CN103484447A - 一种石油降解酶制剂的制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种石油降解酶制剂的制备方法与应用，制备步骤如下：将降解石油的微生物进行细胞破碎后制备粗酶液，然后粗酶液与载体混合吸附后，经分离、干燥，制得石油降解酶制剂；所述的降解石油的微生物为醋酸钙不动杆菌，菌种保藏号：CGMCC No.3915，保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明还包括制得的石油降解酶制剂在石油降解中的应用。本发明通过将具有降解石油功能的微生物的酶体系通过吸附剂固定后，对受石油污染的土壤进行降解，降解效率显著提高，较微生物降解速度提高30～50倍，稳定性较粗酶液提高15～20倍。

Description

一种石油降解酶制剂的制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种石油降解酶制剂的制备方法与应用，属于环境生物技术领域。

背景技术

由于石油工业的迅速发展，石油泄漏造成的环境污染日益严重，其中对土壤的污染尤为严重，我国每年产生石油污染土壤近10万吨，石油污染土地面积约500万公顷。

目前石油污染土壤的修复方法主要有物化法、电化学法、生物法。物化及电化学法有成本高、修复后会改变土壤的营养结构而不再适宜农作物种植的重大缺陷，而生物修复方法由于其操作简单、费用低、效果好以及无二次污染等已经成为石油污染治理经济有效的方法，也是现在石油污染土壤修复的主要方法。但生物修复法耗时长、修复速率较慢、而且用于污染修复的微生物受到温度、盐度、pH等环境因子的影响从而无法正常生长导致修复效果不佳。

酶制剂是指从生物中提取的具有酶特性的一类物质，最初应用与食品工业，主要作用是催化食品加工过程中各种化学反应，随着酶制剂行业的发展，其应用领域遍及轻工、食品、化工、医药、农业以及能源、环境保护等方面。但该技术往往只是单一酶催化某一底物的反应。虽然也有将复合酶提取后制成酶制剂来进行应用的技术，如在废水处理、治理农药污染等方面的应用，但效果较应用微生物直接处理的效率并没有显著提高。如《扑草净降解酶的固定化及其对受污染土壤的生物强化研究》，南开大学学报，2003年6月，第36卷第2期中所记载的，粗酶液及酶制剂在扑草净降解效率方面与直接利用微生物进行降解的效率相比没有显著的提高，酶制剂的优势仅在于最佳降解条件的拓宽。

中国专利文献CN101914470A（申请号：201010233473.8）公开了一株可降解石油的醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)WG-6及其培养方法与应用,属于微生物技术领域。该菌株2010年6月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号:CGMCC No.3915。该发明还提供由该醋酸钙不动杆菌及其他成分混合制备的高密度菌剂。但该菌剂降解石油时速率仍然较低，无法满足石油污染快速处理的要求。

而石油降解酶制剂应用于石油污染的修复治理中的研究目前还未见报道。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种利用醋酸钙不动杆菌制备石油降解酶制剂的方法与应用，通过利用来源于微生物细胞内的特异性石油降解酶，提高对污染环境中石油的降解效率。

一种石油降解酶制剂的制备方法，步骤如下：将降解石油的微生物进行细胞破碎后制备粗酶液，然后粗酶液与载体混合吸附后，经分离、干燥，制得石油降解酶制剂；

所述的降解石油的微生物为醋酸钙不动杆菌，菌种保藏号：CGMCC No.3915，保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

根据本发明优选的，所述的吸附剂为硅藻土。更优的，所述的硅藻土为经蒸馏水洗涤后烘干处理制得的硅藻土。

根据本发明优选的，所述吸附剂与粗酶液混合的质量体积比为1:2～10，单位为：g/mL。

根据本发明优选的，将降解石油的微生物进行细胞破碎后制备粗酶液的具体步骤为：降解石油的微生物发酵液离心，得菌体；用3～25倍体积的pH6.0的PBS缓冲液重悬菌体；然后进行超声波破碎10～25min，超声功率为200～500W；然后在2～8℃条件下，经6000～10000rpm离心5～10min，取上清，制得粗酶液。经检测，粗酶液的蛋白浓度为2～20mg/ml。

根据本发明优选的，所述的吸附条件为在2～8℃条件下吸附5～12h。

根据本发明优选的，所述的干燥为真空冷冻干燥。

根据本发明优选的，所述的石油降解酶制剂中每克硅藻土固定的蛋白量为5～50mg。

上述石油降解酶制剂在石油降解中的应用。

根据本发明优选的，所述的应用步骤如下：

（1）用pH8.0Tris-HCl缓冲液配制NADH+NADPH混合溶液，NADH+NADPH的总质量浓度为1%，NADH与NADPH质量浓度之比为1:1；

（2）向水体中添加石油净含量质量分数为1/5～1/2的石油降解酶制剂，向水体中添加石油净含量质量分数为1/200～1/1000的步骤（1）制得的NADH+NADPH混合溶液，震荡或搅拌均匀，在15～40℃条件下降解2～5h，即可。

有益效果

1、本发明通过将具有降解石油功能的微生物的酶体系通过吸附剂固定后，对受石油污染的土壤进行降解，降解效率显著提高，较微生物降解速度提高30～50倍，稳定性较粗酶液提高15～20倍；

2、本发明共固定石油烃降解相关的多种酶，而且都能保持较高的活性，固定化后的酶制剂可以将石油彻底降解为CO₂跟H₂O，本发明将多种酶参与的酶系经固定化后，可对污染物进行彻底、快速降解；

3、本发明制得的石油降解酶制剂可应用于被石油污染的水体、土壤修复过程中，具有成本低、效率高的特点，具有显著的经济效益和社会效益。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

微生物来源

实施例1～5中的醋酸钙不动杆菌（Actnetobacter calcoaceticus）的菌种保藏号：CGMCCNo.3915，保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所。

实施例1：粗酶液的制备

步骤如下：

（1）将LB液体培养基中培养的醋酸钙不动杆菌（Actnetobacter calcoaceticus）菌液10000rpm冷冻离心10min，用浓度为0.1M的pH6.0PBS缓冲液冲洗3次，离心收集菌体；

（2）用10倍体积的pH6.0PBS缓冲液重悬步骤（1）制得的菌体，震荡搅匀，在超声功率为500W、超声\间隔时间为5s\5s条件下进行冰浴超声破碎25min，然后在4℃、10000rpm的条件下离心10min，弃沉淀，制得粗酶液；

（3）上述所得的粗酶液用考马斯亮蓝法进行蛋白浓度测定，具体操作步骤为：准确吸取粗酶液0.1mL，然后加入5mL考马斯亮蓝G250试剂，充分震荡混匀，放置5min后，于595nm测定吸光度（蒸馏水为空白对照，操作与样品测定操作相同）。根据A595值，在标准曲线上查出相当于标准蛋白的量，求出样品蛋白浓度。

经检测，制备的粗酶液蛋白浓度为4.27mg/mL。

实施例2粗酶液的制备

如实施例1所述的步骤，不同之处在于，步骤（2）用20倍体积的pH6.0的PBS缓冲液重悬菌体，震荡搅匀，在超声功率为400W、超声\间隔时间为5s\5s条件下进行冰浴超声破碎25min，然后在4℃、10000rpm的条件下离心20min，弃沉淀，制得粗酶液；

经检测，制备的粗酶液蛋白浓度为2.25mg/mL。

实施例3石油降解酶制剂的制备及石油降解

步骤如下：

（1）取市售硅藻土用蒸馏水洗3次，80℃烘干，自然冷却至室温，制得清洗后的硅藻土；

（2）将制得的清洗后的硅藻土与实施例1中制备的粗酶液按1:10（质量/体积，g/ml）的比例混合，4℃条件下间歇震荡固定5h，离心，取沉淀，经真空冷冻干燥制得石油降解酶制剂；在4℃条件下保存备用；

（3）模拟石油降解酶制剂在水中降解石油实验，操作步骤如下：

①于250mL锥形瓶中配制10g/L的石油溶液50mL，添加1g石油降解酶制剂，搅匀，得酶混液；②用pH8.0Tris-HCl缓冲液配制NADH+NADPH混合溶液，NADH+NADPH的总质量浓度为1%，NADH与NADPH质量浓度之比为1:1；③向酶混液中添加NADH-NADPH混合溶液10μL，于摇床中30℃、150rpm条件下反应5h；④在室温（25℃）条件下，锥形瓶中加入50mL二氯甲烷，震荡萃取5min；⑤取下层含石油的二氯甲烷溶液0.5mL于50mL容量瓶中,用二氯甲烷定容至50mL；⑥以二氯甲烷为空白对照，于230nm条件下测定样品的吸收值，然后根据标准曲线计算出样品中石油的含量。

（4）经检测，石油降解酶制剂制备过程中酶活回收率为90%，制备的石油降解酶制剂对石油降解活性为：每克石油降解酶制剂每小时降解石油112mg。

实施例4石油降解酶制剂的制备及石油降解

如实施例3所述的步骤，不同之处在于，步骤（2）将制得的清洗后的硅藻土与实施例1中制备的粗酶液按1:20（质量/体积，g/ml）的比例混合，置于4℃条件下间歇震荡固定6h，离心，取沉淀，经真空冷冻干燥制得石油降解酶制剂；

经检测，石油降解酶制剂制备过程中酶活回收率为41%，制备的石油降解酶制剂对石油降解活性为：每克石油降解酶制剂每小时降解石油166mg。

实施例5石油降解酶制剂的制备及石油降解

如实施例3所述的步骤，不同之处在于，步骤（2）将制得的清洗后的硅藻土与实施例2中制备的粗酶液按1:20（质量/体积）的比例混合，置于4℃条件下间歇震荡固定6h，离心，取沉淀，经真空冷冻干燥制得石油降解酶制剂；

经检测，石油降解酶制剂制备过程中酶活回收率为86%，制备的石油降解酶制剂对石油降解活性为：每克石油降解酶制剂每小时降解石油123mg。

对比例

（1）醋酸钙不动杆菌（Actnetobacter calcoaceticus）CGMCC No.3915菌液降解石油

向含40mL石油溶液（石油质量浓度为5g/L）的250mL锥形瓶中添加1ml醋酸钙不动杆菌（Actnetobacter calcoaceticus）CGMCC No.3915菌液，菌液的菌体浓度10⁹个/ml，30℃、150rpm条件下于摇床上进行石油降解。7d后按实施例3中所述方法测定剩余的石油含量。结果显示，在此条件下石油降解率为24%，即降解速率为0.284mg/h。

（2）利用CGMCC No.3915细胞制备的酶制剂降解石油

取醋酸钙不动杆菌（Actnetobacter calcoaceticus）CGMCC No.3915菌液，菌液的菌体浓度10⁹个/ml，按实施例2中所述方法制备粗酶液，然后按实施例3中所述方法制备石油降解酶制剂，根据粗酶液制备过程中菌体稀释比例计算，取10⁹个细胞制备的酶制剂，添加于含40mL石油溶液（石油质量浓度为10g/L）的250mL锥形瓶中，添加NADH-NADPH混合溶液10μL，于摇床中30℃、150rpm条件下反应5h。2h后按实施例3中所述方法测定剩余的石油含量。结果显示，此条件下石油降解率为26%，即石油降解速率为26mg/h。

结果表明，与醋酸钙不动杆菌（Actnetobacter calcoaceticus）CGMCC No.3915菌液直接降解石油相比，石油降解酶制剂降解石油的速率提高了91倍。

Claims (10)

1.一种石油降解酶制剂的制备方法，其特征在于，步骤如下：将降解石油的微生物进行细胞破碎后制备粗酶液，然后粗酶液与载体混合吸附后，经分离、干燥，制得石油降解酶制剂；

所述的降解石油的微生物为醋酸钙不动杆菌，菌种保藏号：CGMCC No.3915，保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的吸附剂为硅藻土。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的硅藻土为经蒸馏水洗涤后烘干处理制得的硅藻土。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述吸附剂与粗酶液混合的质量体积比为1:2～10，单位为：g/mL。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将降解石油的微生物进行细胞破碎后制备粗酶液的具体步骤为：降解石油的微生物发酵液离心，得菌体；用3～25倍体积的pH6.0的PBS缓冲液重悬菌体；然后进行超声波破碎10～25min，超声功率为200～500W；然后在2～8℃条件下，经6000～10000rpm离心5～10min，取上清，制得粗酶液。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的吸附条件为在2～8℃条件下吸附5～12h。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的干燥为真空冷冻干燥。

8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的石油降解酶制剂中每克硅藻土固定的蛋白量为5～50mg。

9.权利要求1制得的石油降解酶制剂在石油降解中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，步骤如下：

（1）用pH8.0Tris-HCl缓冲液配制NADH+NADPH混合溶液，NADH+NADPH的总质量浓度为1%，NADH与NADPH质量浓度之比为1:1；

（2）向水体中添加石油净含量质量分数为1/5～1/2的石油降解酶制剂，向水体中添加石油净含量质量分数为1/200～1/1000的步骤（1）制得的NADH+NADPH混合溶液，震荡或搅拌均匀，在15～40℃条件下降解2～5h，即可。