CN103695332A

CN103695332A - 一种新型柴油污染型场地微生物降解菌

Info

Publication number: CN103695332A
Application number: CN201310490169.5A
Authority: CN
Inventors: 陈志良; 刘沙沙; 彭晓春; 董家华
Original assignee: South China Institute of Environmental Science of Ministry of Ecology and Environment
Current assignee: South China Institute of Environmental Science of Ministry of Ecology and Environment
Priority date: 2013-10-18
Filing date: 2013-10-18
Publication date: 2014-04-02
Anticipated expiration: 2033-10-18
Also published as: CN103695332B

Abstract

本发明公开了一种新型柴油污染型场地微生物降解菌，其是保藏号为CGMCCNO.7896的醋酸钙不动杆菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明醋酸钙不动杆菌对柴油污染土壤有良好的修复效果。

Description

一种新型柴油污染型场地微生物降解菌

技术领域

本发明属于土壤污染防治领域，涉及一种新型柴油污染型场地微生物降解菌。

背景技术

自然界中能降解柴油的微生物广泛存在于土壤、水和大气等环境中，能够降解烃类的微生物非常多，大约有100余属，200多个种，分别属于细菌、放线菌、霉菌、酵母、藻类等（张辉等，2007）。细菌和真菌是烃类生物降解的主导作用者，细菌主要包括：短杆菌属(Brevibacterium)、弧菌属(Vibrio)、不动细菌属(Acinetobacter)、螺菌属(Spirillum)、节细菌属(Arthrobacter)、芽孢杆菌属（Bacillus）、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、无色杆菌属(Achromobacter)、棒杆菌属(Coryhebacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、气单胞菌属(Aeromonas)、假杆菌属 (Pseudobacterium)、微球菌属 (Micrococcus)、小单胞菌属(Micromonospora)、分枝杆菌属（Mycobacterium）、黄杆菌属(Flavobacterium)等。真菌主要包括：曲霉属（Aspergillus）、内孢霉属（Endomyces）、隐球酵母属（Cryptococcus）、掷孢酵母属(Sporobolomyces)、红酵母属(Rhodotorula)、丝孢酵母属(Trichosporon)、毕赤酵母属（Pichia）、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属（Hansenula）、新月酵母属(Selenotila)、球拟酵母属(Torulopsis)、青霉属（Penicillium）等(梁生康，2005)。放线菌中有诺卡氏菌属(Nocardia)、放线菌属(Actinomycetes)；藻类对烃类污染物的降解也起到了一定的作用，如隐球藻属(Aphanocapsa)、鱼腥藻属(Analaena)、双眉藻属(Amphora)、杜氏藻属(Dunaliella)、翅线藻属(Petalonema)、衣藻属(Chlamyclomonas)、念珠藻 (Nostoc)、鞘藻属 (Microcoleus)、石莼藻属(Ultua)、紫球藻属(Porphyridium)、小球藻属(Chlorella)、颤藻属(Oscillatoria)、细柱藻属(Culindrotheea)等中的一些菌株。

不同的柴油降解菌对不同烃的降解能力不同，多数降解菌一般只能降解一种或几种烃类（胡凌燕，2006）。环境中烃类污染物的降解大部分是微生物协同作用的结果，如藻类和细菌间以及植物和细菌之间的协同作用，但应用最多的是在微生物菌群之间的协同作用（贾彩云，2008）。王世杰等（2011）以柴油为唯一碳源，从胜利油田石油污染土壤中筛选出一株柴油降解微生物，通过鉴定将其确定该微生物为不动杆菌属，在柴油含量为l％的培养基中，柴油去除率为58.6％；张辉等（2007）以市售0^#柴油为唯一碳源筛选得到2株为分别为芽孢杆菌属和黄杆菌属的高效降解柴油菌种，在接种量为 10%的条件下，经过48h培养后除油率分别为79.25%和77.23%；Richard等（1999）将以柴油为碳源富集得到由7株菌组成的的混合菌系在初始柴油浓度为1%的液体培养基中培养50天，柴油降解率达90%；Mukherji等（2004）将从阿拉伯海油田附近底泥分离得到的混合菌系在好氧条件下培养8天后柴油去除率达39%，在厌氧条件下培养50天柴油降解率达到18%；白洁等（2007）从胜利油田石油污染土壤中富集分离出以柴油为碳源和能源的混合菌，在含油量为0.5%的无机盐液体培养基中培养7d后柴油的去除率达到90.4%；武金装等（2008）从石油污染土壤中以0^#柴油为惟一碳源筛选出9株菌，发现一株菌在柴油初始浓度为500 mg/L的培养液中，振荡培养3d降解率达到了71.7％，经鉴定将其确定为假单胞菌属。

发明内容

本发明提供一种对柴油污染土壤有良好的修复效果的醋酸钙不动杆菌，该菌是以柴油为唯一碳源和能源的柴油降解菌，对污染土壤有良好的修复效果。

本发明所提供的技术方案是：一种新型柴油污染型场地微生物降解菌，其是保藏号为CGMCC NO.7896的醋酸钙不动杆菌（Acinetobacter pittii），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

该醋酸钙不动杆菌（Acinetobacter pittii）已于2013年7月8日为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC所保藏（保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），其保藏号为CGMCC NO.7896，经检测存活。

本发明还提供所述新型柴油污染型场地微生物降解菌在对柴油污染土壤修复中的应用。

所述的应用，在柴油污染土壤中接种所述的醋酸钙不动杆菌，同时还加入表面活性剂，30%H₂O₂，有机溶剂。

所述的应用，优选地，所述表面活性剂为十二烷基苯磺酸钠，有机溶剂为甲醇，油污土壤中柴油量为2-6g/kg时，所述的醋酸钙不动杆菌的接种量为1-4%（重量），更优选地，油污土壤中柴油量为4g/kg时，所述的醋酸钙不动杆菌的接种量为2%。

本发明具有以下有益效果：

（1）从人工柴油污染土壤中富集分离筛选出一株以柴油为惟一碳源和能源的柴油降解菌，通过进行生理生化反应实验和16SrDNA测序将其归于不动杆菌属；其16SrDNA序列与醋酸钙不动杆菌的同源性达99.8%。

（2）本发明柴油柴油降解菌对污染土壤有良好的修复效果，从单因素实验结果可知，菌种降解柴油的最佳条件为：柴油添加量4g/kg，十二烷基苯磺酸钠6 mg/ g，H₂O₂累计加入量16 mL，甲醇2 mL。

（3）在最佳条件下，添加菌种、未加菌对照和叠氮化钠灭菌土壤中的柴油降解率分别为69.82%、22.12%和13.65%，半衰期分别为37、165、347d，可见本发明醋酸钙不动杆菌对柴油污染土壤有良好的修复效果。

具体实施方式

1实验材料

1.1菌种来源

本实验将取自广州市南沙区的实地土壤自然风干、除杂、磨碎，过2mm筛，用市售0^#柴油污染后装入土柱（高1m，内径0.25m），并从中取样对微生物菌种进行富集、分离、筛选和鉴定。

1.2实验试剂与仪器

（1）实验试剂：色谱纯：二氯甲烷；分析纯：氯化钠、无水磷酸二氢钾、无水磷酸氢二钾、氯化铵、硫酸铁、氯化钙、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、柠檬酸钠、硫酸钠、硝酸钠、硫酸镁、甲醇、30%双氧水、十二烷基苯磺酸、乙醇；此外还包括牛肉膏、蛋白胨、琼脂、结晶紫、草酸铵、碘、碘化钾、番红、溴甲酚紫、明胶。

（2）实验仪器：超声波清洗器（KQ3200DE）、紫外-可见分光光度计（UV759）、无菌操作台、高压蒸汽灭菌锅（YXQ-LS-18SI）、生化培养箱（MGC-350HPY-2）、水浴恒温振荡器（SHA-B）、离心机（AK/QC-058）、精密电子天平、冰箱（TCLBC-92B）、光电显微镜、梯度PCR 仪（S1000-96）B4394-4324-1、凝胶成像系统（Gel DOC XR+）A3107-3190、电泳系统（Mini-Protean Tetra）B4393-4323、牛皮纸、培养皿、酒精灯、接种环、棉塞等。

1.3培养基的配置

（1）无机盐培养基（富集筛选培养基）：K₂HPO₄ 0.8g，MgSO₄·7H₂O 0.25g，CaCl₂ 0.03g，KH₂PO₄0.2g，FeSO₄·7H₂O0.09g，pH=7.2 ~ 7.4，121℃高压蒸汽灭菌20 min；

（2）牛肉膏蛋白胨培养基（菌种纯化培养基）：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5g，琼脂18 g，蒸馏水1000 mL，pH=7.2 ~ 7.4，121℃灭菌20 min；

（3）斜面保存培养基：与牛肉膏蛋白胨培养基一致，制作时倒入试管中，倾斜放置，待冷却后即为斜面保存培养基。

（4）休和利夫森二氏（半固体）培养基：蛋白胨5g，NaCl 5g，K₂HPO₄ 0.2g，糖醇(葡萄糖或其它糖、醇)10g，琼脂5~6g，1％溴甲酚紫（溴百里香草酚蓝）3mL，蒸馏水1000mL，pH7.0~7.2，分装试管，培养基高度约4.5cm，115℃灭菌20min。

（5）明胶蛋白胨培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，明胶120g，蒸馏水1000mL，pH 7.2~7.4，115℃灭菌 20min。

（6）西蒙斯氏柠檬酸盐培养基：氯化钠5g，硫酸镁0.2g，磷酸二氢铵1g，磷酸氢二钾1g，柠檬酸钠5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，0.2%溴麝香草酚蓝溶液40mL，pH6.8。

（7）碳源利用培养基：磷酸氢二铵0.5g，磷酸二氢钾1.3g ，磷酸氢二钠3.2g，硫酸钠0.8g，硝酸钠1g，待测物质2-10g，蒸馏水1000mL。将各成分溶于水中，校正pH 7.2，分装，116 ℃ 灭菌15min。

2实验方法

2.1柴油降解菌的富集、分离和纯化

在土柱的7个取样点分别取土样5g，装入含有100 mL无机盐培养基的250 mL锥形瓶中，以浓度为10 mg/mL的柴油为唯一碳源，并以不加土壤的培养液为空白，在130 rpm的转速，30⁰C温度下振荡培养5 d。然后吸取5mL上述培养液接种于新鲜培养基，在相同条件下培养5 d，如此连续富集培养5次。用接种环沾取培养液在牛肉膏蛋白胨培养基平板上划线，观察平板上的菌落挑取形态、颜色一致的菌落进行平板划线分离重复进行多次，直至得到单一的菌株，将纯化菌株于试管斜面培养后保存于4℃冰箱。

2.2柴油降解菌的鉴定

将该菌株接种至牛肉膏蛋白胨琼脂平板上，放在30℃生化培养箱中培养48h后观察菌落形态特征并进行一系列的生理生化实验，并通过分析16SrDNA序列进行分子生物学鉴定，参考《伯杰细菌鉴定手册》、《常见细菌系统鉴定手册》、《分子克隆实验指南》（第三版）及相关文献，最终将菌株鉴定到属。

（1）革兰氏染色

在无菌操作条件下挑取幼龄培养的菌落于干净载玻片涂布均匀，自然风干后在火焰上固定，然后进行革兰氏染色实验：

① 初染：用草酸铵结晶紫染色1min，水洗去掉浮色；

② 媒染：用碘-碘化钾溶液染色1min，倾去多余溶液；

③ 脱色：用中性脱色剂如乙醇或丙酮脱色，革兰氏阴性菌被褪色而成无色，革兰氏阳性菌不被褪色而成紫色；

④ 复染：用番红染液复染1 min。

染色完成后在光学显微镜下，用油镜观察菌体颜色及形态，革兰氏阳性菌仍成紫色，革兰氏阴性菌则呈现红色。

（2）葡萄糖氧化发酵实验

将幼龄菌株穿刺接种到休和利夫森二氏（半固体）培养基中，另外不接种者为空白对照，25℃恒温培养72h后观察，如果产酸指示剂变黄为阳性，如产气而指示剂不变或变蓝（紫）则为阴性。

（3）接触酶实验

将斜面菌种经过24h培养后，用接种环挑取一环涂布于已滴有3%过氧化氢的载玻片上，如若有气泡产生则为阳性，无气泡即为阴性。

（4）氧化酶实验

在干净的培养皿里放一张滤纸，滴上二甲基对苯撑二胺的1%溶液，仅使滤纸湿润即可，不可过湿。用灭菌棒取培养18~24h的菌苔涂抹在湿润的滤纸上，在10秒内呈现红色者为阳性，10~60秒出现红色者为延迟反应，60秒以上出现红色者不计，则视为阴性。

（5）明胶液化实验

将培养24h的菌株穿刺接种在明胶蛋白胨培养基中，以未接种的为空白，在20℃条件下培养2~7d，观察其生长情况和明胶是否被液化。

（6）溶血性实验

将幼龄菌种接种至血平板上在30℃条件下培养24h后观察，如菌落周围出现溶血环则为阳性，反之则为阴性。

（7）柠檬酸利用实验

在西蒙斯氏柠檬酸盐培养基斜面上划线接种，30℃培养3~7d，培养基由黄色变为蓝色，此为阳性；颜色不变者为阴性。

（8）碳源利用实验：将幼龄培养物接种到碳源利用基础培养基中，连续三代移种，生长着为阳性。

（9）柴油降解菌的分子生物学鉴定

本发明采用 16S rDNA 序列分析法，从分子水平上对其进行鉴定，具体操作步骤如下：

①菌种DNA的提取：将纯培养物接种于5mL新鲜配制的牛肉膏蛋白胨培养基上，培养1~2天；将培养物全部转至10mL离心管中，6000rpm室温离心5min，弃去上清液，将离心管倒置于干净的吸水纸上晒干残余液体，加入2.7mLDNA抽提Buffer，充分混匀悬浮菌体后加入20μL 10mg/ml的蛋白酶K，混匀后置于恒温水浴振荡器中37℃下振荡30min（225rpm）；然后加入0.3mL20%SDS，混匀后放入65℃恒温水浴锅中温浴2h，每隔15~20min上下颠倒几次直至裂解完全后室温下离心10min；将上清液转至新的离心管中，加入等体积的氯仿-异戊醇（24:1）抽提10min，然后室温下离心10min，重复操作此过程两到三次；将上清液转至干净的离心管后加入0.6倍体积的异丙醇，混匀后在室温下静置1h，室温离心20min（14000 rpm），收集粗DNA；将粗DNA用70%冰乙醇轻轻刷洗，将刷洗液放在干净工作台上晾干后加入100~200μL无菌超纯水（或TE）溶解DNA 后转至灭菌的1.5mL离心管中，-20℃保存备用。

②DNA纯度和浓度检测：取1μLDNA样品，加水至100μL混匀后采用核酸/蛋白质分析仪于Nucleic Acid程序下测定。

③PCR扩增：本研究采用梯度PCR仪对菌种进行16srDNA 扩增，所采用的反应体系如表2-2所示，并设含有除模板核酸外的所有成分的空白对照，PCR反应体系为：

成分	终浓度	实际用量（μL）
			浓缩反应缓冲液	1×工作浓度	5
dNTP混合物	各0.2mmol/L	1
			Taq DNA聚合物	0.5~1.0U/50μL	0.5
氯化镁	1.5mmol/L	5
			上游引物	1μmol/L	1
下游引物	1μmol/L	1
			模板	10²~10⁵拷贝/50μL	1
无菌水	将反应体积补足至50μL	35.5

PCR反应过程如下：

Figure 2013104901695100002DEST_PATH_IMAGE001

④凝胶电泳检测PCR 产物：制备一块0.8%的琼脂糖凝胶（含GoldviewDNA染料5μL/100mL），取扩增产物5μL与1μlL Loading Buffer混合，点样，5V/cm电泳45min，于UVI凝胶成像系统分析结果。

⑤扩增产物的测序及同源性比较

将PCR产物进行测序，将得到的碱基序列在GenBank等国际核酸序列数据库内进行同源序列搜索（blast search），找出该菌株与数据库中同源性最高的模式菌株或保存于ATCC或DSM等国际菌种保藏中心的菌株。本发明从柴油污染土壤中富集分离筛选出一株以柴油为惟一碳源和能源的柴油降解菌DB，通过进行生理生化反应实验和16SrDNA测序将其归于不动杆菌属；其16SrDNA序列与醋酸钙不动杆菌的同源性达99.8%。

2.3柴油降解菌的影响因子实验

本发明利用单因素实验对影响菌株降解效率的因素进行优化，确定柴油降解菌株的最佳单因素条件，各因素设置水平如下：（1）柴油添加量分别为0.5、1、2、4、8、16g/kg；（2）表面活性剂（十二烷基苯磺酸钠）添加量分别为0、0.5、1、1.5、3、6 mg/g；（3）30%H₂O₂的累计加入量为0、4、8、16、24、32 mL；（4）有机溶剂（甲醇）加入量为0、2、4、6、8、12mL；（5）将各影响因素都设置为优化后的最佳条件，进行降解实验。实验在花盆中进行，每盆装500g上述配置的油污土，调节pH值为7.0，C:N为1.5:1，以2%（重量）的接种量将柴油降解菌（通过种子培养和扩大培养的培养液）接入污染土壤中，定时向土壤中加水保持其含水率为20%，每组实验设置未接菌和叠氮化钠灭菌的土壤两个空白，每个处理重复三次，室温条件下培养62 d。采用紫外分光光法进行测定土壤中残留柴油的含量。

实验结果

菌种降解柴油的最佳条件为：油污土壤中柴油量4g/kg，十二烷基苯磺酸钠6 mg/ g，30%H₂O₂累计加入量16 mL，甲醇2 mL，在最佳条件下菌种降解率为69.82%。

Claims

1.一种新型柴油污染型场地微生物降解菌，其是保藏号为CGMCC NO.7896的醋酸钙不动杆菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.一种权利要求1所述的新型柴油污染型场地微生物降解菌在对柴油污染土壤修复中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：在柴油污染土壤中接种所述的醋酸钙不动杆菌，同时还加入表面活性剂，30%H₂O₂和有机溶剂。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的有机溶剂是甲醇。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述表面活性剂为十二烷基苯磺酸钠。

6.根据权利要求1-5任一项所述的应用，其特征在于：油污土壤中柴油量为2-6g/kg时，所述的醋酸钙不动杆菌的接种量为1-4%。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：油污土壤中柴油量为4g/kg时，所述的醋酸钙不动杆菌的接种量为2%。