CN101691552B

CN101691552B - 一株降解石油烃的菌株及其应用

Info

Publication number: CN101691552B
Application number: CN2009100932024A
Authority: CN
Inventors: 黄艺; 汪杰; 礼晓
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2009-09-15
Filing date: 2009-09-15
Publication date: 2012-05-30
Anticipated expiration: 2029-09-15
Also published as: CN101691552A

Abstract

本发明公开了一株降解石油烃的菌株及其应用。该菌株为柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.)WTS，其保藏编号为CGMCC No.3253。本发明的菌株具有很强的降解石油烃的能力。本发明的菌株、菌剂及其应用方法为我国进行石油污染土壤的生物修复工作提供理论依据，对我国油田地区环境保护工作以及石油运输过程中因泄漏而造成污染的修复工作具有重大意义，加快石油污染生物修复工作的进展，具有重要的经济意义。

Description

一株降解石油烃的菌株及其应用

技术领域

本发明涉及一株降解石油烃的菌株及其应用。

背景技术

石油是一种粘稠易燃的天然存在于地表之下的混合物。从成分上看，是含有多种烃类(正烷烃、支链烷烃、芳烃、脂环烃)及少量其他有机物(硫化物、氮化物、环烷酸类)的复杂混合物。一个典型的石油样品含有不同的烃类化合物可多达200-300中，分子量从16到1000左右。其物理状态包括气态、挥发性液体、高沸点液体以及固体。一般油田利用的原油按化学组成分为石蜡基(烷烃＞70％)；环烷基(环烷烃＞60％)；中间基(烷、环烷、芳烃含量接近)和沥青基(沥青质＞60％)。

随着我国经济的快速发展，石油成为我国的主要能源，需求量在日益增大，油田生产过程中对土壤的污染也日益严重，面积不断扩大。目前全球年产22亿吨石油中80％产自内陆油田。在我国目前已勘探和开发的油田共有400多个，覆盖地区面积达到32万平方千米，可能已有480万平方千米的土壤层石油含量超过安全值。并且，在石油生产以及运输过程中不可避免地会造成含油污泥污染，以至在我国，该行业平均每年生产80万吨含油污泥。

落地原油在重力和毛细作用下容易发生平面扩散，由于其粘度大，粘滞性强，会在短时间内形成小范围的高浓度污染。采油废水在水动力作用下，一般造成深度较大的污染，甚至会造成地下水的污染。土壤的石油类污染多集中在20cm的表层，影响土壤的通透性，直接阻碍植物根系的呼吸与吸收，引起根系腐烂，影响其生长。石油富含的反应基能与无机氮、磷结合并限制硝化作用和脱磷酸作用，从而使土壤有效氮、磷的含量减少，影响作物的营养吸收。石油中所含的多种多环芳烃被认为具有“三致”效应；一些挥发组分能引起人体麻醉、窒息和化学性肺炎等疾病。因此石油污染对土壤生态系统的平衡和人体健康都有很大的危害。

目前石油污染物的净化处理主要有化学、物理和生物三种途径。化学方法主要利用化学萃取剂消除石油污染物。特别是在邮轮或钻井平台发生事故初期是很有效的做法。但是化学萃取剂对于水生生态物种来说大多是有害的，其副作用比石油污染泛滥的直接经济损失还要严重，因此不少国家已经禁止使用这一方法。物理方法是通过一些器械或添加物对石油污染进行吸附收集等，这类装置已经发展了许多类型，去除效果好，但是昂贵的设备费用限制了其广泛使用，且在寒冷的季节效果较低。另外还可以投家一些对石油污染具有一定净化能力、本身对动植物没有损害的物质进行吸附，普遍使用的投加剂为锯末、粉碎的浮石粉和玉米粉等。

生物方法及石油污染生物修复，是指利用微生物及其他生物，将存在于土壤的石油污染物降解成二氧化碳和水或转化为无害物质的工程技术系统。与物理、化学修复相比，生物修复具有非破坏性、经济性和安全性的特点，生物修复被认为是修复污染土壤的最优选择。为了取得高效、彻底的生物修复效果，分离和筛选污染物的高效降解菌是生物修复的必然要求。

发明内容

本发明的一个目的是提供一株可降解石油烃的菌株。

本发明所提供的菌株为柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.)WTS，其保藏编号为CGMCC No.3253。

该菌株WTS已于2009年8月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.3253，分类命名为柠檬酸杆菌(Citrobactersp.)。

本发明的另一个目的是提供一种降解石油烃的菌剂。该菌剂的活性成份为柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.)WTS CGMCC No.3253。

本发明的另一个目的是提供一种降解石油烃的固体菌剂。

本发明所提供的固体菌剂，由柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.)WTS CGMCC No.3253、铵盐、可溶性镁盐和碳源组成，其中碳源、铵盐、可溶性镁盐和柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.)WTS CGMCC No.3253的比例为15-25g碳源∶0.9-1.2g铵盐∶0.02-0.1g可溶性镁盐∶15×10⁹-20×10⁹CFU柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.)WTSCGMCC No.3253；

所述碳源为含油量高的农作物粉碎得到的粉，如大豆粉、蛋白粉、玉米粉和/或花生粉；所述铵盐可为(NH₄)₂HPO₄、NH₄H₂PO₄和/或NH₄Cl；所述可溶性镁盐可为MgCl₂、Mg(NO₃)₂和/或MgSO₄。

菌剂中所用的碳源起到的主要作用是提供菌种发酵的温床，提供碳源和微量元素，其中的大豆粉价格便宜且易获得；无机盐是为了提供细菌发酵所需无机成分，主要提供氮源；镁盐是为酶的合成提供原料。

柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.)WTS CGMCC No.3253或上述任一所述菌剂在降解石油烃中的应用也属于本发明的保护范围。

柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.)WTS CGMCC No.3253或上述任一所述菌剂在生物修复石油污染中的应用也属于本发明的保护范围。

柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.)WTS CGMCC No.3253或上述任一所述菌剂在生物修复石油污染的土壤中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的菌株具有很强的降解石油烃的能力。对柴油降解实验表明，WTS菌株在第2、4、6、8、10天对柴油的降解速率依次为16.57mg*L^-1*d^-1、10.91mg*L^-1*d^-1、8.49mg*L^-1*d^-1、8.53mg*L^-1*d^-1、7.96mg*L^-1*d^-1，在第二天降解速率达到最大。在实验室条件下对污染土壤进行模拟修复研究，实验结果表明，分别在第11天、第25天、第38天、第50天时，菌株对土壤中石油烃降解速率依次为1.816mg*g^-1*d^-1、1.175mg*g^-1*d^-1、0.942mg*g^-1*d^-1、0.759mg*g^-1*d^-1，在11天时达到最大值，高达1.816mg*g^-1*d^-1。污染土壤生物修复实验中，半衰期结果表明，空白对照组的土壤中油降解的半衰期是139天，投加WTS的土壤样品中油降解的半衰期是30天。投加菌的土壤半衰期比自然土壤的半衰期缩短了4倍多。

用加有灭菌柴油的生理盐水富集本发明固体菌剂的实验结果表明，富集后菌液浓度可达1.3×10⁹CFU/ml、2.4×10⁹CFU/ml和1.7×10⁹CFU/ml，说明本发明固体菌剂中菌的活性高，繁殖快。固体菌剂的制备，便于本发明菌株的实际应用，大大减少了实际污染土壤修复工作的复杂度和安全性，具有很大的突破。

因此，本发明的菌株、菌剂及其应用方法为我国进行石油污染土壤的生物修复工作提供理论依据，对我国油田地区环境保护工作以及石油运输过程中因泄漏而造成污染的修复工作具有重大意义，加快石油污染生物修复工作的进展，具有重要的经济意义。

附图说明

图1为扩增16S rDNA基因的产物凝胶电泳图。

图2为菌株WTS系统发育树。

图3为反应体系中柴油含量变化曲线。

图4为柴油降解率的变化曲线。

图5为菌株WTS对石油烃的降解速率。

图6为土壤石油烃含量变化曲线。

图7为土壤中石油烃降解率变化曲线。

图8为菌株对石油烃的降解速率。

图9为空白对照样品土壤含油量变化。

图10为投加WTS的土壤中含油量变化。

图11为柴油降解的标准曲线。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中使用的培养基的组成如下：

LB培养基：蛋白胨1.0g，酵母浸膏0.5g，NaCl 1.0g，蒸馏水100ml。调节pH为7.0。

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，NaCl 0.5g，蒸馏水100ml，调节pH为7.5左右。固体培养基加1.5％琼脂。

MSM培养基：KH₂PO₄ 1.33g，K₂HPO₄·3H₂O 1.75g，NH₄Cl 1.00g，Na₂SO₄ 2.00g，KNO₃ 2.00g，MgSO₄·7H₂O 0.02g，FeSO₄·7H₂O 0.00556g，ZnSO₄·7H₂O 0.0023g，蒸馏水1000ml，调节pH7.5左右。固体培养基加1.5％琼脂。

淀粉培养基：蛋白胨1g，NaCl 0.5g，牛肉膏0.5g，可溶性淀粉0.2g，琼脂1.8g，蒸馏水100ml，调节pH为7.2左右。

葡萄糖蛋白胨培养基(M.R.和V.P.试验)：葡萄糖0.5g，蛋白胨0.5g，K2HPO4 0.5g，蒸馏水100ml。调节pH7.2～7.4。

柠檬酸盐培养基：柠檬酸钠0.2g，K₂HPO₄ 0.05g，NH₄NO₃ 0.2g，琼脂1.8g，蒸馏水100ml，0.04％苯酚红1ml。调节pH6.8～7.0。

蛋白胨水培养基：蛋白胨1g，NaCl 0.5g，蒸馏水100ml。调节pH为7.6。

苯丙氨酸培养基：酵母浸膏0.3g，Na₂HPO₄ 0.1g，DL-苯丙氨酸0.2g，NaCl 0.5g，琼脂1.8g，蒸馏水100ml。调节pH7.0左右。

实施例1、菌株的分离及鉴定

一、分离

土壤来源：选取山东油田的污染土壤样品，此处油田是目前我国石油的主要产区，其石油污染也是最严重的，因而土壤中嗜油菌的含量以及降解能力也应该是很强的。

平板培养富集、筛选嗜油菌：取5.0g石油污染土壤样品接入装有100ml MSM培养基的250ml三角瓶中，于30℃、150r·min^-1条件下在摇床中培养4d；然后取一定量的上层澄清液接入装有100ml新鲜培养基的250ml三角瓶中，30℃、160r·min^-1条件下摇床中培养7d；如此重复3次。用接种环沾取富集培养液于平板上划线；经多次划线纯化后，将纯化菌株接种于平板后保存于冰箱。在此基础上，采用降解柴油实验，进一步对上述纯化菌株进行筛选。

结果得到对柴油具有较高降解能力的菌株，将该菌株命名为WTS。该菌株在柴油培养基介质中生长良好，可以利用柴油为唯一碳源生长；对柴油乳化完全，菌液浓稠；菌落扁平，圆边，变透明，没有突起；培养3天后菌落直径8mm；菌体呈杆状，培养10d后生物除油率为75.11％，高于石油降解菌B01对胜利油田石油类的降解率(25.8％～32.8％)，也高于O-8-3假单胞菌属、海洋细菌SJ-06W、SJ-6及SJ-16A-2对石油类的降解率(40.89％～57.65％)。

二、鉴定

微生物生理生化反应的多样性在自然界产生了两种结果：第一是使自然界的有机分子都有可能得到分解；第二是使不同微生物之间有了互相作用和互相依赖的基础。例如，一种微生物能利用另一种微生物所分解的产物，或者一种微生物的产物可抑制或杀死另一种微生物。所以微生物的生理生化也被作为细菌鉴定和分类的内容。近年来随着分子生物学的发展，利用已经建立起来的基因库来进行细菌菌种的鉴定已经成为一种很成熟的手段。

(一)生理生化鉴定

根据常用的细菌鉴定方法(中国科学院微生物研究所细菌分类组.1978.一般细菌常用鉴定方法[M].北京：科学出版社)进行鉴定，具体如下：

1)细菌表形特征鉴定

利用革兰氏染色法，对纯化的菌株WTS进行染色，观察菌的形态。

2)接触酶的测定

方法如文献(徐金兰，黄廷林，唐智新，等.2007.高效石油降解菌的筛选及石油污染土壤生物修复特性的研究[J].环境科学学报，27(4)：622-628)中所述。具体如下：取一干净的载玻片，在上面滴一滴5％的过氧化氢溶液，挑取培养18～24h的菌苔在过氧化氢溶液中涂抹。若有气泡产生，则为过氧化氢酶阳性反应；无气泡出现，则为过氧化氢酶阴性反应。

3)M.R.试验

方法如文献(王平宇，张树华.2001.硅酸盐细菌的分离及生理生化特性的鉴定[J].南昌航空工业学院学报，15(2)：78-81)中所述。具体如下：将菌株WTS接种于葡萄糖蛋白胨培养基中，30℃下培养4～6天，从第二天起，每天取培养液2ml，加入甲基红试剂。若出现鲜红色，则为阳性反应；出现淡红色，则为弱阳性反应；若为黄色，则是阴性反应。直到第五天仍为阴性，停止。

4)V.P.试验

方法如文献(王平宇，张树华.2001.硅酸盐细菌的分离及生理生化特性的鉴定[J].南昌航空工业学院学报，15(2)：78-81)中所述。具体如下：将菌株WTS接种于葡萄糖蛋白胨培养基中，培养24h后，在培养液中加入40％KOH 10～20滴，再加入等量的α-萘酚溶液，震荡，水浴50℃条件下保温15～30min。若培养液中出现红色，则为阳性反应；没有变化，则为阴性反应。

5)淀粉水解试验

方法如文献(徐金兰，黄廷林，唐智新，等.2007.高效石油降解菌的筛选及石油污染土壤生物修复特性的研究[J].环境科学学报，27(4)：622-628)中所述。具体如下：制备淀粉培养基平板，接种菌株WTS，培养24h以后，打开培养皿，滴加少量碘液，旋转，使碘液均匀平铺于整个平板上。平板呈蓝色，而菌落周围如有无色透明圈出现，说明淀粉已被水解。

6)柠檬酸盐利用试验

方法如文献(钱存柔，黄仪秀.2000.微生物实验教程[M].北京：北京大学出版社，85-96)中所述。具体如下：接种菌株WTS于柠檬酸培养基，培养3～5d，如果该菌能够利用柠檬酸盐，则可生长，并将培养基由原来的淡粉色变为玫瑰色，为阳性反应；不变色，则为阴性反应。

7)吲哚试验

方法如文献(钱存柔，黄仪秀.2000.微生物实验教程[M].北京：北京大学出版社，85-96)中所述。具体如下：将菌株WTS接种于蛋白胨水培养液中，培养24h，在培养液中加入乙醚，充分震荡，使吲哚溶于乙醚中，待形成乙醚层以后，沿管壁加入吲哚试剂10滴。若乙醚层出现玫瑰色，则证明有吲哚产生，为阳性反应。

8)苯丙氨酸脱氢酶试验

方法如文献(钱存柔，黄仪秀.2000.微生物实验教程[M].北京：北京大学出版社，85-96)中所述。具体如下：将菌株WTS接种于苯丙氨酸培养基上，培养24h，在生长比较好的平板上滴加2～3滴FeCl3溶液，自培养基上方留到下方。若呈蓝绿色，则为阳性反应；否则为阴性反应。

生理生化反应鉴定结果如表1所示。

表1、分离菌株的生化特征及鉴定结果

菌株

革兰氏染色

M.R.

V.P.

柠檬酸盐利用

淀粉水解

吲哚

接触酶

苯丙氨酸脱氢酶

WTS

阴性

阳性

能利用

不水解

阳性

阴性

WTS为革兰氏阴性菌，氧化酶试验呈阳性。这可能是由于革兰氏阴性菌细胞外层是脂多糖，而脂多糖是由脂类和多糖组成的复合物，可以为细胞提供一个既亲水又亲油的两亲分子层；这一方面使其细胞与油滴表面接触，使石油烃易于进入细胞，另一方面，能降低水-油界面张力，使柴油变为由细小油滴构成的乳剂，并扩散进入细胞，加速油的降解。

(二)16S rDNA基因片段分析

1.细菌总DNA的提取方法

本实验采用TIANGEN试剂盒对菌体总DNA进行提取，提取过程中所用的试剂有：缓冲液GA、GB、TE；去蛋白液GD；蛋白酶K；漂洗液PW；提取操作步骤如下：

1)取1.5ml经LB培养基过夜培养的菌液，10000rpm离心1min，尽量吸净上清液，收集菌体。

2)向菌体沉淀中加入200μL缓冲液GA，震荡至菌体彻底悬浮。

3)向离心管中加入20μL蛋白酶K溶液，混匀，以出去蛋白质。

4)加入220μL缓冲液GB，震荡15s，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以出去管盖内壁水珠。(注：加入缓冲液GB时有时可能会产生白色沉淀，一般70℃放置会消失，不影响后续实验，如溶液未变清凉，说明细胞破裂不彻底，可能导致提取DNA量少和提取的DNA不纯。)

5)加入220μL无水乙醇，充分震荡混匀15s，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁水珠。

6)将上一步所有溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rmp离心1min，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中。

7)向吸附柱CB3中加入500μL去蛋白液GD(使用前请检查是否已加入无水乙醇)，12000rmp离心1min，倒掉废液，吸附柱放入收集管中。

8)向吸附柱CB3中加入700μL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rmp离心1min，倒掉废液，吸附柱放入收集管中。

9)向吸附柱CB3中加入500μL漂洗液PW，12000rmp离心1min，倒掉废液。

10)吸附柱CB3放回收集管中，12000rmp离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。将吸附柱CB3于室温放置5敏，以彻底晾干残余的漂洗液。(注：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验)

11)将吸附柱CB3放入一个干净的离心管中，向吸附柱膜的中间部位悬空滴加60μL洗脱缓冲液TE，室温放置2～5min，12000rmp离心2min。

12)离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2min，12000rmp离心2min。(洗脱缓冲液的提起最好不少于50μL，体积过小影响回收效率)。

2.16S rDNA基因体外扩增技术

引物设计如下：27F：5’AGAGTTTGATCATGGCTCAG 3’

1492R：5’TACGGTTACCTTGTTACGACTT 3’

PCR反应体系的建立

本实验选用的是TIANGEN的PCR mix loading buffer(包括dNTPs、高保真pfu酶、Mg2+、优化剂、染料等)，反应体系为50μL，方便PCR产物测序，采用的反应体系见表2，

表2、PCR反应体系

体系物质	体积(μL)
		PCR mix loading bufferddH₂O引物27F引物1492RDNA模板总体系	252211150

PCR反应循环温度设定：

95℃预变性 2min

72℃延伸 1min

最后72℃终延伸15min，4℃保存。

3.琼脂糖凝胶电泳检测

4.测序、拼接和对比

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测纯度以后，送到天根生化公司进行双向测序，引物采用27F和1492R。将双向测序的结果在软件Bioedit下进行格式编辑，再通过Vector NTI Suite7软件进行序列拼接。去掉载体或峰形较差的序列，得到该菌株的16S rRNA片段序列。再将拼接序列导入GenBank数据库中，通过BLAST(Basic LocalAlignment Search Tool)进行同源性比较。将序列与Genbank数据库中一些相近的相关菌株的16S rRNA序列一并导入到Bioedit软件中进行编辑。然后再导入到MEGA4.0软件进行系统发育树的构建，采用相邻连接法(Neighbor-Joining method，NJ)及最大复合似然法(Maximum Composite Likelihood，MCL)来构建发育树，并估算进化距离。采用自引导法(Bootstrap)1000次重复取样来评估进化树。

PCR实验结束以后，进行琼脂糖凝胶电泳来检测PCR产物的纯度。结果如图1所示。其结果显示菌株WTS PCR产物长度达到约1500bp，长度足够。而且没有杂质条带出现，适合进行序列测定。

将PCR产物送到天根生化公司进行测序，并经过拼接，得到WTS的16S rRNA的序列，其长度是1425bp(序列表中序列1)，达到分析要求。

在NCBI(National Center for Biotechnology Information)中选取序列相近的菌株，将其16S rRNA序列导入Bioedit软件后，再导入MEGA4.0进行系统发育树的构建，其中关于WTS的系统发育树构建结果如图2所示，分析表明菌株WTS为柠檬酸杆菌(Citrobacter)。

实施例2、菌株的培养及固体菌剂的制备

在很多进行油泥生物修复中，菌体的添加是个很麻烦的步骤，因为向油泥中添加的是菌液，但是菌液最大的缺陷就是不利于转移，即不容易安全快速的把菌体从实验室转移到实际用地。

一、菌剂I的组成及其制备

1、组成：

菌剂I是由大豆粉、WTS菌、(NH₄)₂HPO₄和MgSO₄混合而成的组合物，其中，大豆粉、(NH₄)₂HPO₄、MgSO₄和菌的比例是15g大豆粉∶0.9g(NH₄)₂HPO₄∶0.02g MgSO₄∶15×10⁹CFU菌。

2、菌剂的制备步骤

(1)菌的培养

用LB培养基、在30℃、130rpm的条件下培养WTS菌24-48h，得到对数生长期的WTS菌液；

培养基的组成：蛋白胨1.0g，酵母浸膏0.5g，NaCl 1.0g，蒸馏水100ml，调节pH为7.0左右。

(2)将灭菌的大豆粉与菌液混合(比例是15g大豆粉∶15×10⁹CFU菌)，再向其中加入(NH₄)₂HPO₄((NH₄)₂HPO₄与菌的比例是0.9g(NH₄)₂HPO₄∶15×10⁹CFU菌)和MgSO₄(MgSO₄与菌的比例是0.02g MgSO₄∶15×10⁹CFU菌)，得到混合物；将混合物在室温(30℃)发酵24～48h，发酵是为了让细菌适应混合物的环境，让其生殖产生孢子。30℃烘干，研磨，得到固体菌剂。

二、菌剂II的组成及其制备

1、组成：

菌剂II是由玉米粉、WTS菌、NH₄H₂PO₄和MgCl₂混合而成的组合物，其中，玉米粉、NH₄H₂PO₄、MgCl₂和菌的比例是20g玉米粉∶1.2g NH₄H₂PO₄∶0.05g MgCl₂∶18×10⁹CFU菌。

2、菌剂的制备步骤

(1)菌的培养

同实验一中所述相同。

(2)将灭菌的玉米粉与菌液混合(比例是20g玉米粉∶18×10⁹CFU菌)，再向其中加入NH₄H₂PO₄(NH₄H₂PO₄与菌的比例是1.2g NH₄H₂PO₄∶18×10⁹CFU菌)和MgCl₂(MgCl₂与菌的比例是0.05g MgCl₂∶18×10⁹CFU菌)，得到混合物；将混合物在室温(30℃)发酵24～48h，30℃烘干，研磨，得到固体菌剂。

三、菌剂III的组成及其制备

1、组成：

菌剂III是由花生粉、WTS菌、NH₄Cl和Mg(NO₃)₂混合而成的组合物，其中，花生粉、NH₄Cl、Mg(NO₃)₂和菌的比例是25g花生粉∶1.0g NH₄Cl∶0.04g Mg(NO₃)₂∶20×10⁹CFU菌。

2、菌剂的制备步骤

(1)菌的培养

同实验一中所述相同。

(2)将灭菌的花生粉与菌液混合(比例是25g花生粉∶20×10⁹CFU菌)，再向其中加入NH₄Cl(NH₄Cl与菌的比例是1.0g NH₄Cl∶20×10⁹CFU菌)和Mg(NO₃)₂(Mg(NO₃)₂与菌的比例是0.04g Mg(NO₃)₂∶20×10⁹CFU菌)，得到混合物；将混合物在室温(30℃)发酵24～48h，30℃烘干，研磨，得到固体菌剂。

四、菌剂I、II、III的效果

加有灭菌柴油的生理盐水的组成及各组分含量：NaCl 0.9g，蒸馏水100ml，灭菌柴油0.2ml。

将上述三种固体菌剂分别接种于加有灭菌柴油的生理盐水，在30℃、130rpm的条件下富集培养24～48h，观察菌液浓度。

实验设3次重复，结果取平均数。结果表明，富集菌剂I后得到的菌液浓度平均为1.3×10⁹CFU/ml；集菌剂II后得到的菌液浓度平均为2.4×10⁹CFU/ml；集菌剂III后得到的菌液浓度平均为1.7×10⁹CFU/ml。表明上述三种菌剂的效果好。

实施例3、菌株的应用

一、菌株WTS对柴油的降解

采用红外分光光度法(GB/T16488-1996)来进行菌株降解率的测定。

具体步骤如下：取50ml三角瓶，加入20ml MSM培养液，0.2ml灭菌柴油，以及1ml浓度约为10⁹CFU/ml的新鲜菌液，30℃、150r·min^-1条件下培养10天，每两天测定一次三角瓶中(即反应体系中)柴油含量。测定时，将三角瓶中的液体放入离心机，10000r/min转速离心10min。倒出全部上清液转入125ml分液漏斗中。加3滴1∶1硫酸酸化，少量NaCl作为破乳剂，用5ml精制CCl₄溶液清洗原三角瓶，倒入分液漏斗，同时加入10ml左右精制CCl₄溶液，震荡萃取。下层四氯化碳相经装有无水Na₂SO₄脱水柱除水后，归入25ml比色管中，萃取两次后定容至25ml，取0.5ml重新定容于25ml比色管中。用1cm石英比色管在红外分光光度仪(吉林北光生产，型号JDS-105U)下进行测定，将结果与标准曲线和空白值比较得到降解率。

具体的做法是将测定的结果直接带入标准曲线的公式，计算得到的结果才是实际上的降解率，前者是测定值，后者是计算值，作图还有做对比时，采用的计算值。

标准四氯化碳购自天津化学试剂三厂；

标准曲线的测定：

实验准备：标准四氯化碳，比色管，100ml容量瓶，

实验过程：准确称取10#柴油1.0111g，到100ml容量瓶中，用四氯化碳将其配制成终浓度为10.111g/L的柴油溶液；所述终浓度为柴油在柴油溶液中的浓度。

取10.111g/L的溶液2.5ml，加入到25ml的比色管中，用四氯化碳将其稀释成终浓度为1.0111g/L的柴油溶液，此溶液为标准油。

因为采用一厘米的标准溶液，所以配置的标准溶液浓度要稍微浓度大一些。分别取1.0111g/L的标准油0，0.5，1，2，4，8毫升置入各个25ml的比色皿中，用四氯化碳稀释到刻度，浓度分别是0，20.0222，40.0444，80.0888，160.1776，320.3552mg/L。

将JDS-105U的参数调到适合1厘米比色皿，进行标准曲线的测定，扫描空白以后进行测定，得到标准曲线。

实验设3次重复。测得的标准曲线的结果如图11所示，标准曲线的函数关系式为y＝0.905x-1.214，R²＝0.999.

柴油降解率＝(W₀-W_n)/W₀×100％，W₀为开始实验当天即第0天时反应体系中柴油浓度，W_n为第n天时反应体系中柴油浓度；

菌株对柴油的降解速率：(W₀-W_n)/n，W₀为开始实验当天即第0天时反应体系中柴油浓度，W_n为第n天时反应体系中柴油浓度，n为天数；

空白值(KB)：用水取代菌液进行上述检测，得到的体系中的柴油含量值。

实验设3次重复。

反应体系中柴油含量的测定结果如表3所示。

表3、柴油测量值

	WTS(mg/L)	KB(mg/L)
			2天	71.406	85.843
4天	62.152	85.582
			6天	55.672	81.161
8天	37.725	73.711
			10天	23.481	66.698

反应体系中柴油含量的变化如图3所示，反应体系中柴油降解率的变化如图4所示。由图中我们可以看到，在菌株WTS的作用下，反应体系中柴油的含量逐渐的降低，其降解率逐渐的变大，降解率随时间的延长逐渐增加。加入菌株WTS的反应体系与不加入菌株WTS的反应体系相对比发现，空白反应体系中柴油含量大于加入菌株WTS的反应体系的柴油含量，菌株WTS有较高的石油降解能力。培养10d后菌株WTS的降解率达到75％，远高于不加菌的空白降解率(37％)，表明在降解过程中，发挥主导作用的是菌株WTS。

菌株对柴油的降解速率能反映出该菌株对柴油的降解能力。菌株WTS对柴油的降解速率如图5。WTS菌株在第2、4、6、8、10天的降解速率依次为16.57mg^-1*L^-1*d^-1、10.91mg^-1*L^-1*d^-1、8.49mg^-1*L^-1*d^-1、8.53mg^-1*L^-1*d^-1、7.96mg^-1*L^-1*d^-1，在第二天降解速率达到最大，表明菌株WTS都能迅速的降解石油烃。

二、菌株降解土壤中石油烃

取长庆油田的污染土壤，过筛后混匀，秤取2kg放入圆形瓷盆中。

一共进行了7种不同条件的对比试验：1)不添加菌不翻耕不浇水不加麸皮的空白对照样；2)不添加菌不翻耕不浇水加麸皮的土样；3)不添加菌不翻耕浇水加麸皮的土样；4)不添加菌翻耕浇水加麸皮的土样；5)不添加菌不翻耕浇水不加麸皮的土样；6)不添加菌翻耕浇水不加麸皮的土样；7)添加WTS菌翻耕浇水加麸皮的土样。其中，浇水处理为每隔两天浇一次水，保持土壤含水率在20％左右；翻耕处理为每天翻耕土壤；加麸皮处理为向土壤中加入小麦麸皮，麸皮与土壤的质量比为1∶7；添加菌剂的处理为加菌液，土壤与菌的配比为2000g土壤∶100×10⁹CFU菌。各实验组处理情况如表4所示。

表4、各实验组处理措施

采用红外分光光度法测定土壤中石油烃的含量，方法具体如下：前后一共进行50天的试验，期间一共取5次样品，其时间分别是第1天、第11天、第25天、第38天、第50天。每次取土样2.5g，放入碾钵中，滴加3滴1∶1盐酸，加入适量无水硫酸钠研磨均匀后，倒入50ml玻璃离心管中。用移液管取25ml CCl₄至离心管，盖盖后，放入超声清洗机中进行超声萃取，萃取时间为40min。完毕以后，6000rpm离心，取上层澄清液0.5ml于25ml比色管中，加入CCl₄定容，等待测量。测量得到土壤中石油烃含量，将此结果与空白值相比较得到降解率。

实验设3次重复。

空白值：即编号为1)的空白对照组的值。

土壤中石油烃降解率的计算公式：(W₀-W_n)/W₀，其中W₀是第1天土壤中石油烃浓度，W_n是第n天土壤石油烃浓度。

菌株对土壤中石油烃降解速率的计算公式：(W₀-W_n)/n，其中W₀是第1天土壤中石油烃浓度，W_n是第n天土壤石油烃浓度，n为天数。

下述的图6、图7和图8中，“油泥”表示编号为1)的对照组结果，“WTS”表示编号为7)的实验组结果。

土壤中石油含量变化如图6所示、石油烃降解率的变化如图7所示。由图中我们可以看到，在菌的作用下，土壤中的石油烃含量逐渐降低，其降解率逐渐变大。降解率随着时间的推移逐渐增加。经过50天的修复试验，在菌的作用下，土壤中的石油降解率达到69.0％，远远高于不做任何处理的空白对照组的石油降解率(27.62％)。油泥空白对照组的石油烃含量也会发生变化是由于土壤中原来就含有的土著嗜油菌以及挥发所造成的。

菌株对土壤中石油烃降解速率的结果如图8所示。结果表明，分别在第11天、第25天、第38天、第50天时，菌株对土壤中石油烃降解速率依次为1.816mg*g^-1*d^-1、1.175mg*g^-1*d^-1、0.942mg*g^-1*d^-1、0.759mg*g^-1*d^-1，在11天时达到最大值，高达1.816mg*g^-1*d^-1。

根据美国环境保护局的报告(PrinceM.Bioremediation of petroleum wastefrom the refining of lubricant oils[J].EnvironmentalProgress，1993，12(1)：5-11.)(Jonge H D.Relation between bioavailabilityand fuel oil hydrocarbon composition in contaminated soils[J].Environ SciTechnol，1997，31：771-775)，土壤微生物对石油类污染物的降解遵循一级反应关系，即

\frac{dC}{dt} = - K_{T} C

式中：C为土壤中油含量(mg/g)；K_T为基质去除常数(d^-1)。

由上式可得：

C/C₀＝exp(-K_Tt)

将上式变形为：

ln C＝ln C₀-K_Tt

以时间为横坐标，ln C为纵坐标，对实验点做线性回归，则直线的截距为ln C₀，斜率为K_T。

推导土壤中油的半衰期公式：t_1/2＝ln 2/K_T。

加入菌的样品土壤中含油量随时间变化见图10。其线性回归曲线为y＝-0.023x+3.904，R²＝0.951。基质去除常数是0.023，t_1/2＝30。

不做任何处理的空白对照样品土壤中含油量随时间变化见图9。其线性回归曲线为y＝-0.005x+3.962，R²＝0.843。基质去除常数是0.005，t_1/2＝139。

因此空白对照组的土壤中油降解的半衰期是139天，投加WTS的土壤样品中油降解的半衰期是30天。投加菌剂的土壤半衰期比自然土壤的半衰期缩短了4倍多。判定该菌对石油烃的降解途径应为产生生物表面活性物质乳化烃类，进而对其进行吸收利用。

上述7个组中，土壤中石油烃含量变化的结果如表5所示。显示加入菌剂的实验组在每次检测中，石油烃含量均低于其它各对照组，表明该菌在石油烃降解方面发挥了重要作用。

表5、各处理的土壤中石油烃含量单位是(mg/g)

	油泥1)	浇水5)	浇水翻土6)	浇水翻土麸皮4)	麸皮2)	浇水麸皮3)	WTS7)
								第1天	55.010	55.010	55.010	55.010	55.010	55.010	55.010
第11天	46.939	36.159	47.584	37.063	46.938	46.531	35.029
								第25天	44.171	33.779	41.460	31.356	52.710	50.880	25.623
第38天	44.622	30.897	36.729	25.027	53.784	27.612	19.231
								第50天	39.818	31.973	33.943	20.892	43.099	21.629	17.055

序列表

<110>北京大学

<120>一株降解石油烃的菌株及其应用

<160>1

<210>1

<211>1425

<212>DNA

<213>柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.)

<223>

<400>1

ggcctaccat gcaagtcgaa cggtaacagg aagcagcttg ctgctttgct gacgagtggc 60

ggacgggtga gtaatgtctg ggaaactgcc cgatggaggg ggataactac tggaaacggt 120

agctaatacc gcataatgtc gcaagaccaa agagggggac cttcgggcct cttgccatcg 180

gatgtgccca gatgggatta gcttgttggt gaggtaacgg ctcaccaagg cgacgatccc 240

tagctggtct gagaggatga ccagccacac tggaactgag acacggtcca cactcctacg 300

ggaggcagca gtggggaata ttgcacaatg ggcgcaagcc tgatgcaccc atgccgcgtg 360

tatgaagaag gccttcgggt tgtaaagtac tttcagcggg gaggaagggg ttaaggttaa 420

taaccttagc cattgacgtt acccgcagaa gaagcaccgg ctaactccgt gccagcagcc 480

gcggtaatac ggagggtgca agcgttaatc ggaattactg ggcgtagagc gcacgcaggc 540

ggtctgtcaa gtcggatgtg aaatccccgg gctcaacctg ggaactgcat tcgaaactgg 600

caggcttgag tctcgtagag gggggtagaa ttccaggtgt agcggtgaaa tgcgtagaga 660

tctggaggaa taccggtggc gaaggcggcc ccctggacga agactgacgc tcaggtgcga 720

aagcgtgggg agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgtctat 780

ttggaggttg tgcccttgag gtgtggcttc cggagctaac gcgttaaata gaccgcctgg 840

ggagtacggc cgcaaggtta aaactcaaat gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga 900

gcatgtggtt taattcgatg caacgcgaag aaccttacct ggtcttgaca tccacagaac 960

ttggcagaga tgccttggtg ccttcgggaa ctgtgagaca ggtgctgcat ggctgtcgtc 1020

agctcgtgtt gtgaaatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt atcctttgtt 1080

gccagcggtc cggccgggaa ctcaaaggag actgccagtg ataaactgga ggaaggtggg 1140

gatgacgtca agtcatcatg gcccttacga ccagggctac acacgtgcta caatggcata 1200

tacaaagaga agcgacctcg cgagagcaag cggacctcat aaagtatgtc gtagtccgga 1260

ttggagtctg caactcgact ccatgaagtc ggaatcgcta gtaatcgtgg atcagaatgc 1320

cacggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccatgg gagtgggttg 1380

caaaagaagt aggtagctta accttcggga gggcgcttac cactt 1425

Claims

1.柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.)WTS，其保藏编号为CGMCC No.3253。

2.一种降解石油烃的固体菌剂，由权利要求1中所述柠檬酸杆菌(Citrobactersp.)WTS CGMCC No.3253、铵盐、可溶性镁盐和碳源组成，其中碳源、铵盐、可溶性镁盐和柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.)WTS CGMCC No.3253的比例为15-25g碳源：0.9-1.2g铵盐：0.02-0.1g可溶性镁盐：15×10⁹-20×10⁹CFU柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.)WTS CGMCC No.3253。

3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于：所述碳源为大豆粉、蛋白粉、玉米粉和/或花生粉；所述铵盐为(NH₄)₂HPO₄、NH₄H₂PO₄和/或NH₄Cl；所述可溶性镁盐为MgCl₂、Mg(NO₃)₂和/或MgSO₄。

4.权利要求1中所述菌或权利要求2或3中所述固体菌剂在降解石油烃中的应用。

5.权利要求1中所述菌或权利要求2或3中所述固体菌剂在生物修复石油污染中的应用。

6.权利要求1中所述菌或权利要求2或3中所述固体菌剂在生物修复石油污染的土壤中的应用。