原油和/或多环芳烃。优选地，还可向氧化微杆菌与待降解的原油和/或多环芳烃的混合体系中加入氧化微杆菌培养基，以促进氧化微杆菌的生长，从而促进原油和/或多环芳烃的降解。所述氧化微杆菌培养基可以为普通肉汤培养基、LB培养基、营养琼脂培养基、或无机盐培养基等。由于该应用是用于降解原油和/或多环芳烃，采用的无机盐培养基可不包括碳源，本发明的氧化微杆菌CGMCC No.9072能以待降解的原油和/或多环芳烃为碳源生长繁殖，即，所述无机盐培养基的组成可以为：K2HPO40.8～1.2g/L、KH2PO40.8～1.2g/L、NaNO33～5g/L、MgSO40.4～0.6g/L、(NH4)2SO41～3g/L、酵母粉0.1～0.3g/L，pH 6.8～7.2；可以理解，采用的无机盐培养基也可酌情包括少量的碳源，例如葡萄糖、蔗糖类碳源。具体的降解过程优选在25～45℃优选在28～37℃最适温度条件下进行，以利氧化微杆菌的生长繁殖。
本发明的氧化微杆菌CGMCC No.9072可降解各种原油，例如可以是直接开采出的原油(可以是稠油)，也可以是废弃原油，例如可包括石油工业生产中形成的油田污水中的废弃油渣。所降解的多环芳烃可以包括萘、菲、蒽、芘中的任一种或多种。
另一方面，本发明还提供了本发明所述的氧化微杆菌CGMCC No.9072或所述的氧化微杆菌制剂在驱油中的应用。具体应用时，是将所述的氧化微杆菌或氧化微杆菌制剂在营养培养基中发酵培养，所得发酵液用于驱油以提高原油采收率；或者，将所得发酵液与含有铜绿假单胞菌的菌液复配后用于驱油。所述营养培养基如前所述，可以为普通肉汤培养基、LB培养基、营养琼脂培养基、或包括碳源的无机盐培养基等。所述碳源可以包括葡萄糖、蔗糖、原油、芳香烃中的一种或多种。
本发明的氧化微杆菌进行物理模拟驱油实验，结果表明：该菌株与一株铜绿假单胞菌Q11(ATCC27853，购于南京便诊生物科技有限公司，以下实验涉及铜绿假单胞菌实验均是此菌株)复配发酵液使均质岩心的驱油效率率提高12.3％，非均质岩心驱油效率提高15.6％。可见本发明的表面活性剂可有效提高原油采收率，在微生物采油、驱油过程中有很强大的应用潜力。
综合而言，本发明提供的CGMCC No.9072菌能够在28～37℃最适温度条件下，以原油或多环芳烃为碳源和能源生长，对35℃下黏度为1036mPa·s的稠油的降解率可达46.9％；对37℃下黏度为101.2mPa·s的原油降解率达到53.4％。该菌株及其发酵液在高温条件下能很好的乳化烷烃或原油，进而对芳香烃进行降解，降低烷烃或原油的粘度和凝固点，最高可降粘度70.5％，菌株CGMCC No.9072和一株铜绿假单胞菌Q11(Pseudomonasaeruginosa，ATCC27853)发酵液等比例复配应用于物理模拟驱油实验，使均质岩心的驱油效率率提高12.3％，非均质岩心驱油效率提高15.6％。该菌株能够在含500mg/L萘、菲、蒽、芘的多环芳烃中生长，7天对萘的降解率达到100％，对菲的降解率达到95.4％，对蒽的降解率达到73.8％，对芘的降解率达到13.4％，能够降解一系列的多环芳烃。该菌株在5％的稠油中生长繁殖，降解7天后的原油脱水，气相-质谱对降解后的芳香烃分析后得出，该菌株能够降解原油中的萘系列(芳香烃中相对含量从3.82％到3.3％)，菲系列(芳香烃中相对含量从4.16％到3.72％)，噻吩系列(芳香烃中相对含量从1.43％到0.45％)，芴系列(芳香烃中相对含量从0.98％到0.65％)，屈系列(芳香烃中相对含量从6.51％到5.67％)。说明该菌株能够降解石油污染环境中的多环芳烃。因此该菌株在油田开发和生物修复方面具有良好的应用前景。
附图说明
图1是氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)吉2CGMCC No.9072菌与吉5、吉8、吉11的稠油乳状液稳定系数分析实验结果。
图2是氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)吉2CGMCC No.9072的16S rRNA序列。
图3是氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)吉2CGMCC No.9072对萘和芘为唯一碳源的降解率和生长曲线实验结果。
图4是氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)吉2CGMCC No.9072对萘、菲、蒽和芘的混合多环芳烃为唯一碳源的降解率实验结果。
图5是氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)吉2CGMCC No.9072菌降解稠油的傅里叶红外光谱实验结果。
图6是氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)吉2CGMCC No.9072菌降解稠油的四组分分析实验结果。
图7是氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)吉2CGMCC No.9072菌乳化原油颗粒的显微观察实验结果。
图8是氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)吉2CGMCC No.9072菌乳化原油的50个颗粒统计实验结果。
图9是氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)吉2CGMCC No.9072菌乳化原油的稳定性实验结果。
用于专利程序的微生物保存：
保藏日期：2014年4月18日
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；
保藏编号：CGMCC No.9072；
分类命名：氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步详细说明本发明的氧化微杆菌(Microbacteriumoxydans)吉2及特点和应用中所具有的技术效果，但本发明并不因此而受到任何限制。
实施例1：本发明提供的氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)吉2菌株的筛选和育种
取中原油田采出水水样，振荡均匀后用移液管取10ml，无菌接种至100ml无机盐基础培养基中(培养基组成g/L：稠油5，K2HPO41，KH2PO41，NaNO34，MgSO40.5，(NH4)2SO42，酵母粉0.2，蒸馏水，1000ml，pH7.2，121℃灭菌30min，35℃摇床往复振荡培养7天。将富集的摇瓶用无菌水进行稀释，稀释到10-5、10-6、10-7，涂布到新王氏+液蜡和LB平板上，35℃培养2d，挑选菌落形态和大小不同的菌株。观察生长出的菌落。挑取单菌落并用显微镜检验其纯度。将35℃下生长的各个菌落，接种至营养肉汤培养基中，培养至OD600为0.8左右，作为种子液以10％(v/v)比例接入100ml无机盐稠油培养基中，35℃摇床往复振荡培养7d。然后以此发酵液作为种子液，接种至新鲜的无机盐稠油培养基，反复该步骤3～4次。最终得到乳化稠油效果较好的菌株13株，其中有代表性的菌株为吉2、吉5、吉8、吉11，经16S rRNA基因鉴定，吉2属于氧化微杆菌，吉5属于芽孢杆属，吉8属于微小杆菌属，吉11属于假单胞菌属，乳化实验比较和对比，这四种菌均能够使原油乳化分散在体系中，但是氧化微杆菌(Microbacteriumoxydans)吉2具有突出的乳化原油稳定效果，图1显示了利用乳化稳定分析仪分析的这四株菌的稠油乳状液的稳定系数分析结果，其中，稳定系数越小，说明乳状液稳定性越强。
实施例2：本发明提供的氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)吉2菌株的形态特征和生理生化特征
参照《Bergey’s Mannual of Systematic Bacteriology》(Vol.Ⅷ)的实验方法进行，检测本发明的吉2菌落形态，革兰氏染色，菌体大小和形态，有无鞭毛和芽孢，生长温度，生长pH范围，NaCl耐受性。触酶，V-P，小鼠急性经口，酪朊水解，明胶水解，淀粉水解，硝酸盐还原到亚硝酸盐，纤维素水解，葡萄糖产气，酪氨酸水解，苯丙氨酸脱氢酶，卵黄卵磷脂酶，NaCl和KCl需求，尿囊素和尿素盐需求，氧化酶，溶菌酶抗性，D-葡萄糖，L-阿拉伯糖，D-木糖，D-甘露醇产酸，柠檬酸盐和丙酸盐需求等实验。
结果表明，该菌株菌落不透明，有光泽，黄色，较小，光滑，边缘规整，凸起革兰氏染色阳性，菌体呈细长，不规则的杆状，有1～3根鞭毛，能运动，好氧生长，也能弱厌氧生长，培养1天以上不产生芽孢，细胞大小1.0～4.0μm(长)×0.4～0.8μm(宽)，大多数菌体呈单个或成对，有的排列成直角或V字形。生长温度10～40℃，最适28～34℃，生长pH范围5-12，NaCl耐受性0～7％。接触酶实验、运动性实验、革兰氏染色、V-P实验、氧化酶抗性实验、淀粉水解、硝酸盐还原到亚硝酸盐实验均为阳性，葡萄糖产气实验、酪氨酸水解、苯丙氨酸脱氢酶实验、NaCl和KCl需求实验、尿囊素和尿素盐需求实验、溶菌酶抗性实验、H2S产气实验皆为阴性，能够利用D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-甘露醇产酸，不能利用D-木糖产酸，能利用柠檬酸盐和丙酸盐。
实施例3：本发明提供氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)吉2菌株的16S rRNA基因的PCR扩增和序列测定
将本发明的吉2菌株接种于LB培养基，35℃摇床培养(120rpm)24h，离心收集菌体，重新悬浮，加溶菌酶和SDS破壁，由酚-氯仿法提取基因组DNA，并采用正相引物8F(5’-AGAGTT TGA TCC TGG CTC AG-3’，SEQ ID No.2)和反向引物1541R(5’-AAGGAGGTGATCCA GCC-3’，SEQ ID No.3)，用这对引物对其16SrDNA基因进行PCR扩增，将扩增引物送上海美集公司进行测序。PCR条件为：94℃，10min；94℃，45s，55℃，45s，72℃90s，30个循环；72℃10min，4℃保存。16S rDNA基因序列长度为1563bp(SEQ ID No.1)，在GenBank中的登录号为KJ627769，与Microbacterium oxydans的16S rDNA(登录号为AB365061.1)序列相似性为99％。鉴定本发明的吉2为氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)。该菌株已于2014年4月18日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”(CGMCC)(保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，其保藏日期2014年4月18日；保藏号CGMCC No.9072；分类命名：氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)。
实施例4：本发明提供的氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)吉2菌株对原油的降粘和胶质的降解实验
将菌株吉2在LB斜面上35℃划线培养，24h后用无菌水将菌体洗下，将菌浓为106cfu/mL的菌液作为种子液接入100mL以2％稠油或稀油分别为唯一碳源的无机盐培养基(K2HPO41g/L、KH2PO41g/L、NaNO34g/L、MgSO40.5g/L、(NH4)2SO42g/L、酵母粉0.2g/L，pH 7.2)中，35℃振荡培养(120rpm)7d。培养结束后，利用平板计数法测定了发酵液的菌浓，结果表明发酵液中的吉2菌浓达到108cfu/mL；转移摇瓶内的所有原油和培养基到预先称重的250mL离心杯中，8000rpm离心10min，除去培养基和菌体。80℃温箱烘干到恒重，称重，计算离心杯的重量变化。培养体系中对稠油的代谢速率达到0.134g/d(表2)；对稀油的代谢速率达到0.153g/d(表2)，菌株吉2可以产生一定量的表面活性剂，使稠原油发生乳化降粘。其对稠油综合降粘率(降解降粘率+乳化降粘率)为64.3％(表2)，对稀油综合降粘率(降解降粘率+乳化降粘率)为70.5％(表2)。
表2菌株吉2的降粘能力
实施例5：本发明提供的氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)吉2菌株在多环芳烃萘、芘为唯一碳源下的生长和降解实验
将菌株吉2在LB斜面上35℃划线培养，24h后用无菌水将菌体洗下，将菌浓为106cfu/mL的菌液作为种子液分别接入100mL浓度为500mg/L的萘或芘的单一多环芳烃为唯一碳源的无机盐培养基(K2HPO41g/L、KH2PO41g/L、NaNO34g/L、MgSO40.5g/L、(NH4)2SO42g/L、酵母粉0.2g/L，pH 7.2)中，35℃振荡培养(120rpm)14d。培养结束后，用分光光度计测量该菌在此体系中的OD600吸光度，用GC-FID测定多环芳烃的剩余量并计算降解率。吸光度和降解率如图3所示。
实施例6：本发明提供的氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)吉2菌株在多环芳烃萘、菲、蒽、芘混合多环芳烃中的降解实验
将菌株吉2在LB斜面上35℃划线培养，24h后用无菌水将菌体洗下，将菌浓为106cfu/mL的菌液作为种子液分别接入100mL浓度为500mg/L的萘、菲、蒽和芘的混合多环芳烃为唯一碳源的无机盐培养基(K2HPO41g/L、KH2PO41g/L、NaNO34g/L、MgSO40.5g/L、(NH4)2SO42g/L、酵母粉0.2g/L，pH 7.2)中，35℃振荡培养(120rpm)7d。培养结束后，测定混合多环芳烃的含量并计算降解率，该实验做3个平行。降解率如表3所示。
表3氧化微杆菌吉2对萘、菲、蒽、芘混合多环芳烃的降解率
实施例7：本发明提供的氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)吉2菌株对原油中的芳香烃降解后的气相-质谱分析
将菌株吉2在LB斜面上35℃划线培养，24h后用无菌水将菌体洗下，将菌浓为106cfu/mL的菌液作为种子液分别接入100mL含2％原油的无机盐培养基(K2HPO40.8g/L、KH2PO40.8g/L、NaNO33g/L、MgSO40.4g/L、(NH4)2SO41.5g/L、酵母粉0.3g/L，pH 7.0)中，35℃振荡培养(120rpm)7d。培养后将原油离心去除培养基，电解脱水，将降解后的原油按照四组分分析分成饱和烃，芳香烃，胶质和沥青质，将芳香烃用气相-质谱分析其中的芳香烃组分并定量。其芳香烃的降解结果如图4所示(对照为吉8)。
实施例8：本发明提供的氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)吉2菌株发酵液对柴油的乳化
乳化指数的测定方法如下：取带刻度试管，加入柴油5ml，再加入5ml的吉2发酵液，剧烈振荡1分钟，室温静置24小时后测量，以乳化层的高度除以有机相的总高度，再乘100％，即EI24，如果EI24>50％，则认为该乳状液是稳定的。
氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)吉2菌株在以蔗糖为碳源的培养基(培养基组成g/L：蔗糖20，K2HPO41，KH2PO41，NaNO34，MgSO40.5，(NH4)2SO42，酵母粉0.2，蒸馏水，1000ml，pH7.2，121℃灭菌30min)中生长，35℃振荡培养3天，用其发酵液对0号柴油进行乳化活性分析，分析结果表明，以蔗糖为碳源生长，本发明的菌株吉2发酵液能很好的乳化柴油，EI24为100％。而作为对照的以蔗糖为碳源的原始培养基，EI24仅为2％左右，基本看不到乳化层。
实施例9：本发明提供的氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)吉2菌株对原油的降解实验
菌株吉2对稠油和稀油都有很好的降解及降粘作用，将微生物作用前后的原油脱水，用溴化钾压片，采用美国的Nicolet-560E.S.P红外光谱仪扫描，扫描波长为4000～400cm-1。傅立叶红外光谱测定(IR)分析结果见图5，结果表明，微生物作用后的原油在2800～3000cm-1之间的吸收峰明显减小，在700～1800cm-1之间出现了很多新的吸收峰，表明微生物降解胶质后产生了许多新的官能基团，此时稠油中大分子烃(芳香烃和胶质)的相对含量降低，原油粘度下降，流动性增加。
对菌株吉2对稠油和稀油降解前后的饱和烃、芳香烃、胶质、沥青质四组分含量进行分析，分析结果见图6，可以看出：微生物降解后原油的化学组分发生了一定程度的变化，饱和烃相对含量有所上升，而芳香烃和胶质相对含量降低了5.4％。
实施例10：本发明提供的氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)吉2菌株需氧性实验
将吉2菌株进行半固体培养基穿刺培养，35℃恒温下放置24h后，观察其生长情况。结果表明，在半固体斜面中靠近顶部生长较为旺盛，底部也有所生长，表明其具有兼性厌氧生长的特性，可以在低氧的环境中生长，具备微生物采油的潜在应用价值。
实施例11：本发明提供氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)吉2菌株稠油乳化颗粒的测量实验
将吉2乳化稠油的乳状液100ml(吉2种子液接种至100ml含稠油的无机盐基础培养基中，培养基组成g/L：稠油5，K2HPO41，KH2PO41，NaNO34，MgSO40.5，(NH4)2SO42，酵母粉0.2，蒸馏水，1000ml，pH7.2，121℃灭菌30min，35℃摇床往复振荡培养7天)，移至分液管中(总高度为46cm)静置48h，可以将乳状液大致分为未完全乳化层原油层，乳化层原油层，水层，测量各层的高度，测量结果如表4所示，取其中的乳化层在显微镜下观察，显微观察乳化颗粒如图7所示，随机测量其中50个原油乳化颗粒的直径，可以得出乳化颗粒直径分布在15μm～150μm之间。50个乳化颗粒直接统计分布区间如图8所示，可以看出乳化颗粒直径在50μm～70μm范围内的最多。而且颗粒直径越大，数量越少。说明本发明的菌株吉2能很好的乳化稠油。
表4乳状液分层高度测量表
分层种类 未完全乳化层原油层 乳化层原油层 水层
高度(cm) 3.8 0.3 41.9
实施例12：本发明提供氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)吉2菌株乳化稠油乳状液稳定性分析实验
利用全能近红外线稳定分析仪对摇瓶中微生物乳化后的油水体系(吉2菌株在以蔗糖为碳源的培养基中生长，35℃振荡发酵培养5天，用其发酵液对原油进行乳化)进行乳化分析。扫描程序为0～60min,每1分钟扫描一次，60～180分钟，每5分钟扫描一次。根据全能近红外线稳定分析仪扫描结果得到微生物乳化原油的稳定系数。吉2乳化原油的稳定性很强，静置48小时也不能完全使乳状液完全分层，根据全能近红外线稳定分析仪扫描结果(如图9)得到微生物乳化原油的稳定系数为1.18。说明吉2乳化原油后乳状液具有一定的稳定性。
实施例13：本发明提供氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)吉2菌株与铜绿假单胞菌Q11(ATCC27853)物理模拟驱油实验
利用胶结岩心模拟油藏条件，岩心分为均质岩心和两层非均质岩心，参数如下表5和表6，温度为35℃，,压力为7MPa，驱替速度为1.0mL/min。
表5岩心的参数
孔隙度(％) 长*宽*高(cm3) 渗透率(10-3μm2)
23.7 30.0×4.5×4.5 800
表6非均质岩心参数
实验步骤：
①装填岩心,抽真空2h后饱和地层水；
②测定岩心孔隙度、渗透率；
③用粘度为30mPa·s的原油饱和岩心,出口设背压阀,加压至7MPa并全程保持，计算含油饱和度，老化岩心3d；
④一次水驱,注地层水至待产出液含水率达到现场含水率98％，
⑤注入0.6PV复配菌株(V吉2:VQ11＝1:1)，空白岩心注入0.6PV地层水，55℃恒温下放置7d；
⑥二次水驱,注地层水至待产出液含水率达98％，计算驱油效率。
实验结果如表7所示。
表7微生物物理模拟驱油结果
上述物理模拟驱油结果表明，菌株吉2发酵液能大幅地提高原油采收率。在物理模拟驱油实验中，相比于单独使用铜绿假单胞菌Q11，本发明的复配菌株(吉2的无机盐发酵液与Q11菌液按1：1复配)使均质岩心的稠油油藏原油的采收率继续提高12.3％，非均质岩心采收率继续提高15.6％。

Claims (11)

1.保藏编号为CGMCC No.9072的氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)或包含有保藏编号为CGMCC No.9072的氧化微杆菌的氧化微杆菌制剂在发酵培养生产用于乳化油品的乳化剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，包含有保藏编号为CGMCC No.9072的氧化微杆菌的氧化微杆菌制剂为固态或者液态菌制剂。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其中，是将所述的氧化微杆菌或所述的氧化微杆菌制剂在营养培养基中发酵培养，所得发酵液直接作为油品乳化剂，或从发酵液中分离提取含有表面活性剂的组分作为油品乳化剂。
4.根据权利要求3所述的应用，其中，所述营养培养基为普通肉汤培养基、LB培养基、营养琼脂培养基、或包括碳源的无机盐培养基。
5.根据权利要求4所述的应用，其中，所述碳源包括葡萄糖、蔗糖、原油、多环芳烃中的一种或多种。
6.保藏编号为CGMCC No.9072的氧化微杆菌或包含有保藏编号为CGMCC No.9072的氧化微杆菌的氧化微杆菌制剂在降解多环芳烃中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其中，将所述的氧化微杆菌或所述的氧化微杆菌制剂与待降解的多环芳烃混合，使氧化微杆菌在混合体系中培养生长，从而降解多环芳烃。
8.根据权利要求7所述的应用，其中，还向混合体系中加入氧化微杆菌培养基以促进氧化微杆菌的生长，所述培养基为普通肉汤培养基、LB培养基、营养琼脂培养基、或无机盐培养基。
9.保藏编号为CGMCC No.9072的氧化微杆菌或包含有保藏编号为CGMCC No.9072的氧化微杆菌的氧化微杆菌制剂在驱油中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其中，是将所述的氧化微杆菌或所述的氧化微杆菌制剂在营养培养基中发酵培养，所得发酵液用于驱油以提高原油采收率；或者，将所得发酵液与含有铜绿假单胞菌的菌液复配后用于驱油。
11.根据权利要求10所述的应用，其中，所述营养培养基为普通肉汤培养基、LB培养基、营养琼脂培养基、或包括碳源的无机盐培养基；所述碳源包括葡萄糖、蔗糖、原油、多环芳烃中的一种或多种。
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