CN102399719B

CN102399719B - 一株能降解海洋柴油污染物的细菌dw3

Info

Publication number: CN102399719B
Application number: CN 201110325954
Authority: CN
Inventors: 侯登勇; 沈先荣; 何颖; 蒋定文; 刘玉明; 刘琼; 陈伟; 李珂娴; 莫琳芳; 王庆蓉; 钱甜甜
Original assignee: Navy Medicine Research Institute of PLA
Current assignee: Navy Medicine Research Institute of PLA
Priority date: 2011-10-21
Filing date: 2011-10-21
Publication date: 2013-08-14
Anticipated expiration: 2031-10-21
Also published as: CN102399719A

Abstract

本发明涉及一株能降解海洋柴油污染物的细菌的分离、鉴定及其降解能力的测定。本发明利用现代微生物技术，采用微生物自然富集培养方法从污染港口水体中分离获得对柴油污染物具有降解效能的一株细菌，命名为DW3。经过鉴定，确定其属于不动杆菌属；对该菌株的烷烃降解酶基因的分析结果表明该菌株含有一种新的烷烃末端单加氧酶基因(alkane monooxygenase，AlkB)片段。通过对其降解率的测定和降解条件的分析，显示该菌株能稳定、高效地对柴油污染物进行降解，有望应用于海洋柴油污染的治理。

Description

一株能降解海洋柴油污染物的细菌DW3

1技术领域

本发明涉及一株能降解海洋柴油污染物的细菌的分离、鉴定、降解条件的确定及降解酶基因的分析。

2背景技术

随着世界对石油及其制品需求的日益增长，在海上开采、运输、装卸以及利用石油过程中的溢油事故也日渐增多。溢油不仅造成严重的环境污染，并且由于石油烃类污染物的潜在毒性和生物累积效应会导致近岸海域环境质量和生物种类多样性指数严重下降，破坏生态系统的功能，对水产业和旅游业也会造成巨大的经济损失。另外，石油烃中的多环芳烃类化合物具有强烈的致畸、致癌和致突变效应，可能通过食物链进入人体，对人体健康具有很大的潜在危害。因此，研究近岸海洋环境中石油及其制品污染物的控制与修复问题对于保持海洋生态系统的良性循环，保障人民的身体健康以及促进经济和社会的可持续发展无疑具有重要的现实意义。

微生物降解是去除环境中石油污染物的主要途径。生物修复是指利用生物特别是微生物来催化降解环境污染物，减小或最终消除环境污染的受控或自发过程，是在微生物降解基础上发展起来的新兴的环保技术。

土著微生物降解污染物的潜力巨大，但驯化时间长、生长速度慢、代谢活性低，因而添加外源高效污染物降解菌，能够提高生物修复效率。接种的微生物被称为先锋微生物，它们能够催化被限制的生物降解过程。这些接种微生物可以从土著微生物中富集，也可以从其它区域获得。

微生物对石油烃的降解分为三个主要过程，首先是石油烃在微生物细胞膜表面的吸附，其次是吸附在细胞膜表面的石油烃进入细胞膜内，最后是石油烃进入微生物细胞膜内与降解酶结合发生酶促反应。

石油烃的生物降解是通过细胞膜内的烃降解酶作用而降解，烃类物质必须同微生物接触，并通过细胞壁到达细胞膜内才能被降解，而石油烃是疏水性的，所以石油烃在微生物表面的吸附成为了影响其降解效率的关键。对于不同的微生物以及石油烃的不同存在形式，石油烃进入细胞的微生物细胞膜表面对石油烃的吸附方式也不一样。一般认为，微生物在摄取石油烃时主要采取以下三种方式：a、微生物细胞摄取溶解在水相中的烃类。该模型只适用于水溶性芳香烃和气态烷烃，不适于长链烷烃，后者在水中溶解度太小，不足以维持微生物的生长。鉴于表面活性剂对石油烃具有一定的增溶和分散作用，有人提出了利用表面活性剂来增加石油烃的溶解度。通过人工添加表面活性剂或是通过石油降解菌自身分泌的生物表面活性剂有利于石油烃在水体中的增溶和分散，从而有利于微生物细胞摄取溶解在水体中的烃类。Olivera等从被石油污染的海滩中分离获得了三株能够产生表面活性剂的石油降解菌，并研究了其相关基因。b、微生物细胞与比其大得多的油滴直接接触进而进行摄取，称为“与大油滴直接接触”模型，该模型认为微生物细胞与比其大得多的以非水相形式存在的液滴相接触。d、微生物细胞与比其小得多的假溶、拟溶或被包裹的烃类颗粒作用，进而进行摄取。这种“微滴接触”模型是微生物细胞在非水溶性底物的诱导下分泌生物表面活性剂，将底物乳化成小液滴，形成烷烃-表面活性剂胶束，可使微生物有效地利用烷烃生长。也有种解释是微生物通过释放出乳化剂将油滴乳化成小颗粒，增大油滴的表面积，有利于微生物的直接接触和利用。研究表明，烷烃液滴的界面面积与微生物的比生长速率之间相关，即烷烃液滴直径越小，界面面积越大，比生长速率越大。

石油烃在细胞膜内的运输是石油烃生物降解的主要影响因素。随着分子生物学和分子生物化学的发展，石油烃在细胞膜内的运输方式的机理研究逐渐引起人们的关注，但具体的转运机理尚不清楚。现在的跨膜运输理论主要存在被动运输和主动运输两种。Beal和Whitman分别发现Pseudomonas aeruginosa和Pseudomonas fluorescens吸收了十六烷和萘之后，质子的运动能力降低，这表明需能的主动运输在菌中是存在的。也有研究表明，微生物自身产生的生物表面活性剂也能使微生物细胞膜结构发生改变，从而引起污染物通过细胞膜的机会大大增加。Carrilo C.与Terurl J A等发现有些表面活性剂能够集合排列在微生物细胞膜的表面，有的甚至还可以镶嵌在细胞膜中，从而在细胞膜表面形成类似通道的孔状结构，使石油烃更容易通过细胞膜进入细胞体内。

石油是以链烷烃、环烷烃、芳香烃以及少量非烃类化合物为主要成分的复杂混合物。各种石油成分的生物降解性因其化学结构不同和分子量大小而表现出一定的差异。在各组分中，饱和烃最容易降解，其次是低分子量的芳香族烃类化合物，高分子量的芳香族烃类化合物、树脂和沥青质则极难降解。相同条件下微生物对不同种类石油烃的降解能力是不同的，一般认为不同烃类微生物可降解性次序如下：链烃比环烃易降解，不饱和烃比饱和易降解，直链烃比支链烃易降解，而且，支链烷基愈多，其生物降解性愈差，尤其是碳链末端有季碳原子是特别顽固，对于多环芳烃，则很难被微生物降解。微生物对石油中不同烃类化合物的代谢途径和机理是不同的。

上世纪40年代开始了微生物降解海上油污的研究，较全面的研究是在几次较大型的溢油事件以后的六十年代末七十年代初。①最早将生物修复技术大规模用于石油污染是在美国威廉王子港(Prince William Sound)的漏油事件中展开的，在使用物理和化学方法所得效果甚微后，通过外加营养等手段促进烃降解菌的生长，使油污染得到了很好的控制。②1989年，美国阿拉斯加Exxon Valdez发生油轮泄漏事故，4.2×10⁴m³原油泄漏在阿拉斯加海岸，长1千多公里。从污染海滩分离的细菌菌株具有特殊的油污降解能力，污染海域由于营养缺乏，微生物降解能力受到限制，外加营养成分一段时间后，石油降解菌增加1-2个数量级，石油污染物降解速度提高了2-3倍。毒性试验表明修复后的环境没有发生负效应，沿岸海域也没有出现营养富集化现象。③上世纪80年代初纽约长岛汽油站发生汽油泄漏，约有106吨汽油进入附近土壤和地下水中，回收了未被土壤吸附的汽油约82吨，仍有相当多的汽油残留在土壤中。1985年4月开始在该地进行生物修复处理，采用双氧水作为供氧体，在21个月中有效地去除了土壤中吸附的汽油，估计通过生物作用去除的汽油约为17.6吨，占总去除量的72％。经过生物修复处理后，土壤中的汽油含量已低于检测限。

生物修复技术的关键是筛选出高效降解污染物的微生物，这种微生物能在环境中表现出对石油较高的降解效率。在被石油长期污染的环境中，存在大量的石油烃降解菌，可以从中筛选出高效的石油烃降解菌。

烷烃降解菌的降解酶基因以烷烃末端单加氧酶AlkB相关的烷烃羟化酶和P450家族的CYP153亚族为目前的研究热点。烷烃进入细菌后，先被细胞膜上的AlkB蛋白或细胞质中的CYP153A蛋白进行末端羟基化，然后在乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的作用下进一步氧化，最后加上乙酰辅酶A，进入β氧化循环，分解成二氧化碳和水，AlkB酶和CYP153A酶是烷烃降解的限速酶。迄今为止，在分离的海洋石油烃降解菌中，已发现了多种AlkB同源基因，这些AlkB同源基因的序列及其产物的活性与降解菌降解石油烃的活性相关，甚至是同种属的不同菌株，由于所含的AlkB同源基因的序列不同，也会导致对石油烃的降解效率差别很大。

3发明内容

本发明的目的是提供一株能够在海水中降解柴油污染物的细菌DW3，用于海水中柴油污染物的治理。该菌株的特征是能够在以柴油为唯一碳源的海水培养基中生长繁殖，降解柴油。

DW3菌是从定海港口受污染的海水中，采用富集培养微生物的方法，分离获得的对油类污染具有较好降解效能的优势土著菌。经紫外分光光度法检测，其对柴油污染物的降解效率达到60-90％。

对DW3进行形态观察和生理生化实验，初步鉴定为不动杆菌。将DW3菌株直接进行菌落PCR扩增，得到16S rDNA的基因序列，构建系统发育树，结果表明DW3菌株与威尼斯不动杆菌的序列相似性为99.7％，由此可确定该菌株属于不动杆菌属，并最接近于威尼斯不动杆菌。该菌株保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期为2011年9月5日；保藏编号为：CGMCC No.5215；分类命名为威尼斯不动杆菌(Acinetobacter venetianus)。

在不同的温度、pH、初始油浓度及接菌量的条件下，对DW3的柴油降解率进行了测定，获得了DW3降解柴油的最佳条件，在最佳条件下，DW3对柴油降解率为85％，多次实验表明DW3能稳定降解柴油污染物，具有实用价值。

对菌株DW3基因组DNA和质粒中的降解酶基因进行分析，获得了一个新的AlkB基因的DNA片段序列，该序列与基因库中的序列比对结果表明，与已知的AlkB基因的同源性最高只有75％，表明这个AlkB基因的DNA片段是在其他的柴油降解菌中不存在的新的AlkB基因的DNA片段，是菌株DW3降解效率较高的原因。

4附图说明

图1：DW3的菌体形态和菌落形态A：在营养琼脂培养基上的菌落形态，圆形或近圆形，直径1-2mm，近象牙黄色，表面光滑、湿润，中央稍隆起；B：显微镜下的菌体形态，为杆状，不产生芽孢，革兰氏阴性(10×100)。

图2：DW316s rDNA序列。

图3：根据DW316s rDNA序列构建的系统发育树，DW3的16s rDNA序列与威尼斯不动杆菌的同源性最高，达到99.7％。

图4：影响DW3降解率的因素A不同温度的影响(纵坐标为降解率，横坐标为不同的温度)；B不同pH值的影响(纵坐标为降解率，横坐标为不同的pH值)；C：不同初始柴油浓度的影响(纵坐标为降解率，横坐标为不同的初始柴油浓度)；D不同接菌量的影响(纵坐标为降解率，横坐标为不同的接菌量)。

图5：最佳条件下DW3菌株在海水培养基中的生长曲线及对柴油污染物的降解率曲线(左纵坐标为培养液OD600吸光度，右纵坐标为降解率，横坐标为培养时间)。

图6：所含新AlkB基因的DNA片段序列，该片段是AlkB基因中的一部分。

5具体实施方式

以下通过具体实施对本发明做进一步说明。

实施例1.污染海水中细菌的富集、培养

从受污染的海水区域采集表层水样，用灭菌后的4L棕色玻璃瓶取2L表层海水后密封保存，24h内进行微生物的富集培养和分离工作。

将采集的水样取1mL接种于含0.5％(v/v)柴油的100mL灭菌的人工海水培养基(MMC)中。MMC的配方为(每升含量)：NaCl 24g；MgSO₄·7H₂O 0.7g；NH₄NO₃1g；KCl 0.7g；KH₂PO₄ 2g；Na₂HPO₄·12H₂O 3g；pH7.5，灭菌后补加适量微量元素混合。微量元素经0.22μm滤膜过滤除菌，其组成(每升含量)如下：CaCl₂2mg；FeCl₃·6H₂O 50mg；CuSO₄0.5mg；MnCl₂·4H₂O 0.5mg；ZnSO₄·7H₂O 10mg/L。

在30℃，200rpm的摇床培养7天后，从培养液中取出1mL转入100mL新鲜培养基中，培养基的油浓度提高至1％(v/v)，在相同的条件下培养；油浓度按梯度(0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％)提高，富集培养五个周期。

实施例2.DW3菌株的分离

用移液枪(枪头已灭菌)吸取1mL富集培养物置于9mL无菌水中，作为10^-1稀释液进行倍比稀释，分别制成10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8稀释液；分别吸取0.2mL不同稀释度的样品滴入LB固体培养基内，涂布8个平板，对应编号，倒置于35℃生化培养箱培养1～2天；再在平板上挑取单菌落，采取分区划线法，使菌种进一步纯化；纯化后的菌株保存在斜面培养基中，并于4℃冰箱中保藏；实验均在无菌室超净工作台操作。

将分离纯化的细菌分别接种于5ml LB液体培养基中，200rpm，35℃下振荡培养12h，至菌悬液OD_600nm值为0.8～1.0(菌体浓度为10⁸～10⁹cells/mL)，然后将0.5ml去掉LB培养基的各菌悬液分别加入50mL相同柴油浓度的MMC中，设空白对照，200rpm，30℃下振荡培养7天，将能以柴油作为唯一碳源生长的菌株保存，即为DW3。

实施例3.DW3菌株降解率的初步测定

取保存的DW3菌种，LB平板划线，30℃恒温培养过夜，挑取单克隆，接种于5mL LB培养基中，于30℃、200rpm的摇床培养8小时。吸取0.5mL活化后的菌液至1.5mLEP管中，在3000rpm条件下离心5min，弃上清；用0.5mL的MMC培养基悬浮沉淀，再次在3000rpm条件下离心5min，重复洗涤菌体一次。将沉淀菌体用0.5mL MMC培养基悬浮后，接种于50mL添加过柴油的MMC培养基中，于30℃、200rpm的摇床培养一周。

根据《海洋监测规范-海水分析》(GB17378.4-2007)，用石油醚萃取MMC中的残留柴油，采用紫外分光光度法测定柴油的残留量，以未接菌的含相同柴油浓度的MMC培养基为对照，计算降解率。该实验设3个重复。柴油降解率η_降解计算公式为：η降_解＝{1-(C₀-C₁)/C₀}×100％，其中，C₀和C₁分别为对照组柴油浓度和接菌组柴油浓度。DW3的柴油降解率初步测定为50-80％。

实施例4.DW3菌株的生理生化鉴定

无菌环境下用接种环蘸取实验室已经过分离纯化所得的菌株DW3，接种至斜面培养基上，30℃培养24小时后，保存于4℃冰箱中。依据《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏细菌手册》对该高效柴油降解菌进行初步的形态观察和生理生化实验(包括采用API 20E细菌鉴定系统鉴定卡)。结果显示菌落特征为圆形或近圆形，直径1-2mm，近象牙黄色。表面光滑、湿润，中央稍隆起，边缘整齐(图1A)。其在显微镜下形态特征为杆状，静止期为球形或近球形，一般呈单个或成对，不产生芽孢，革兰氏阴性(10×100，图1B)。生理生化实验表明DW3具有严格好氧、氧化酶阴性、过氧化氢酶阳性；不利用D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-核糖，能利用柠檬酸钠作为唯一的碳源，并能利用硝酸钾和硫酸铵作为唯一氮源；在生长过程中不需要生长因子；另外DW3菌株在37℃条件下能够生长，但是在44℃条件下不能生长。经过鉴定，DW3菌株可初步认定为不动杆菌属。

实施例5.DW3菌株的16S rDNA鉴定

DW3菌株用TAKARA的DNA提取试剂盒直接提取DNA作为模板，PCR反应体系(50μl)为Premix EX Taq PCR MasterMix(TAKARA)25μl，引物27F(5′-AGR GTTTGATYV TGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGHTACCTTGTTACGACTT-3′)各2μl(10pmol)，DNA模板2μl(约20ng)，超纯水19μl。PCR扩增程序为94℃10min；94℃1min，53℃90s，72℃90s，30个循环；72℃10min。扩增产物进行测序，测序结果用DNAstar软件来拼接，结果如图2所示。将测得的菌株的16S rDNA序列通过EzTaxon Server version 2.1与其中核酸数据库进行比对分析，相似的序列进行多重匹配排列分析(clustalx 1.83)，用Mega 4分析软件中的NeighborJoining方法构建系统发育树。DW3菌株与威尼斯不动杆菌的序列相似性为99.7％(图3)，由此可确定该菌株属于不动杆菌属，并最接近于威尼斯不动杆菌。

实施例6.DW3菌株降解柴油污染物温度条件的确定

取保存的DW3菌种，LB平板划线，30℃恒温培养过夜，挑取单克隆，接种于5mL LB培养基中，于30℃、200rpm的摇床培养8小时。吸取0.5mL活化后的菌液至1.5mLEP管中，在3000rpm条件下离心5min，弃上清；用0.5mL的MMC培养基悬浮沉淀，再次在3000rpm条件下离心5min，重复洗涤菌体一次。将沉淀菌体用0.5mL MMC培养基悬浮后，接种于50mL含1％(v/v)柴油，pH7.5的MMC培养基中，分别于20℃、30℃和37℃条件下、200rpm的摇床培养一周。然后以石油醚萃取MMC培养基中残余的柴油，采用紫外分光光度法测定柴油含量，计算降解率，结果显示在30℃时DW3对柴油的降解率最高，如图4A所示。

实施例7.DW3菌株降解柴油污染物pH条件的确定

取保存的DW3菌种，LB平板划线，30℃恒温培养过夜，挑取单克隆，接种于5mL LB培养基中，于30℃、200rpm的摇床培养8小时。吸取0.5mL活化后的菌液至1.5mLEP管中，在3000rpm条件下离心5min，弃上清；用0.5mL的MMC培养基悬浮沉淀，再次在3000rpm条件下离心5min，重复洗涤菌体一次。将沉淀菌体用0.5mL MMC培养基悬浮后，分别接种于50mL含1％(v/v)柴油，pH值分别为6、6.5、7、7.5和8的MMC培养基中，于30℃条件下、200rpm的摇床培养一周。然后以石油醚萃取MMC培养基中残余的柴油，采用紫外分光光度法测定柴油含量，计算降解率，结果显示在pH7.5时的降解率最高，如图4B所示。

实施例8.DW3菌株降解柴油污染物初始油浓度条件的确定

取保存的DW3菌种，LB平板划线，30℃恒温培养过夜，挑取单克隆，接种于5mL LB培养基中，于30℃、200rpm的摇床培养8小时。吸取0.5mL活化后的菌液至1.5mLEP管中，在3000rpm条件下离心5min，弃上清；用0.5mL的MMC培养基悬浮沉淀，再次在3000rpm条件下离心5min，重复洗涤菌体一次。将沉淀菌体用0.5mL MMC培养基悬浮后，分别接种于50mL含油为0％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、4％、5％，pH为7.5的MMC培养基中，于30℃条件下、200rpm的摇床培养一周。然后以石油醚萃取MMC培养基中残余的柴油，采用紫外分光光度法测定柴油含量，计算降解率，结果显示初始油浓度为1％时降解率最高，如图4C所示。

实施例9.DW3菌株降解柴油污染物接菌浓度条件的确定

取保存的DW3菌种，LB平板划线，30℃恒温培养过夜，挑取单克隆，接种于5mL LB培养基中，于30℃、200rpm的摇床培养8小时。分别取0、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5mL菌液，在3000rpm条件下离心5min，弃上清；用相同体积的MMC培养基悬浮沉淀，再次在3000rpm条件下离心5min，重复洗涤菌体一次。将沉淀菌体用相同体积的MMC培养液悬浮后，分别接种于50mL含油为1％、1.5％，pH为7.5的MMC培养基中，使得接种量分别为0％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、4％、5％，于30℃条件下、200rpm的摇床培养一周。然后以石油醚萃取MMC培养基中残余的柴油，采用紫外分光光度法测定柴油含量，计算降解率，结果显示菌体接种量为3％时降解率最高，如图4D所示。

实施例10.DW3菌株在最佳条件下的柴油降解率的测定

取保存的DW3菌种，LB平板划线，30℃恒温培养过夜，挑取单克隆，接种于5mL LB培养基中，于30℃、200rpm的摇床培养8小时。吸取0.5mL活化后的菌液至1.5mLEP管中，在3000rpm条件下离心5min，弃上清；用0.5mL的MMC培养基悬浮沉淀，再次在3000rpm条件下离心5min，重复洗涤菌体一次。将沉淀菌体用0.5mL MMC培养基悬浮后，以3％的比例接种于含1％柴油的MMC(pH 7.5)培养基中，于30℃条件下、200rpm的摇床培养7天。每天以石油醚萃取MMC培养基中残余的柴油，采用紫外分光光度法测定柴油含量，计算降解率。结果如图5所示，DW3菌种在第7天对柴油的降解率达到85％以上。

实施例11.DW3菌株中烷烃降解酶基因的分析

取保存的DW3菌种，LB平板划线，30℃恒温培养过夜，挑取单克隆，接种于5mL LB培养基中，于30℃、200rpm的摇床培养8小时。取培养物1.5ml，常规方法提取质粒，以提取的质粒作为模板，进行PCR扩增。扩增引物为F(5’-AAYACNGCNCAYGARCTNGGVCAYAA-3’)和R(5’-GCRTGRTGRTCHGARTGNCGYTG-3’)。PCR扩增程序为94℃10min；94℃1min，55℃90s，72℃90s，30个循环；72℃10min。扩增产物进行DNA测序，序列如图6所示，将该序列与Genbank中的序列进行同源比对，未发现一致序列。

Claims

1.一株威尼斯不动杆菌(Acinetobacter venetianus)DW3，所述威尼斯不动杆菌DW3菌种保藏编号为CGMCC№5215。

2.按照权利要求1所述菌株DW3，其特征是能在以柴油为唯一碳源的海水培养基中生长繁殖，降解柴油。

3.按照权利要求1所述菌株DW3，其特征是降解柴油的降解效率为60％～90％。