CN102994428B - 一株海洋产表面活性剂菌株lhod-1及其应用 - Google Patents
一株海洋产表面活性剂菌株lhod-1及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种海洋产表面活性剂菌株，该菌属属于栖盐田菌属（Salinicola sp.），保藏名称为：Salinicola sp. LHOD-1，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2012年10月29日，保藏号：CGMCC No.6715。该菌株具有产表面活性剂能力，对海洋中的石油烃污染具有较强的乳化效果，能帮助去除海水中的石油烃污染，并且对海水养殖生物没有毒害致病作用。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种海洋产表面活性剂菌栖盐田菌株（Salinicola sp.）及其在处理受石油烃污染海水中的应用。
背景技术
近年来，石油开采业逐渐由陆地走向海洋。石油的开采和海上运输业的发展，导致由于井喷、运输船舶的漏油、沉没以及输油管道的泄漏等造成的海洋石油烃污染事故屡见不鲜，受污染的海域范围也在不断扩展。石油进入海水后，使海水中大量的溶解氧被石油吸收，油膜覆盖于水面，使海水与大气隔离，造成海水缺氧，导致海洋生物死亡，给养殖资源带来严重的危害。油污还可以使经济鱼类、贝类等海产品产生油臭味，成年鱼类、贝类长期生活在被污染的海水中其体内蓄积了某些有害物质，通过食物链进入人体后严重危害人类健康。
利用微生物修复技术修复受污染的海水具有经济、有效和环境友好等优点,是目前的优先考虑技术。在生物修复过程中，石油烃的疏水性是限制其降解速率的主要因素之一。微生物摄取疏水性石油烃的一个重要策略就是分泌细胞代谢物即生物表面活性剂。生物表面活性剂含有亲水基团和疏水基团，能够降低油水界面张力，促使石油污染物分散、增溶、乳化，从而提高其生物可利用性，促使污染物高效生物降解。
发明内容
本发明的目的是提供一种海洋产表面活性剂菌栖盐田属菌株，以提高海洋石油烃的降解效果，有效去除海洋石油烃污染，同时提供上述海洋产表面活性剂栖盐田菌属菌株在处理海洋石油烃污染的应用。
本发明技术方案来是：一种海洋产表面活性剂栖盐田菌属菌株，该菌株属于栖盐田菌属（Salinicola sp.），保藏名称：栖盐田菌LHOD-1，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市中科院北京微生物研究所菌种保藏中心 保藏日期：2012年10月29日，保藏号：CGMCC No.6715。
所述海洋产表面活性剂栖盐田菌属菌株的筛选分离和鉴定过程为：取受石油烃污染的海洋沉积物，在实验室利用选择培养基培养后，分离纯化菌株，根据菌株对含油平板的噬油斑的形成和表面张力的测定，最终筛选出一株能产生表面活性剂的菌株，编号为LHOD-1，然后根据菌落的形态特征、生理生化特征，及其16S rDNA基因序列与Genebank中已登录序列进行比对分析发现，菌株LHOD-1经鉴定为栖盐田菌属，命名为栖盐田菌（Salinicola sp.）LHOD-1。
所述的海洋产表面活性剂栖盐田菌菌株在处理受石油烃污染海水的具体过程为：取经分离纯化的海洋产表面活性剂栖盐田菌CGMCC 6715单菌落，于扩大活化培养基中培养48h，菌液浓度达到1.0×108-1.0×109cfu/ml，按海水与菌液体的体积比为40-60:1，将海洋产表面活性剂栖盐田菌CGMCC 6715接种于含柴油的海水中，25-28 ℃恒温振荡培养1-10d。
所述恒温振荡培养的条件为25℃培养7d。
所述活化扩大培养基的培养条件优选为：蛋白胨5.0 g，酵母膏 1.0 g，磷酸高铁0.1 g，陈海水1000 mL，pH 7.6-8.2，121℃灭菌20 min。
本发明与现有技术相比具有以下优点：本发明从受污染的海洋沉积物中得到产表面活性剂的新菌株，提高了石油烃污染的降解效率，在10d内对海水中柴油的去除率达到80%以上。
附图说明
一株海洋产表面活性剂栖盐田菌属菌株，菌株属于栖盐田菌属（Salinicola sp.），保藏名称：栖盐田菌LHOD-1，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市中科院北京微生物研究所菌种藏中心 保藏日期：2012年10月29日，保藏号：CGMCC No.6715。
图1是栖盐田菌CGMCC 6715的电镜图片；
图2是栖盐田菌CGMCC 6715的PCR产物琼脂糖电泳图；
图3是栖盐田菌CGMCC 6715菌株在油平板上形成的噬油斑；
图4是栖盐田菌CGMCC 6715表面活性剂的乳化性能；
图5是投加栖盐田菌CGMCC 6715菌株后降解效果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明，但不以任何形式限制本发明。
实施例1 海洋产表面活性剂菌株的筛选方法:
一、材料准备
1、菌源和实验废水
（1）菌源为受石油烃污染的辽宁省大连市7.16溢油事故现场沉积物。
（2）实验废水：自然海水1000 mL，121 ℃ 灭菌20 min，加入100 mg 经0.2 um的微孔滤膜过滤后的柴油。
2、培养基
（1）选择培养基：自然海水1000 mL，121 ℃ 灭菌20 min，加入100 mg 经0.2 um的微孔滤膜过滤后的柴油。
（2）分离培养基：蛋白胨5.0 g，酵母膏 1.0 g，磷酸高铁0.1 g，陈海水 1000 mL，琼脂粉 20 g，pH 7.6-8.2，121 ℃灭菌20 min。
（3）活化扩大培养基：蛋白胨5.0 g，酵母膏 1.0 g，磷酸高铁0.1 g，陈海水1000 mL，pH 7.6-8.2，121 ℃灭菌20 min。
二、菌株的分离与筛选
1、菌株的富集
移取2 g 左右沉积物样品置于盛有20 mL 生理盐水的三角瓶中震荡摇匀后，静置后，取上清液加入含有100 mg/L柴油的选择培养基，温度25 ℃，180 r/ min 培养7 d，再将菌液转接至新鲜的培养基，如此富集3次。
2、菌株的分离纯化
将富集液稀释后，均匀涂布于分离培养基平板上，25 ℃ 培养5 d，待菌落长出后，挑取形态各异的单菌落，在分离培养基平板上划线分离，直至得到纯的单菌落。将分离纯化的细菌接种至斜面培养基，并于冰箱4 ℃保存。
3、表面活性剂产生菌的筛选
通过对含油平板的噬油斑的形成（见图3）和表面张力的测定，来确定菌株的产表面活性剂能力。
通过挑取新鲜培养的菌落，接种于以以柴油为唯一碳源的平板上，25 ℃培养3-5d后观察噬油斑的有无，然后挑选出有噬油斑的菌落接种于斜面上，25℃条件下培养3-5d 后，于 4 ℃冰箱保存。
取产生噬油斑的4种形态不同单菌落接种于活化扩大培养基中， 25 ℃培养 5 d，离心去除菌体，采用上海衡平仪器仪表厂生产的BZY-1表面张力仪测定液体表面张力，结果如表1所示。
表1 菌株发酵液表面张力值
| 菌株编号 | 表面张力值（mN· m-1） | 菌株编号 | 表面张力值（mN·m-1） |
| LHOD-1 | 32.6 | 3# | 48.7 |
| 2# | 41.4 | 4# | 42.6 |
经过筛选获得一株编号为LHOD-1的菌株，即海洋产表面活性剂菌株LHOD-1
实施例2 海洋产表面活性剂菌株LHOD-1的鉴定
1、对海洋产表面活性剂菌株的鉴定
对海洋产表面活性剂栖盐田菌CGMCC 6715进行了生理生化鉴定以及16S rDNA分子鉴定，从分子水平，并结合细菌的形态学特征及生理生化特征分析确定菌株的种属。
16S rDNA序列分析主要按照以下步骤：
①细菌核酸DNA的提取
采用TAKARA细菌基因组DNA提取试剂盒获得菌株的DNA
②16S rDNA基因的PCR扩增
P1：27f（5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’）
P2：1492r（5’-AAG TCG TAACAAGGT AAC C-3’）
在50 uL体系中，加入1 uL模板DNA（0.1 ug），0.5 uL P1和P2（终浓度为0.5 uM），1 uL dNTP(0.2 mM)，0.5 uL Taq酶和5uL 10×PCR缓冲液。PCR扩增条件为：94℃ 预变性5 min，94 ℃变性30 s 65 ℃退火30 s， 72 ℃延伸1 min，循环30次，最后72 ℃终延伸10 min
2、16S rDNA序列的测定
本发明采用对16S rDNA序列测定和分析的方法对细菌进行分子水平的鉴定。以细菌的DNA为模板，以16S rDNA基因的PCR扩增的通用引物为引物，进行PCR扩增，得到长度为1448 bp的扩增带，用1%的琼脂糖电泳监测，如图2所示，产物经纯化后，测定其全序列。
tacacatgca cgtcagagcg gcagcacggg gagcttgctc cctggtggcg agcggcggac
60
gggtgagtaa tgcataggaa tctgcccggt agtgggggat aacgtgggga aacccacgct
120
aataccgcat acgtcctacg ggagaaagcg gaggatcttc ggacttcgcg ctatcggatg
180
agcctatgtc ggattagcta gttggtaagg taacggctta ccaaggcgac gatccgtagc
240
tggtctgaga ggatgatcag ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag
300
gcagcagtgg ggaatattgg acaatgggcg aaagcctgat ccagccatgc cgcgtgtgtg
360
aagaaggctt tcgggttgta aagcactttc agcgaggaag aaggcctggt ggttaatacc
420
catcaggaag gacatcactc gcagaagaag caccggctaa ctccgtgcca gcagccgcgg
480
taatacggag ggtgcgagcg ttaatcggaa ttactgggcg taaagcgcgc gtaggtggct
540
tggcacgccg gttgtgaaag ccccgggctc aacctgggaa cggcatccgg aacggccagg
600
ctagagtgca ggagaggaag gtagaattcc cggtgtagcg gtgaaatgcg tagagatcgg
660
gaggaatacc agtggcgaag gcggccttct ggcctgacac tgacactgag gtgcgaaagc
720
gtgggtagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gtcgactagc
780
cgttgggacc tttaaggact tagtggcgca gttaacgcga taagtcgacc gcctggggag
840
tacggccgca aggttaaaac tcaaatgaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat
900
gtggtttaat tcgatgcaac gcgaagaacc ttacctaccc ttgacatcct gcgaatttgg
960
tagagatacc ttagtgcctt cgggagcgca gtgacaggtg ctgcatggct gtcgtcagct
1020
cgtgttgtga aatgttgggt taagtcccgt aacgagcgca acccttgtcc ttatttgcca
1080
gcacgtaatg gtgggaactc taaggagact gccggtgaca aaccggagga aggtggggac
1140
gacgtcaagt catcatggcc cttacgggta gggctacaca cgtgctacaa tggccggtac
1200
aaagggttgc gagaccgcga ggtggagcga atcccagaaa gccggcctca gtccggatcg
1260
gagtctgcaa ctcgactccg tgaagtcgga atcgctagta atcgtgaatc agaatgtcac
1320
ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accatgggag tggactgcac
1380
cagaagtggt tagcttaacc ttcgggagag cgatcaccac ggtgtggttc atgactgggg
1440
tgaagtcg
1448
实施例3 海洋产表面活性剂菌株LHOD-1细胞形态，生理生化特征
海洋产表面活性剂栖盐田菌CGMCC 6715的生理生化特征见表2，细胞形态见图1。
表2 海洋产表面活性剂菌株LHOD-1的细胞形态及生理生化特征
备注：“+”：90%以上的菌株为阳性；“-”90%以上的菌株为阴性。
实施例4 海洋产表面活性剂菌株LHOD-1的确定
将海洋产表面性剂菌株LHOD-1长度为1448bp的16S rDNA基因序列与Genbank中已登录序列进行比对分析，海洋产表面性剂菌株LHOD-1与栖盐田菌属菌株的同源性高达97%以上，综合菌株的生理生化及分子鉴定结果，可确定海洋产表面性剂菌株LHOD-1为栖盐田菌属（Salinicola sp.）。栖盐田菌（Salinicola sp.）LHOD-1已经于2012年10月保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.6715 保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院 中国科学院普通微生物菌种保藏中心。
本发明分离筛选的海洋产表面性剂菌株LHOD-1具有较强的产表面活性剂能力，为海洋石油烃污染的降解过程提供了新的思路和菌源，并且对海水养殖生物没有毒害治病作用，具有安全，环保和高效的实际应用价值。
实施例5 海洋产表面活性剂菌株LHOD-1的应用
应用实例一：
海洋产表面活性剂菌株LHOD-1的乳化性能
取分离纯化的栖盐田菌LHOD-1，于选择培养基培养5 d，将培养物5000 r/min离心10 min，收集上清液。在刻度试管中，加入5 mL石蜡和5 mL上清液，用AS2060超生波发生器处理30 min，然后再一定时间内测量乳化液和油相体积，计算乳化指数。
从图4可以看出，在72 h后，乳化指数仍达到75%，并能持续较长时间，说明该栖盐田菌CGMCC 6715产表面活性剂对石蜡乳化稳定性良好。在这种以柴油为唯一碳源的培养基里，该菌能够较好的生长，适应环境并产生活性物质，从而起到乳化、润湿、分散柴油的作用。
应用实例二
取经分离纯化的栖盐田菌LHOD-1单菌落，于活化扩大培养基中培养48h，按海水与菌液体积比为40-60:1，接种到含 100mg/L柴油的实验废水中，设置空白，培养温度25-28℃，摇床转速180 r/min，每24 h取样一次，连续监测海水中柴油的降解效果。
由图5可以看出，接种栖盐田菌LHOD-1的柴油污染海水中，柴油浓度逐渐降低，7 d 后降为最低，海水中柴油的去除率达到80%。
应用实例三
取经分离纯化的栖盐田菌LHOD-1单菌落，于活化扩大培养基中培养48 h，按海水与菌液体积比为40-60:1，接种到装有2L过滤海水的玻璃圆缸中，并以不加菌液的过滤海水为对照，分别放养30尾长约1 cm的中国对虾苗和20尾体长约为3cm的海参苗，各分3个平行实验组，水温25-28 ℃，96 h后，经统计分析，虾苗的存活率在75%~80%，海参的存活率在80~82%，存活率在实验组与对照组之间无显著差异。可见，栖盐田菌LHOD-1对海水养殖生物没有毒害治病作用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化、均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。
序列表
<110>辽宁省海洋水产科学研究院
<120>一株海洋产表面活性剂菌株LHOD-1及其应用
<130> 122066
<160>1
<170> PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1448
<212>DNA
<213>栖盐田菌属（Salinicola sp.）
<221>16S rDNA
<222>（1）…（1442）
<400> 1
tacacatgca cgtcagagcg gcagcacggg gagcttgctc cctggtggcg agcggcggac
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tgaagtcg
1448
Claims (5)
1.一株海洋产表面活性剂栖盐田菌菌株，其特征在于：该菌株属于栖盐田菌菌属（Salinicola sp.），保藏名称为：Salinicola sp. LHOD-1，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2012年10月29日，保藏号：CGMCC No.6715。
2.如权利要求1所述的海洋产表面活性剂栖盐田菌菌株在处理柴油污染海水中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的海洋产表面活性剂栖盐田菌菌株在处理受柴油污染海水的具体过程为：取经分离纯化的海洋产表面活性剂栖盐田菌CGMCC 6715单菌落，于活化扩大培养基中培养48 h，菌液浓度达到1.0×108 -1.0×109cfu/ml；按海水与菌液体积比为40-60:1，将海洋产表面活性剂栖盐田菌CGMCC 6715接种于含有柴油的海水中，25-28 ℃恒温振荡培养1-10d。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述恒温振荡培养的条件为25℃培养7d。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述活化扩大培养基为：蛋白胨5.0 g，酵母膏 1.0 g，磷酸高铁0.1 g，陈海水1000 mL，pH 7.6-8.2，121℃灭菌20 min。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Guan Xiaoyan Inventor after: Jiang Bing Inventor after: Zhou Zunchun Inventor after: Chen Zhong Inventor after: Gao Shan Inventor after: Yang Aibi Inventor after: Wang Bai Inventor after: Jiang Bei Inventor after: Jiang Jingwei Inventor after: Dong Ying Inventor before: Guan Xiaoyan Inventor before: Zhou Zunchun Inventor before: Dong Ying Inventor before: Wang Bai Inventor before: Yang Aibi Inventor before: Chen Zhong Inventor before: Jiang Bei Inventor before: Jiang Jingwei Inventor before: Gao Shan |
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| COR | Change of bibliographic data | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20151021 Termination date: 20181130 |