CN101173233A - 嗜热地芽孢杆菌dm-2产生的生物乳化剂及制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
嗜热地芽孢杆菌DM－2产生的生物乳化剂及制备方法和应用。本发明涉及的地芽孢杆菌Geobacillus.sp DM－2保藏号CGMCC No.1565菌株，以糖为碳源在50～70℃高温条件进行培养时，可产生一种新型的糖蛋白类的生物乳化剂；该乳化剂对柴油，煤油，原油和芳香族化合物都具有很好的乳化效果，能够提高烷烃和原油在水中的溶解度，明显促进活性菌株对烷烃和原油的降解，可以应用在提高石油采收率技术中。
Description
【技术领域】本发明属于能源生物技术和环境生物技术领域，具体地说，它涉及一株嗜热地芽孢杆菌(Geobacillus.sp)DM-2菌株产生的生物乳化剂，及其在提高石油采收率中的应用。
【背景技术】当前，随着石油资源的日益短缺和勘探费用的不断增加，单纯注水的二次采油技术由于效率较低(水驱后几乎有60～70％的原油仍残留在油藏中)，已逐渐不能满足人们对石油资源有增无减的需求。近年来，以微生物提高原油采油率(MicrobialEnhanced Oil Recovery，MEOR)技术为代表的三次采油方法正逐渐受到广泛重视。该技术利用微生物的有益活动及代谢产物来提高原油采收率，是继热力驱、化学驱、聚合物驱等传统“三采”方法之后的一项综合性技术。
在微生物降解原油的实验中经常会遇到一种现象，就是乳化效果特别好的实验组其油水界面张力并不显著降低。基于此类现象，我们有两个概念必须加以澄清，就是生物表面活性剂和生物乳化剂的区别。在广义上生物乳化剂属于生物表面活性剂，但在狭义上它们是按照各自的功能区分的。生物表面活性剂(如糖脂、磷脂、脂肽、脂肪酸、短肽等)是一些低分子量的小分子，它们能显著降低空气一水或油一水界面的张力，从而有助于油水乳化，但形成的乳状液往往不能稳定存在。生物乳化剂是一些生物大分子，如多糖蛋白、脂多糖、或这些聚合物的混合物等，它们虽不能显著降低表面张力，但对油水界面表现出很强的亲和力，能够吸附在分散的油滴表面，防止油滴凝聚，从而使这种乳状液得以稳定，这种效应使得烷烃呈胶状分散，增加了烷烃与细胞的接触。因此生物乳化剂的主要作用是乳化原油，降低原油粘度，更重要的是提高微生物对烃的降解效率。
生物乳化剂具可降解、对环境无污染、安全无毒、价格低廉、高乳化活性等优点，可广泛应用于食品、药品、工业和农业等领域。目前最常见的生物乳化剂是两亲脂多糖类聚合物或蛋白因子，分子量较大(从5kD～100kD)，它们一般不会使油水界面张力降得很低，但很适合于作乳状液的稳定剂，特别是对原油的乳化和粘度降低的性能要比生物表面活性剂好的多。生物乳化剂的研究开始于本世纪六十年代，目前所知多种微生物可产乳化剂，乳化剂种类很多，但对乳化剂的结构和理化性质知之甚少，尤其是兼性厌氧嗜热菌产生的乳化剂还未见报道；生物乳化剂具有对烃良好的乳化性能和促进烃降解的特性，但是直到现在生物乳化剂的合成机制尚不清楚，因此有必要进一步研究，这对于充实微生物采油和生物修复技术的机理具有重要的理论价值。加快国内微生物采油技术的发展，符合我国石油工业发展的需要，有利于实现“稳定东部、发展西部”的战略决策。对能以烷烃为碳源的嗜热菌的烷烃降解特性及其产生的生物乳化剂进行研究，使其适用于高温油田而提高石油采收率具有很好的发展前景。
【发明内容】本发明的目的在于针对石油资源的日益短缺和勘探费用不断增加的问题，提供一种地芽孢杆菌(Geobacillus.sp)DM-2产生的新型糖蛋白类生物乳化剂，以便提高烷烃和原油在水中的溶解度，促进活性菌株对烷烃和原油的作用。
本发明涉及的地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)DM-2菌株，于2005年12月14日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”(北京市海淀区中关村北一条13号，中科院微生物研究所)，其保藏号为CGMCC No.1565。
上述地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)DM-2菌株，是经紫外照射诱变，挑选乳化原油最快的转化子，并以液蜡为唯一碳源的情况下在70℃反复驯化培养十代而获得。
地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)DM-2 CGMCC No.1565可以在营养培养基，如：普通牛肉汁、LB、营养琼脂中生长，也可以在添加葡萄糖或蔗糖的无机盐培养基中生长，也可以以烷烃或原油为碳源生长。菌株在50～70℃之间的一适宜温度下兼性厌氧生长。
地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)DM-2 CGMCC No.1565产生的生物乳化剂含有蛋白质和多糖，不含脂类；多糖组分仅有一种葡萄糖组成，蛋白组分由赖氨酸，丙氨酸，缬氨酸，甲硫氨酸和甘氨酸五种氨基酸组成。该生物乳化剂能很好的乳化柴油、煤油、正烷烃、原油和芳香族化合物。
上述生物乳化剂的制备方法，是在培养嗜热地芽孢杆菌Geobacillus sp.DM-2的过程中，向无机盐培养基中添加碳水化合物，即淀粉、乳糖、蔗糖或葡萄糖为碳源，其培养基组成如下g/L：K2HPO4·3H2O 4.8；KH2PO4 1.5；(NH4)2SO4 1；柠檬酸三钠0.5；MgSO4·7H2O 0.2；葡萄糖 2；酵母提取物 0.1；CaCl2·2H2O 0.002；MnCl2·4H2O0.0004；NiCl2·6H2O 0.0004；ZnSO4·7H2O 0.0004；FeCl3·6H2O 0.0002；NaMoO4·2H2O0.0002；培养条件50～70℃，优选60℃-65℃，pH 6～8，培养24～48小时，以丙酮沉淀透析法和酸沉法分离乳化剂，最后得到生物乳化剂。
生物乳化剂的具体分离提取方法是，将上述的培养发酵液8000rpm 4℃离心除去菌体后，加入3倍体积冰冷丙酮或者工业酒精，用玻璃棒搅拌均匀，置于4℃过夜，离心得沉淀，用2000ml ddH2O 4℃透析，然后冷冻干燥，得乳化活性物质。
CGMCC No.1565菌所产生的生物乳化剂做Molish反应判定糖类，用Bradford比色法测定蛋白，油红O染色测定脂类，实验表明该乳化剂含有蛋白质和多糖，不含脂类，如图4和图5所示。
生物乳化剂糖组分分析方法是，取该物质5mg加入2M H2SO4中，沸水浴10h以上，用BaCO3中和H2SO4，离心除去沉淀，得水解后样品与单糖标准品在新华1号滤纸上经正丁醇∶冰乙酸∶水＝4∶1∶5的展开剂展开，9h后风干，喷显色剂苯胺-磷酸盐溶液(a∶b＝2∶3；a＝苯胺∶水∶冰乙酸∶磷酸＝2∶20∶18∶1；b＝丙酮)；再风干后，于100℃显色2-5min，计算样品与标准品的Rf值。
生物乳化剂氨基酸组分分析方法是，取该物质1mg加入6N HCl中，110℃水解24h以上，将HCl蒸干后，溶于双蒸水中，得水解后样品与氨基酸标准品在新华1号滤纸上经正戊醇∶吡啶∶水＝35∶35∶30的展开剂展开，9h后风干，用10％茚三酮100℃显色10min，计算样品与标准品的Rf值。
CGMCC No.1565菌所产生的生物乳化剂有明显的乳化能力，根据文献中报道的乳化能力测定方法，以柴油为乳化对象，乳化剂与柴油以7∶3体积比混合，剧烈震荡1min，静置24h，乳化指数(Emusification index，EI-24)用乳化层的高度与测试烃的总高度之比，乘以100％来计算。如果EI-24大于等于50％，则说明乳状液是稳定的。结果表明该乳化剂对二甲苯，甲苯，煤油和原油等都有很好的乳化作用，如表2所示。
CGMCC No.1565菌所产生的生物乳化剂有明显的促使原油的降粘和降凝，并使原油的降解率提高。以产生生物乳化剂的发酵液作为种子液，与以烷烃培养的种子液相比，前者对原油的降粘和降凝作用更显著，并可促进原油的降解，如表3所示。
本发明的优点和积极效果：
本发明涉及的一种地芽孢杆菌Geobacillus sp.DM-2 CGMCC No.1565菌株，以糖为碳源在50～70℃高温条件进行培养时，可产生一种新型的糖蛋白类的生物乳化剂；该乳化剂对柴油，煤油，原油和芳香族化合物都具有很好的乳化效果，能够提高烷烃和原油在水中的溶解度，明显促进活性菌株对烷烃和原油的降解，该生物乳化剂用于微生物采油试验，产油有效期可达80天，共增产原油239吨，因此可用于提高石油采收率。
【附图说明】：
图1是Geobacillus sp.DM-2 CGMCC No.1565菌生长过程中发酵液表面张力，乳化指数和菌体量随时间的变化曲线；
图2是Geobacillus sp.DM-2 CGMCC No.1565菌产生物乳化剂的发酵液对柴油的乳化作用；
图3-1是Geobacillus sp.DM-2 CGMCC No.1565菌产生的生物乳化剂不同浓度对柴油的乳化效果；
图3-2是Geobacillus sp.DM-2 CGMCC No.1565菌产生的生物乳化剂对柴油形成的乳状液在不同温度下的稳定性；
图3-3是Geobacillus sp.DM-2 CGMCC No.1565菌产生的生物乳化剂对NaCl的耐受能力；
图4是Geobacillus sp.DM-2 CGMCC No.1565菌产生的生物乳化剂糖组分分析；
图5是Geobacillus sp.DM-2 CGMCC No.1565菌产生的生物乳化剂氨基酸组分分析；
图6是生物乳化剂注入试验1号井后产量变化曲线。
【具体实施方式】
实施例1：
生物乳化剂的产生。
本发明提供的CGMCC No.1565菌能以碳水化合物为碳源(如蔗糖、葡萄糖等)的无机盐培养基中发酵培养生产生物乳化剂，以葡萄糖为碳源时，通过优化培养基组分、培养条件(通氧量，发酵周期等)，等试验获得该Geobacillus sp.DM-2菌株产生生物乳化剂的最佳培养基为(g/L)K2HPO4·3H2O 4.8；KH2PO4 1.5；(NH4)2SO4 1；柠檬酸三钠0.5；MgSO4·7H2O 0.2；葡萄糖2；酵母提取物0.1；CaCl2·2H2O 0.002；MnCl2·4H2O 0.0004；NiCl2·6H2O 0.0004；ZnSO4·7H2O 0.0004；FeCl3·6H2O 0.0002；NaMoO4·2H2O 0.0002；蒸馏水，1000ml。最佳培养条件为：初始pH 7.2。121℃灭菌30min，在50～70℃条件下，130rpm振荡培养48h，经山东省科学院生物研究所研制的SBA-40C型生物传感分析仪测定残糖为零，此时产生生物乳化剂效果最好，发酵液乳化能力为100％，24h后乳状液稳定，如图2所示，并可稳定7d以上。
实施例2：
生物乳化剂的分离提取。
Geobacillus sp.DM-2菌株在产生生物乳化剂的培养基和条件下(同实施例1)培养发酵，发酵液8000rpm 4℃离心除去菌体后，加入3倍体积冰冷丙酮或者工业酒精，用玻璃棒搅拌均匀，置于4℃过夜，离心得沉淀，将沉淀透析后冷冻干燥，得乳化活性物质，将在EM培养基中的发酵产物，4℃条件下，10000rpm 4℃离心收集沉淀，将沉淀用ddH2O重悬，用2000ml ddH2O 4℃透析，然后冷冻干燥，得乳化活性物质，该物质溶于双蒸水后对柴油的乳化能力为100％。在光学显微镜下观察乳化液滴的大小，随即测量20个液滴，计算乳化液滴的平均大小，如表1所示，提取的乳化活性物质对柴油作用后，产生的乳化液滴约为发酵液作用的1/3。
表1
| 样品 | 乳化液滴大小(μm) |
| 发酵液乳化活性物质 | 18.377.25 |
实施例3：
生物乳化剂对不同链长烷烃的乳化能力。
Geobacillus sp.DM-2菌株产生生物乳化剂的发酵周期(同实施例1)。在发酵过程中，每隔两个小时取样，测量样品在630nm的紫外吸收值，pH值，表面张力以及发酵液对柴油的乳化能力。表面张力用上海中晨数字技术设备有限公司的全自动界面张力仪，乳化能力测量方法按照文献报道，以各种烃(二甲苯，甲苯，煤油，柴油，原油)为乳化对象，乳化剂与测试烃以7∶3体积比混合，剧烈震荡1min，静置24h，乳化指数(Emusificationindex，EI-24)用乳化层的高度与测试烃的总高度之比，乘以100％来计算。如果EI-24大于等于50％，则说明乳状液是稳定的。如图1所示，在菌株生长到11h时，EI-24的值已达到100％，菌体浓度也最大，随着发酵时间延长，由于菌体在产生的胞外物质作用下聚集，致使OD630的值越来越不准确，呈逐渐减小趋势，但是EI-24值已稳定不变；在发酵过程中，发酵液的表面张力逐渐降低，到后期稳定，由初始的67.9mN/m降至50.28mN/m；在整个发酵过程中，pH几乎不变。将发酵液(F)以及离心去菌体的发酵液(f)，测量对二甲苯，甲苯，煤油，柴油，原油的乳化能力。如表2所示。
表2
实施例4：
生物乳化剂的理化性质。
Geobacillus sp.DM-2菌株产生物乳化剂(同实施例3)，将该乳化剂溶于双蒸水中测试不同浓度该乳化剂对柴油的乳化，以及该乳化剂在不同NaCl浓度和pH下对柴油的乳化能力以及对柴油形成的乳状液在不同温度下的稳定性。在不同pH条件下，该乳化剂对柴油的乳化能力均为100％；如图3-1至图3-3所示，当乳化剂浓度为1g/L时，对柴油的乳化能力可达100％，所以在后续试验中均采用该浓度；形成的乳状液在不同温度下测试稳定性，发现在100℃水浴中过夜，仍保持有63.6％的乳化层；该乳化剂可耐受的NaCl浓度为25％，比已报道乳化剂耐受NaCl浓度都要高，更适合于高矿化度的油藏进行驱油。将该乳化活性物质溶于双蒸水中，置于121℃高压作用30min后，对柴油仍有100％的乳化活性。
实施例5：
生物乳化剂的化学组成。
Geobacillus sp.DM-2菌株产生的生物乳化剂(同实施例3)进行Molish反应判定糖类，用Bradford比色法测定蛋白和油红O染色，实验表明该乳化剂含有蛋白质和多糖，不含脂类。进一步用纸层析法分析该生物乳化剂的组分，糖组分分析：取该物质5mg加入2MH2SO4中，沸水浴10h以上，用BaCO3中和H2SO4，离心除去沉淀，得样品点在新华1号滤纸上，经正丁醇∶冰乙酸∶水＝4∶1∶5的展开剂展开，9h后风干，喷显色剂苯胺-磷酸盐溶液(＝a∶b＝2∶3；a＝苯胺∶水∶冰乙酸∶磷酸＝2∶20∶18∶1；b＝丙酮)；再风干后，于100℃显色2-5min；氨基酸组分分析：取该物质1mg加入6N HCl中，110℃水解24h以上，将HCl蒸干后，溶于双蒸水中，点在新华1号滤纸上，经正戊醇∶吡啶∶水＝35∶35∶30，9h后风干，用10％茚三酮100℃显色10min。分别计算Rf值，结果表明，如图4和5所示，样品1和2分别是丙酮沉淀和工业酒精沉淀所得，实验结果表明，本发明提供的Geobacillus sp.DM-2菌株所产生的生物乳化剂由多糖和蛋白组成，是一种糖蛋白复合物。多糖组分仅有一种葡萄糖组成，蛋白组分由赖氨酸，丙氨酸，缬氨酸，甲硫氨酸和甘氨酸五种氨基酸组成。
实施例6：
生物乳化剂对原油降解率的促进和对原油降粘降凝的促进作用。
将Geobacillus sp.DM-2菌株在产生物乳化剂的培养基和条件下(同实施例1)培养发酵，作为种子液(S)接入降解培养基(同实施例1)和降粘，降凝培养基(培养基组成：KH2PO4，0.3g；Na2HPO4·12H2O，1.25g，NH4C1，2.0g；酵母粉，0.5g；原油，300g；地层水，1000ml)，60℃振荡培养7天，将作用后的原油脱水，用NDJ-79型旋转式粘度计测量原油的粘度，参照GB/T 510测定原油凝点，采用红外测油仪测量原油降解率。与将Geobacillus sp.DM-2菌株在烷烃里培养发酵的发酵液作为种子(P)进行比较，结果如表3所示。采用产乳化剂的培养基发酵菌株做为种子液，对原油的降粘率可达67.78％，降解率为50.18％，把原油的凝固点由19.5℃降至10℃，这种种子液远远优于用烷烃发酵菌株所得的种子液，由于蔗糖比烷烃便宜的多，在矿场试验中前者种子液可大大节约经费。
表3
| 粘度(mPa·s) | 降粘率(％) | 残留原油(mg/L) | 降解率％ | 凝固点℃ | 降凝率％ | |
| 对照PS | 9057.529 | 36.11％67.78％ | 22.7615.7111.34 | 30.98％50.18％ | 19.512.510 | 35.90％48.72％ |
实施例7：
生物乳化剂对稠油(试验1号井原油)的降粘作用
将离心分离后的发酵液上清液(原液)、在121℃处理30分钟的上清液、絮凝沉淀去除活性成分的上清液分别与等体积的试验1号井的稠油混合，在50℃、70℃、100℃水浴摇床上振荡24小时，将原油脱水，于50℃下测定原油粘度结果见表6。
从表4可以看出，上清液(原液)含有生物乳化剂，对该高胶质沥青质原油有一定的降粘作用，处理温度对降粘效果影响不大；絮凝沉淀去除了活性成分(生物表面活性剂)的上清液，对原油的降粘作用变得很小甚至完全没有降粘作用；在121℃热处理30分钟的上清液，对原油的降粘作用大大加强，这表明该生物乳化剂具有极强的耐高温性能。
表4生物乳化剂在不同温度下对试验1号井原油的降粘作用
| 上清液 | 50℃处理24h | 50℃处理24h | 50℃处理24h | |||
| 粘度 | 降粘率 | 粘度 | 降粘率 | 粘度 | 降粘率 | |
| mPa.s | ％ | mPa.s | ％ | mPa.s | ％ | |
| 空白原液热处理液去活液 | 150010279671587 | 31.535.55.8 | 154011069231450 | 28.240.15.8 | 154010909501320 | 29.238.314.3 |
实施例8：
生物乳化剂的浓度和处理时间对稠油(试验1号井原油)和高含蜡、高含胶质沥青质原油的(试验2号井原油)降粘作用
将稀释成不同生物乳化剂浓度的发酵液上清液分别与等体积的试验1号井原油(稠油)和试验2号井原油(高含蜡、高含胶质沥青质原油)混合，在不同温度的水浴摇床上振荡24h、48h、72h，将原油脱水，于50℃下测定原油粘度，结果列于表5。
表5表明，生物乳化剂可使高胶质沥青质原油特别是稠油粘度下降，在同一处理温度下不同浓度表面活性剂溶液的降粘率相差很大，最高可达50％左右；处理时间超过24h以后降粘率的变化已不显著。另外，从摇瓶的外观看，加入该生物表面活性剂的原油对瓶壁的脱附能力及溶解性增强，在镜检时可观察到形成水包油乳状液。这些特性有利于原油的增采和输送。
表5不同生物乳化剂在不同温度与两种原油作用不同时间的降粘效果
| 原油 | 处理温度℃ | 乳化剂浓度％ | 处理24h | 处理48h | 处理72h | |||
| 粘度/mPa.s | 降粘率/％ | 粘度/mPa.s | 降粘率/％ | 粘度/mPa.s | 降粘率/％ | |||
| 试验1号井*试验2号井** | 701005070 | 0.010.030.060.090.120.150.010.030.060.090.120.150.010.030.060.090.120.150.010.030.060.090.120.15 | 14701315125010701253125914501520109012701250107569.066.564.259.560.461.571.168.966.671.071.169.9 | 7.016.820.932.320.720.38.23.831.019.620.932.003.66.913.812.510.91.34.35.41.42.63.0 | 13808847667407797831390132710901188114598768.464.055.157.255.056.067.062.555.558.260.461.0 | 12.744.151.553.250.750.412.016.031.024.827.537.50.87.220.117.120.318.86.913.222.919.216.115.3 | 13908907608297807821400133710801088117298067.366.857.455.654.257.067.460.955.058.059.660.5 | 12.043.751.947.550.650.511.415.431.631.125.838.02.43.216.819.421.417.46.415.423.619.417.216.0 |
*试验1号井原油含蜡14.7％，含胶质沥青质27.89％，原始粘度1580mPa.s，粘度均在50℃用NDJ-79型旋转粘度计2号转子在750r/min下测定。
**试验2号井原油含蜡24.5％，含胶质沥青质24.84％，原始粘度69.0mPa.s(处理温度50℃实验组)和72.0mPa.s(处理温度70℃实验组)，粘度均在50℃用NDJ-79型旋转粘度计1号转子在750r/min下测定。
实施例9：
生物乳化剂对原油分散性及凝固点的影响
按实施例8所述处理方法将发酵液上清液与试验1号井、试验2号井原油按1∶1体积比混合，在50℃、70℃水浴摇床上振荡24h，观察原油分散情况，同时用蒸馏水作为对照介质，结果列于表6。表6中还列出了分散处理后回收原油的凝固点测定值。生物乳化剂对两种高含蜡原油的作用是将原油乳化、分散，但不改变其凝固点，即起物理化学作用，而非化学作用(降解反应)。
表6生物乳化剂对两种原油分散性和凝固点的影响
| 原油 | 处理介质 | 50℃处理24h | 70℃处理24h | ||
| 分散程度 | 凝点/℃ | 分散程度 | 凝点/℃ | ||
| 试验1号井 | 水 | - | 40.5 | - | 40.5 |
| 上清夜 | +++ | 40.3 | ++++ | 40.5 | |
| 试验2号井 | 水 | - | 43.2 | - | 43.2 |
| 上清夜 | +++ | 43.1 | ++++ | 43.3 | |
*“-”代表不分散，“+”代表分散，“+”号越多，分散程度越大。试验1号井原油含蜡37.44％，含胶质沥青质4.73％；试验2号井原油含蜡24.5％，含胶质沥青质24.84％
实施例10：
本发明提供的生物乳化剂在试验1号井的采油现场试验。
将一定生物乳化剂的量加入注入井中→关井(吞吐井)或注水(驱油井)数天→提高采出井油产量。生物乳化剂注入油井后油产量变化曲线见图6，由图可知该井日均增产2.5吨以上，有效期80天，共增产原油239吨。
Claims (9)
1.一种嗜热地芽孢杆菌Geobacillus.sp DM-2保藏号CGMCC No.1565产生的新型糖蛋白类生物乳化剂。
2.如权利要求1所述的生物乳化剂，其特征在于该生物乳化剂仅含有蛋白质和多糖；多糖组分仅有一种葡萄糖组成，蛋白组分由赖氨酸，丙氨酸，缬氨酸，甲硫氨酸和甘氨酸五种氨基酸组成。
3.如权利要求2所述的生物乳化剂，其特征在于乳化剂的性质测定方法用Molish反应判定糖类，用Bradford比色法测定蛋白，油红O染色测定脂类。
4.如权利要求2所述的生物乳化剂，其特征在于乳化剂多糖组分组成的分析方法是，取该物质5mg加入2M H2SO4中，沸水浴10h以上，用BaCO3中和H2SO4，离心除去沉淀，得水解后样品与单糖标准品在新华1号滤纸上经正丁醇∶冰乙酸∶水＝4∶1∶5的展开剂展开，9h后风干，喷显色剂苯胺-磷酸盐溶液；再风干后，于100℃显色2-5min，计算样品与标准品的Rf值；其中显色剂苯胺-磷酸盐溶液是由苯胺-磷酸溶液与丙酮按2∶3混配而成，苯胺-磷酸溶液是由苯胺∶水∶冰乙酸∶磷酸＝2∶20∶18∶1混配而成。
5.如权利要求2所述的生物乳化剂，其特征在于乳化剂蛋白组分氨基酸组成的分析方法是，取该物质1mg加入6NHCl中，110℃水解24h以上，将HCl蒸干后，溶于双蒸水中，得水解后样品与氨基酸标准品在新华1号滤纸上经正戊醇∶吡啶∶水＝35∶35∶30的展开剂展开，9h后风干，用10％茚三酮100℃显色10min，计算样品与标准品的Rf值。
6.一种权利要求1所述的生物乳化剂的制备方法，其特征在于在培养嗜热地芽孢杆菌Geobacillus sp.DM-2的过程中，向无机盐培养基中添加碳水化合物，即淀粉、乳糖、蔗糖或葡萄糖为碳源，其培养基组成如下g/L：K2HPO4·3H2O 4.8；KH2PO4 1.5；(NH4)2SO41；柠檬酸三钠0.5；MgSO4·7H2O 0.2；葡萄糖2；酵母提取物0.1；CaCl2·2H2O 0.002；MnCl2·4H2O 0.0004；NiCl2·6H2O 0.0004；ZnSO4·7H2O 0.0004；FeCl3·6H2O 0.0002；NaMoO4·2H2O 0.0002；培养条件50～70℃，pH 6～8，培养24～48小时，以丙酮沉淀透析法和酸沉法分离乳化剂，最后得到生物乳化剂。
7.如权利要求6所述的生物乳化剂的制备方法，其特征在于生物乳化剂的分离提取方法是，将权利要求6所述的培养发酵液8000rpm 4℃离心除去菌体后，加入3倍体积冰冷丙酮或者工业酒精，用玻璃棒搅拌均匀，置于4℃过夜，离心得沉淀，用2000ml无菌水回溶，4℃透析，然后冷冻干燥，得乳化活性物质。
8.如权利要求1所述的生物乳化剂，其特征是其能很好的乳化柴油、煤油、正烷烃、原油和芳香族化合物。
9.一种权利要求1所述的生物乳化剂在提高烷烃和原油在水中的溶解度，促进解烃菌活性菌株对烷烃摄取和原油降解的效率，以及提高石油采收率中的应用。
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